定量檢測全血中腦鈉肽的磁微粒化學發光微流控芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用磁微粒化學發光技術和微流控芯片技術實現BNP高靈敏定量檢測的方法，特別公開了一種定量檢測全血中腦鈉肽的磁微粒化學發光微流控芯片，可實現全血中BNP的準確、高靈敏定量檢測，屬于微流控芯片化學發光免疫檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]腦鈉肽是1988年日本學者Tetsuji Sudoh首次從豬腦內分離得到一種具有強力的利鈉、利尿、擴血管和降壓作用的多肽。大量基礎和臨床研究表明，血液中BNP水平在心力衰竭時顯著升高，作為一種新的生物標記物，對心力衰竭的診斷、病程進展的監測、對療效和預后評估有重要價值。
[0003]目前用于臨床檢測的BNP包括BNP和NT-proBNP兩種。兩者雖有相同生物學來源，但生物學效應和臨床意義并不完全相同。心肌細胞受刺激后，產生初始基因產物前BNP前體，該肽的一個信號肽(26個氨基)被立即去除，形成BNP前體(proBNP，108個氨基酸)，然后在內切酶作用下裂解為無生物活性的氮末端B型腦鈉肽(NT-proBNP，76個氨基酸)和有活性的B型腦鈉肽(BNP，32個氨基酸)ο BNP的清除主要通過與清除受體結合，而NT-proBNP主要由腎小球濾過，因此NT-proBNP血濃度受腎功能影響大于BNP。
[0004]BNP和NT-proBNP檢測已經為各醫院和醫師廣泛用于臨床實踐，成為心血管病尤其是心力衰竭診斷十分有用的生物標志物。
[0005]測定BNP的主要方法有化學發光法、免疫比濁法、免疫層析法(試紙條)和熒光芯片法等。化學發光法和免疫比濁法敏感高、準確，但需配套昂貴的大型儀器，檢測時間長，并不適合急性診斷和小樣本檢測。免疫層析法雖簡便快速，但靈敏度低、重復性差，易出現誤判。熒光芯片法隨較免疫層析法準確、靈敏度更高，但由于操作復雜，組分集成差，重復性并不尚。
[0006]中國專利201010139399.3描述了一種納米微球免疫比濁法檢測腦鈉肽試劑盒，采用納米微球增強常規比濁法信號，實現對腦鈉肽進行定量分析。
[0007]中國專利200720140931.7公布了一種腦鈉肽顏色顆粒診斷試紙，采用顏色顆粒對腦鈉肽進行定性檢測。中國專利201310524436.6公開了一種同時檢測人腦鈉膚和N末端腦鈉膚前體的快速定量檢測裝置及檢測方法，采用膠體金免疫層析法配套相應儀器對試紙條進行定量檢測。美國專利US60/576327和60/592202也對膠體金免疫層析檢測進行了論述。但相比于化學發光檢測，吸光度檢測具有靈敏度低、線性范圍窄、重復性差等缺陷。
[0008]中國專利200910077950.3描述了一種檢測腦鈉膚的光學生物傳感器及試劑制備方法，采用毛細溝道，以磁顆粒和量子點分別標記抗體，形成雙抗體夾心法檢測腦鈉肽。雖靈敏度提高了，但試劑組分集成差，操作復雜，重復性并不高。
[0009]針對現有腦鈉肽檢測方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化學發光法利用磁微粒化學發光的優勢，在微流控芯片上集成所有試劑組分，可提供一種腦鈉肽定量檢測的磁微粒化學發光微流控芯片，對BNP進行快速準確定量檢測。
【發明內容】
[0010]本發明要解決的技術問題為針對現有快速診斷方法靈敏度低、重復性差、受干擾明顯，以及現有化學發光配套儀器昂貴、檢測時間長的問題，提供一種定量檢測全血中腦鈉肽的磁微粒化學發光微流控芯片(把除測試樣本外所有組分均集成到芯片內)并配套小型便攜設備，從而實現現場全血樣本中BNP的快速、準確、高靈敏定量檢測。
[0011]為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為:
[0012]一種定量檢測全血中腦鈉肽的磁微粒化學發光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由頂部膠帶(12)、芯片基板⑴和底部膠帶(15)構成，其中芯片基板(11)上過濾區(2)、磁顆粒標記BNP抗體包被區(3)、反應區(5)、清洗區￠)、檢測區(7)、液體釋放通道(8)依次連接；芯片基板(11)上標記BNP抗體存儲池(4)與反應區(5)連接，檢測區
(7)分別與清洗液存儲池(9)和發光基底液存儲池(10)通過液體釋放通道(8)連接，頂部膠帶包含加樣口(13)、發光基底液和清洗液存儲池讓位孔(14);所述磁顆粒標記BNP抗體包被區(3)預封裝包被磁顆粒標記BNP抗體；標記BNP抗體存儲池(4)存儲預封裝酶或發光劑標記BNP抗體；清洗液存儲池(9)和發光基底液存儲池(10)分別存儲預封裝清洗液和發光基底液；所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動或聚集。
[0013]發光基底液存儲池(10)也可以由發光基底液存儲池A(16)和發光基底液存儲池B(17)替代，發光基底液存儲池A(16)和發光基底液存儲池B(17)通過發光液預混合通道
(18)連接。
[0014]具體地，本發明所述磁顆粒標記BNP抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，其中磁顆粒尺寸和磁鐵的磁感應強度對檢測結果有明顯的影響，磁鐵顆粒尺寸為0.1?10 μ m，磁感應強度500?30000高斯。
[0015]優選地，所述磁顆粒標記BNP抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，顆粒尺寸為0.5?3 μ m，磁感應強度為1000?8000高斯。
[0016]具體地，所述酶或發光劑標記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4硼酸緩沖液；所述磁顆粒標記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐溫-20和Proclin300的ρΗ7.4硼酸緩沖液。
[0017]具體地，所述酶或發光劑標記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4磷酸鹽緩沖液；所述磁顆粒標記BNP抗體溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐溫-20、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.4磷酸鹽緩沖液。
[0018]具體地，所述發光基底液包含與酶對應的底物及發光增強液，可合并后注入發光基底液存儲池(10)，或分別注入發光基底液存儲池A (16)和發光基底液存儲池B (17)。
[0019]具體地，所述發光基底液包含發光劑對應的雙氧水溶液和堿性溶液，可合并后注入發光基底液存儲池(10)，或分別注入發光基底液存儲池A(16)和發光基底液存儲池Β(17) ο
[0020]具體地，本發明的芯片配套儀器為小型便攜設備，包含擠壓存儲池，磁鐵移動，發光檢測系統等功能；芯片檢測樣本的體積為10?500 μ 1，優選20?100 μ 1更優選加樣體積為50 μ 10
[0021]本發明提供的定量檢測全血中腦鈉肽的磁微粒化學發光微流控芯片是一種以化學發光為基礎、在微流控芯片上實現腦鈉肽快速、準確、高靈敏檢測的新方法。
[0022]這種方法是將抗BNP抗體修飾酶，抗BNP抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結合磁顆粒富集、化學發光檢測樣本中是否含有BNP，并準確分析其含量。
[0023]本發明腦鈉肽定量檢測的磁微粒化學發光方法及其微流控芯片能夠解決現有化學發光技術中儀器昂貴、檢測時間長的不足和缺陷，解決現有快速診斷方法靈敏度不高、重復性差的不足和缺陷。由于化學發光靈敏度高，其靈敏度是熒光檢測方法的100倍以上。
[0024]本發明中所述酶，包含但不限于過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發光基底液為酶對應的發光底物(如魯米諾或金剛烷)和發光增強液(如苯衍生物等增強劑)，其中發光底物和發光增強液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個發光基底液存儲池(10);但當混合液保質期少于I年時應分開，如圖4所示分別注入發光基底液存儲池A(16)和發光基底液存儲池B (17)，通過預混合通道(18)混合均勻，如圖4所示。本發明一個實施例采用過氧化氫酶。
[0025]本發明所述發光劑，包含但不限于吖啶酯。吖啶酯與發光液作用后，不需酶的催化作用，直接參與發光反應。本發明的一個實施例采用吖啶酯。發光基底液包含H2O2溶液和堿性溶液，可合并成堿性H2O2溶液，注入發光基底液存儲池(10);但當穩定性不好時，H2O2溶液和堿性溶液應分別注入發光基底液存儲池A (16)和發光基底液存儲