一種子宮內膜癌特異性檢測的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于檢測子宮內膜癌的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 子宮內膜癌作為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的 20-30%，在某些歐美國家已居女性生殖道惡性腫瘤首位，嚴重威脅婦女健康。隨著社會發展 和人類平均壽命的延長，內膜癌發病率逐年上升并伴有年輕化趨勢。子宮內膜癌如果能做 到早期診斷，合理治療，其預后一般較好。子宮內膜癌的主要臨床表現為不規則陰道流血， 與卵巢癌等其他腫瘤不同，臨床診斷主要依靠診斷性刮宮，但哺乳期或浸潤型子宮內膜癌 的患者，其子宮壁薄弱，刮宮時可能會造成穿孔，給患者造成傷害。
[0003] CyclophilinA蛋白（CYPA)又稱親環素A(GeneBankNo.NP_066953)，位于胞 質及胞核，具有肽酰脯氨酰順反式異構酶活性，參與蛋白質折疊、裝配與運輸；在細胞內與 環孢素A結合，抑制T細胞活化途徑，表現出免疫抑制作用，此外還參與氧化應激誘導及膽 固醇代謝過程，并發揮細胞因子的功能。現有技術已經報道，通過檢測人親環素A表達水平 來早期診斷子宮內膜癌。因此，檢測人親環素A變得尤為重要。
[0004] 核酸適體(Aptamer,又稱適配體，適配子）是能高親和性、高特異性的結合某種 生物質的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數富集配體系統進化技術 (SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment,SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結合靶標分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適 體的靶標包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質、細胞甚至組織等。核酸適體的分子識別 功能與抗體類似，具有與抗體分子相當甚至更強的靶標識別能力。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種特異結合CYPA的核酸適體及其試劑盒。
[0006] 本發明提供的核酸適體，是序列表的序列1-14所示的單鏈DNA。
[0007] 所述核酸適體與CYPA蛋白具有較好的親和能力。
[0008] 還可將所述核酸適體進行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0009] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種： a) 將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物； b) 將所述核酸適體進行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能 的核酸適體的衍生物； c) 將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功 能的核酸適體的衍生物； d) 將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生 物； e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質后，得到的與所述核酸適體具有 相同功能的核酸適體的衍生物。
[0010] 所述核酸適體可用于制備檢測CYPA的試劑盒。
[0011] 利用本發明的核酸適體，可以捕獲中唾液中的中的CYPA，從而用于相關子宮內膜 癌篩查。利用本發明的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優點。本發明具有 很高的應用價值。
【具體實施方式】
[0012] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0013] 實施例ICYPA蛋白的獲得 將Genbank:NP_066953所示的CYPA基因通過本領域常規的真核表達方式進行表達， 獲得了相應的目的多肽蛋白。
[0014] 實施例2核酸適體的篩選和制備 設計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括個核苷酸的隨機核酸文庫如下： 5 '-ATCGTCACCATGGATACATG(N39)TTGCACAAITGGACAGTTAC-3' ；N39 代表 39 個隨機 核苷酸。
[0015] 將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。75ygRNA 文庫經硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然后與2ugCYPA蛋白，37°C孵育 30min，反應液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L醋酸銨，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉 錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為 模板體外轉錄出RNA適配子庫，篩選共進行11輪。得到了 14個適配子，其序列分別為SEQ IDNO: 1-14所示。具體序列如下所示：
實施例3蛋白結合適配子的性能測定 將適配子分別取2.Oyg，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，純化回收去磷 酸化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標記[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。IOnmol 放射性標記的適配子分別與不同濃度（l_200nM)的CYPA37°C孵育30min，各組反應液經 硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品 平行做兩次測定。計算各個適配子與目的蛋白的解離常數。結果如下：
實施例4所述適配子特異性分析以及穩定性分析 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，COCH蛋白，CYPA蛋白，與14條適配子進行特異性檢測，經過結合試驗發現，這些適配子都不與這些蛋 白相結合，而只與CYPA蛋白結合保持較高的特異性。
[0016] 將所述的適配子，取0. 2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過 RT-PCR檢測，發現三周的放置其結構穩定，沒有被降解。
[0017] 實施例5所述適配子疾病的診斷 取8個子宮內膜癌患者和4個正常人的血液，使用生理鹽水稀釋，獲得目標樣本。
[0018] 將14個偶聯有標記的適配子分別與8個患者以及4個正常人的分泌物混合 30min，通過生物素分離，定量分析其中的CYPA蛋白的含量，通過分析發現，8個子宮內膜癌 患者中CYPA蛋白的含量顯著增加，超過了規定的閾值。達到了子宮內膜癌的診斷標準。由 此可見，其診斷效果較好。
[0019] 以上僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人 員來說，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本 發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于子宮內膜癌檢測的試劑盒，其含有能特異性與CYPA蛋白特異性結合的核 酸適體。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸適體的序列如SEQIDNo:1-14 任一所述。3. -種檢測子宮內膜癌的方法，其特征在于利用權利要求1所述的試劑盒。
【專利摘要】本發明公開了一種特異檢測子宮內膜癌的試劑盒。本發明提供的核酸適體，與人Cyclophilin？A蛋白具有較好的親和能力。利用本發明的核酸適體，可以捕獲血液中的Cyclophilin？A蛋白，通過其含量的變化來檢測子宮內膜癌，將其制備成為相應的試劑盒，將用于子宮內膜癌的篩查。利用本發明的試劑盒，具有高靈敏、成本低的好處。
【IPC分類】G01N33/574
【公開號】CN105223358
【申請號】CN201510807002
【發明人】李靜
【申請人】李靜
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年11月22日