仲丁胺膠體金試紙條的制備及使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品安全檢測領域，具體涉及食品中仲丁胺藥物殘留的一種快速膠體金試紙條的制備及使用方法。
【背景技術】
[0002]仲丁胺(2-aminobutane,簡稱2-AB)又名2_氨基丁燒,是一種保護性殺菌劑，對多種真菌有抗菌活性可用作蒜薹、青椒、柑橘、葡萄的貯藏期防腐保鮮劑。2-AB首先在歐洲得到廣泛應用，我國自1976年開始應用。國內外尚未見2-AB致癌和誘變作用的報道，但是。美國已將其對人體健康的危害等級定為三級。并對其應用范圍和最大允許殘留量作了規定，蒸枝、柑橘、蘋果(果肉)的殘留量分別為< 0.009g/kg、0.005g/kg、0.001g/kg。
[0003]仲丁胺食入過多可導致對身體有害。對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道有強烈刺激性。吸入后可因喉、支氣管的痙攣、水腫，化學性肺炎、肺水腫而致死。長時間接觸可引起局部嚴重刺激或灼傷。
[0004]目前對仲丁胺的檢測主要使用氣相和液相色譜分析，這些方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要求也比較高，需要進一步的提純處理才能進行，不利于推廣應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種特異性強，靈敏度高，且操作簡單方便，對樣品經過簡單處理即可檢測的仲丁胺快速試紙半定量檢測方法。
[0006]本發明的目的可通過以下技術方案來實現:
仲丁胺膠體金試紙條檢測方法其技術要點是:試紙的背襯上依次貼有樣品墊和金標墊和硝酸纖維素膜和吸水吸水紙，金標墊上被標記的物質為第二種屬動物蛋白與仲丁胺抗體的混合物；硝酸纖維素膜上包被有仲丁胺檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgGl條作為參考線。在試紙制備時通過調節檢測線和參考線包被物的濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標準物質濃度對應起來，達到半定量檢測。
[0007]所述的檢測用抗原是指仲丁胺與載體物質明膠形成的偶合物，免疫用抗原是指仲丁胺與載體物質是孔血藍蛋白(KLH)形成的偶合物。
[0008]所述的載體物質也可以選用其他大分子物質，如:脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清白蛋
白等，但要求檢測用抗原與免疫用抗原的載體無交叉免疫反應。
[0009]所述的第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物的蛋白，例如，抗體為兔源性，則第二種屬動物蛋白可以是卵清白蛋白、豬血清白蛋白等雞、鴨或其他非兔源性動物蛋白。
[0010]本發明所描述的試紙的各部分處理與功能如下:
背襯:為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。 樣品墊制備:將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH 7.0- 8.4的PBS中約2 min，取出，40°C烘干或其他方式干燥，即作為樣品墊，檢測時起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動。
[0011]金標墊的制備:該部分起固定膠體金標記的抗原或抗體的作用。
[0012]制備步驟包括膠體金溶液的制備、膠體金標記仲丁胺抗體。
[0013]( 1)膠體金溶液的制備:將氯金酸(HAuC14)用超純水配制成1%的溶液。取超純水1000 mL，加熱至沸騰，加入10 mL 1%氯金酸溶液，再次加熱至沸騰。然后加入10 mL 2%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱至出現透明的橙紅色為止，即為膠體金溶液。
[0014](2)膠體金標記仲丁胺抗體:將仲丁胺單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬蛋白分別用PBS (0.01 mol/L，pH 7.0-7.5)溶解稀釋至2_4 mg/mL，每100 mL膠體金溶液加入l-3mL 2-4 mg/mL的仲丁胺抗體和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2 min,用
0.1 mol/L 的 K2C03，調節 pH 至 8.4，震蕩 5 min，加入 11% PEG-10000 2 mL，震蕩 5 min,6000-13000r/min 離心 15 min,除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)復溶，以 8000-15000r/min 離心 15 min,除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)稀釋500-2000倍，產物作為金標仲丁胺抗體。
[0015](3)金標墊處理:將仲丁胺抗原或仲丁胺抗體倒入一槽中，將玻璃纖維或濾紙浸入1 min,取出，室溫干燥后，即作金標墊。
[0016]硝酸纖維素膜制備:用0.8%的戊二醛溶液或0.2%的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30 min，取出，37°C烘干，上邊包被1條不同濃度的仲丁胺檢測用抗原線或仲丁胺抗體線作為檢測線，同時包被1條抗第二種屬動物蛋白的IgG線作為參考線。當膠體金標記部分標記對象為仲丁胺檢測用抗原和第二種屬蛋白時，檢測線則包被仲丁胺抗體。此即為硝酸纖維素膜，該部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。
[0017]吸水紙制備:將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。該部分主要作用在于將移動上來的多余的樣品溶液吸收。
[0018]試紙組裝:在背襯上依次粘貼有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和樣品吸收墊，即成仲丁胺檢測試紙。
[0019]檢測原理:
金標墊標記對象為仲丁胺抗體和第二種屬動物蛋白，樣品中含有仲丁胺，樣品溶液被試紙的樣品墊吸收并通過毛細作用上移到達膠體金標記部分，樣品溶液中的仲丁胺與膠體金標記的仲丁胺抗體反應形成結合物，結合物繼續上移到檢測線，因膠體金標記的仲丁胺抗體只有特定的結合位點，樣品溶液中的仲丁胺與之結合后，檢測線上的檢測用抗原就不能再與膠體金標記的仲丁胺抗體結合，于是檢測線無色，此即為陽性；當樣品中沒有仲丁胺時，膠體金標記的仲丁胺抗體到達檢測線時被檢測用抗原捕獲，則形成肉眼可見的紅色。無論樣品中是否含有仲丁胺，膠體金標記的第二種屬蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
[0020]以上兩種方式的試紙，在試紙制備時通過調節檢測線和參考線包被物濃度，控制檢測時檢測線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標準物質濃度對應起來，即可達到半定量檢測目的。
【附圖說明】
[0021]圖1是仲丁胺膠體金檢測卡外殼及檢測試紙條在外殼內的安置圖，1為檢測卡外殼，其中2為試紙條，3為檢測窗口，4為加樣孔。
[0022]圖2是仲丁胺檢測卡檢測試紙條結構示意圖，其中5為支承背板，6為硝酸纖維素膜，7為金標墊,8為樣品墊,9為吸水紙。
[0023]圖3是檢測試紙條硝酸纖維素膜上顯示印跡帶示意圖，其中10為檢測線，11為參照線。
【具體實施方式】
[0024]仲丁胺檢測卡是在檢測卡外殼1中設置檢測試紙條2，檢測卡外殼1的結構及檢測試紙條2的設置見附圖1，檢測卡外殼1為長條扁平薄殼狀外殼，長70 _，寬20 _，厚5mm,薄殼壁厚1 mm ,由工程塑料制成，檢測卡外殼1由上蓋和下蓋兩半聯接而成，在檢測卡外殼1上蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。檢測試紙條2放置在檢測卡外殼1的下蓋內。
[0025]檢測試紙條2是多層結構的窄條薄片，片長60 mm,片寬約4 mm,厚度小于2.5 _。檢測試紙條2是多層結構:底層是支承背板5,為聚乙烯薄片,厚度約0.5 mm,長60 mm,寬4 mm ;支承背板5中部粘貼硝酸纖維素膜6,硝酸纖維素膜厚0.5 mm,長20 mm,寬4mm。硝酸纖維素膜6上有兩條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖3，兩條顯示印跡中，一條是檢測線10，含仲丁胺偶聯物，另一條是參照線11，含第二種屬動物蛋白的IgG。支承背板5一端上粘貼吸水紙9，另一端粘貼樣品墊8，吸水紙9內端與硝酸纖維素膜6搭接，樣品墊8與硝
纖維素膜6之間則有一段金標墊7,由金標墊7將樣品墊8與硝酸纖維素膜6連接在一起，搭接寬度在1-2 mm。樣品墊8材料為吸水玻璃纖維或聚酯膜。
[0026]使用仲丁胺膠體金檢測卡時，先將待檢測的樣品液(藥物的抽提液稀釋后，直接用于檢測)從加樣孔4中滴入仲丁胺檢測試紙條2的樣品墊8，由于虹作用原理，帶動待檢測的樣品液及膠體金膜7所含的抗仲丁胺單克隆抗體膠體金標記物一起向硝酸纖維素膜6擴散，5-10分鐘內觀察結果。
[0027]檢測卡的主要反應是免疫學的抗原和抗體反應，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標記的抗體，在測試線上與含有仲丁胺蛋白質偶聯物，以及參照線含第二種屬動物蛋白的IgG反應，形成棕紅色條帶。若樣品中相應的待測仲丁胺高于允許值，樣品加入后先與金標墊中的抗體反應，而不會與檢測帶所帶有的仲丁胺蛋白質偶聯物反應，從而不顯色。檢測結果有以下三種:
1.檢測線10和參照線11同時顯現棕紅色印跡，表示檢測結果為陰性，說明被測樣品中不含仲丁胺或含量低于允許值；
3.檢測線10不顯色，參照線11顯現棕紅色印跡，表示檢測結果為陽性，說明被測樣品中仲丁胺含量高于允許值；
4.檢測線10顯現棕紅色印跡，參照線11不顯色，或檢測線10和參照線11均不顯色，表示檢測試紙條失效。
【主權項】
1.仲丁胺的快速檢測試紙條，從加樣端開始依次為樣品墊、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，所述免疫膠體金紙片為包被有膠體金標記的有檢測用仲丁胺抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條作為參照線。2.根據權利要求1所述的仲丁胺膠體金試紙條，其特征在于:仲丁胺檢測用抗原為仲丁胺與小牛血清白蛋白偶聯形成的復合物，所述質控線上包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG。3.根據權利要求2所述的仲丁胺膠體金試紙條，其特征在于:所述的載體物質，為蛋白質、蛋白質片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根據權利要求1所述的仲丁胺膠體金試紙條，其特征在于:所述的第二種屬動物蛋白為非抗體來源動物的蛋白質。
【專利摘要】本發明公開了一種仲丁胺的快速檢測試紙條的制備及其使用方法。本發明的試劑條從加樣端開始依次為：濾樣紙、免疫膠體金紙片、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述免疫膠體金紙片為包被有膠體金標記的抗仲丁胺單克隆抗體的玻璃纖維墊片，所述免疫硝酸纖維素膜為設有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上面包被有檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG？1條作為參照線。本發明具有特異性強、靈敏性高，且操作簡單方便等有益效果。
【IPC分類】G01N33/558
【公開號】CN105301236
【申請號】CN201410359093
【發明人】杜道林, 江振飛, 洪霞
【申請人】江蘇維賽科技生物發展有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年7月25日