樣本中的血紅蛋白A1c的免疫測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及樣本中的血紅蛋白Alc的免疫測定方法。
【背景技術】
[0002] 血紅蛋白Alc (HbAlc)是具有由2條α鏈與2條β鏈組成的異源四聚體結構的 血紅蛋白（Hb)，其中β鏈的N末端纈氨酸的α氨基是進行了非酶學糖基化的糖化血紅蛋 白。該HbAlc的血中含量反映糖尿病的較長期的血糖控制狀態。所以，測定HbAlc在獲知血 糖控制狀態方面在臨床上極具意義，為了監控糖尿病的治療效果等而進行HbAlc的測定。 之后，糖尿病的診斷基準自2010年7月起被修訂，評估發現HbAlc值在與視網膜病的發病 之間具有一定的關系，從而將HbAlc 6. 1%以上（JDS值）加入糖尿病的判定基準（非專利文 獻1)。進而，自2012年4月起，為了配合世界標準而從6. 1%以上（JDS值）變更為6. 5%以 上（NGSP 值）。
[0003] 近年來，在HbAlc測定中，以檢查中心為中心，由于HPLC法中的大量樣本處理的極 限，利用自動分析儀的免疫測定法的開發得到發展。繼而，還開發了從離心沉降血的血球層 中采集血球，并用樣本稀釋液來制備溶血液的儀器，自動化得到發展。
[0004] 但是，事實上也存在無法進行從而對離心操作或溶血·稀釋等前處理敬而遠之的 設備，若與可以說自動化得到發展的HPLC法相比，對免疫法而言，需要前處理的事實仍舊 沒有改變。例如，即使不進行離心沉降血的稀釋溶血，而對全血樣本進行稀釋溶血來進行測 定，在HbAlc測定中，紅血球中的血紅蛋白是測定對象，存在于紅血球中，但若在采血后將 采血管豎立，則紅血球會發生沉降，從而會如血清樣品那樣，從液面進行采樣時會無法采集 沉降的紅血球。所以，需要在顛倒混和后短時間內進行采樣，或者將針頭探入管底附近進行 采集。此外，已知由于作為HbAlc的特異性位點的β鏈N末端包埋在蛋白質分子的高級結 構中而存在，因此在天然狀態下，并不會與HbAlc特異性的單克隆抗體反應。所以，據此看 來，也需要對HbAlc加入改性劑而使蛋白的高級結構發生改變，或者將β鏈N末端區域用 酶切斷使之成為可與抗體反應的狀態等的前處理。
[0005] 現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本專利第2677753號 非專利文獻 非專利文獻1 :糖尿病53 (6) 450，2010。
【發明內容】
[0006] 發明要解決的問題 本發明的目的在于提供在未對全血試樣進行前處理的情形下可以免疫測定HbAlC的 方法。
[0007] 用于解決問題的方法 本申請發明人進行了深入研究，結果發現：在使膠乳粒子浮游于低滲透壓的緩沖液中 的膠乳試劑中，在未進行前處理的情形下直接添加全血樣本，由此不會受到血紅蛋白大幅 過量存在的不良影響，可產生全血樣本的溶血以及血紅蛋白在膠乳粒子表面的吸附，在沒 有溶血處理、改性處理的情形下也可以利用抗HbAlc抗體來檢測HbAlc，從而完成了本申請 發明。
[0008] 即，本發明提供樣本中的血紅蛋白Alc的免疫測定方法，其包括：使膠乳粒子與未 施行前處理的全血樣本在低滲液中接觸，接著使吸附于膠乳粒子上的血紅蛋白Alc與抗血 紅蛋白Alc抗體接觸。
[0009] 發明效果 根據本發明，例如在使含有膠乳粒子的低滲液與全血樣本接觸的1個步驟中，可以實 現全血的溶血和血紅蛋白在膠乳粒子上的吸附這兩者。以往的HbAlC免疫測定法中需要樣 本的稀釋溶血處理或特別的改性處理，但根據本發明可以省略這類前處理步驟。特別是通 用的自動分析儀中，也存在僅為了樣本稀釋和溶血而使用反應槽（cell)的例子，但根據本 發明則無此需要，因而樣本處理能力顯著提高。除了縮短處理時間之外，還可減少以往在前 處理中所使用的試劑類、試管、芯片等消耗品，抑制醫療廢棄物量和實施成本。
【附圖說明】
[0010] [圖1]是分別對HbAlC標準品溶液（No. 1)、溶血處理完成的全血溶液（No. 2)、和 血漿溶液（No. 3)測定吸光度的結果。考慮分光光度計的性能，測定由通常使用濃度進行了 2倍稀釋的樣品。
[0011] [圖2]是制備2種標準試樣而制作的校準曲線。
[0012] [圖3]是示出血球稀釋溶血樣品、與未實施前處理的全血樣本直接作為全血樣品 進行測定時的反應過程中的吸光度的變化的圖。
[0013] [圖4]是利用在標準品中以不同濃度加入γ球蛋白而制備的標準試樣制作的校 準曲線。
【具體實施方式】
[0014] 本發明的方法的特征在于，在沒有前處理的情形下直接使用采血后的全血。"前處 理"是指使膠乳粒子與樣本接觸前對樣本實施的處理，包括溶血處理和蛋白質改性處理。用 于防止采血后的血液的溶血的m)TA添加或肝素添加不包含在本發明所說的"前處理"中。
[0015] 本發明中所用的低滲液只要是滲透壓低至能夠使全血溶血程度的水性液體，則沒 有特別限定。血液的滲透壓為約280 m0sm/kgH20,因而只要是滲透壓充分低于其(例如100 m0sm/kgH20以下)的液體，則可以用作低滲液。例如，可以使用純水作為低滲液，或者也可以 優選使用以適當濃度(例如〇. 02~0. 2mol/L左右)含有從中性至堿性側緩沖能力為最大的 Good's緩沖液的低滲透壓的緩沖液。作為這種Good's緩沖液的具體例，可舉出以下物質， 但并不受它們限定。 BES [N，N-雙（2-羥基乙基）-2-氨基乙磺酸] MOPS [3-嗎啉代丙磺酸] TES [N-三（羥基甲基）甲基-2-氨基乙磺酸] HEPES [4-(2-羥基乙基）-1-哌嗪乙磺酸] DIPSO [3-[N，N-雙（2-羥基乙基）氨基]-2-羥基-1-丙磺酸] TAPSO [3- (N-三[羥基甲基]甲基氨基）-2-羥基丙磺酸] POPSO [哌嗪-1，4-雙（2-羥基丙磺酸）] HEPPSO [N-(羥基乙基）哌嗪-Ν' -2-羥基丙磺酸] EPPS [3-[4-(2_羥基乙基）-1-哌嗪基]丙磺酸] Tricine [N-[三（羥基甲基）甲基]甘氨酸] Bicine [N，N-雙（2-羥基乙基）甘氨酸] TAPS [N-三（羥基甲基）甲基-3-氨基丙磺酸]。
[0016] 本發明中使用的膠乳粒子是未敏化物，即，是未吸附有抗原等蛋白質的膠乳粒子。 膠乳粒子自身可使用與公知的HbAlc免疫凝集測定試劑盒中所用者相同的那些。
[0017] 本發明的方法中，使未實施前處理的全血樣本與膠乳粒子在低滲液中接觸，使血 紅蛋白（包含通常的血紅蛋白和作為糖化血紅蛋白的HbAlc)吸附于膠乳粒子表面。在全血 樣本中，存在與膠乳粒子量相比為過剩量的血紅蛋白，但由于通常的血紅蛋白與糖化血紅 蛋白HbAlc之間，在未敏化膠乳上的吸附實質上并沒有差別，因而吸附于膠乳粒子表面的 HbAlc量變得直接反映HbAlc在存在于全血樣本中的總Hb量中所占的比率。使用含有膠 乳粒子(粒徑50~200nm、濃度0. 05~0. 2%)的低滲液100~200 μ L的反應體系的情形 中，添加I yL~2 yL左右的全血樣本即可。使全血樣本與膠乳粒子在低滲液中接觸的時 間，若是上述規模的反應體系，則可以為室溫或37°C下1~5分鐘左右。以往的HbAlc免疫 測定法中所用的抗HbAlc抗體是HbAlc特異性的識別β鏈N末端區域的抗體，但該β鏈N 末端區域包埋存在于HbAlc分子的高級結構中，因而為了用抗HbAlc抗體免疫測定HbAlc， 通常也需要樣本的改性處理。然而，若使HbAlc吸附于膠乳，則由于HbAlc的β鏈N末端 區域會露出，因而即使沒有特別的改性處理，也能夠利用抗HbAlc抗體進行免疫測定。
[0018] 接著，使吸附于膠乳粒子上的HbAlc與抗HbAlc抗體接觸，通過免疫測定測定樣本 中的HbAlc。免疫測定的手法自身是該領域中公知的，本發明的方法中可使用任意手法。若 基于反應形式對免疫測定法進行分類，則有夾心法、競爭法、凝集法、免疫層析法、蛋白質印 跡法等，若以標記進行分類，則有放射免疫測定、熒光免疫測定、酶免疫測定（ΕΙΑ)、生物素 免疫測定等，但它們均包含在本發明所說的"免疫測定"中，可以在本發明的方法中采用。本 發明中最優選的免疫測定的手法是凝集法，但由于使含有膠乳粒子的低滲液與未實施溶血 處理的全血樣本接觸、使HbAlc吸附于膠乳粒子表面后，將該反應液連同粒子用作樣品進 行通常的免疫測定，則可以測定HbAlc，因此也可以利用凝集法之外的手法。應予說明，本發 明中，術語"測定"包括定性檢測、定量、半定量。
[0019] 例如，凝集法中，通過使吸附于膠乳粒子的表面的HbAlc與抗HbAlc抗體接觸，利 用抗HbAlc抗體經由HbAlc將膠乳粒子結合、凝集，反應液的濁度增加。通過目視確認反應 液的混濁，由此可以檢測HbAlc的存在(定性檢測）。用自動分析儀等光學測定濁度，也可以 對HbAlc量進行定量。此時，只要準備HbAlc濃度已知的標準試樣進行測定，光學測定各標 準試樣的濁度，對濁度測定值與HbAlc濃度之間的關系進行描點，制作校準曲線即可。通過 將全血樣本的測定值與該校準曲線進行匹配，可以求出全血樣本中的HbAlc量。
[0020] 通過夾心法測定HbAlc時，只要預先使抗Hb抗體(會與包括HbAlc在內的血紅蛋 白整體結合）固定于固相，使含有膠乳粒子的低滲液與全血樣本接觸后的反應液與固相化 抗體反應，洗滌后，與經標記的抗HbAlc抗體反應，洗滌后，基于來自標記的信號測定結合 于固相的標記抗體即可。也可以將抗HbAlc抗體制為固相化抗體使用，將抗Hb抗體制為標 記抗體使用。測定HbAlc濃度已知的標準試樣，對信號強度和HbAlc濃度的關系進行描點， 制作校準曲線，只要將全血樣本的測定值與該校準曲線進行匹配，則可以對全血樣本中的 HbAlc量進行定量。
[0021] 作為夾心法的一例，例如在利用橫向流動方式的免疫層析法來測定HbAlc時，免 疫層析器具可以使用如下所述構成的器具。
[0022] 如硝基纖維素膜那樣的由多孔性原材料構成的基質通常形成為帶狀。在該基質上 設置固定有抗HbAlc單克隆抗體的檢測區，在其上游側(后述的展開液流動方向上的上游 偵D設置點樣了已標記的抗Hb單克隆抗體的標記試劑區。標記試劑區通常由點樣了標記 抗體的多孔性的墊構成。在基質的上游端設置儲藏了展開液的展開液槽。使用酶作為標記 時，將點樣有標記酶的底物的底物區設置于標記試劑區的上游即可。
[0023] 在測定時，將HbAlc吸附于膠乳粒子表面后的反應液連同粒子添加至標記試劑 區。若在添加后破壞展開液槽，則展開液會通過基質的毛細管現象向下游流動。展開液依 次通過基質區和標記試劑區，基質、標記抗體、以及吸附有血紅蛋白的膠乳粒子與展開液一 同流向下游。此時，膠乳粒子表面的血紅蛋白與標記抗Hb抗體通過抗原抗體反應而結合。 該免疫復合體若到達檢測區，則會經由膠乳粒子表面的血紅蛋白之中的HbAlc而使標記抗 體被檢測區的抗HbAlc抗體所捕獲。由于基質也同時流動，因而捕獲了標記抗體的檢測區 會呈