一種同時(shí)檢測(cè)尿液中膀胱癌細(xì)胞、結(jié)石、血細(xì)胞和細(xì)菌的微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞檢測(cè)裝置技術(shù)領(lǐng)域，是基于抗原抗體免疫吸附反應(yīng)原理、微流控技術(shù)和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，用于檢測(cè)人尿液樣本中膀胱癌細(xì)胞的檢測(cè)裝置，并同時(shí)可檢測(cè)尿路感染、尿路出血以及結(jié)石。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，對(duì)有尿路癥狀的初診篩查和對(duì)膀胱癌術(shù)后患者的復(fù)查主要手段有尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查、膀胱鏡檢查和熒光原位雜交(fluorescent insitu hybridizat1n, FISH)技術(shù)。這些手段都存在一定的缺陷:
[0003]1.尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查雖然使用廣泛但是假陽性率較高；
[0004]2.膀胱鏡檢查雖然是臨床檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但屬于有創(chuàng)檢測(cè)，病人需承受很大痛苦；而且腫瘤實(shí)體生長(zhǎng)到一定體積才能準(zhǔn)確檢出，不利于早期診斷；
[0005]3.FISH技術(shù)特異性靈敏性較高，但是檢測(cè)費(fèi)用昂貴，且仍需與鏡檢配合才能確診。
[0006]本發(fā)明就是將抗原抗體免疫吸附反應(yīng)原理和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合，使其能準(zhǔn)確檢測(cè)出尿液樣本中可能出現(xiàn)的膀胱移行上皮癌細(xì)胞、膀胱腺癌細(xì)胞及膀胱鱗癌細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)尿液中的細(xì)菌、結(jié)石和血細(xì)胞，以此作為標(biāo)準(zhǔn)來判斷患者是否患有膀胱癌，以及尿路感染、尿路出血和結(jié)石。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明提供一種新型尿液檢測(cè)微流控芯片，該芯片具有高特異性，高靈敏性，可以實(shí)現(xiàn)僅僅檢測(cè)尿液就可以判斷是否患有膀胱癌和尿路癥狀，是一種廉價(jià)高效的尿液檢測(cè)工具。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]該微流控芯片裝置由兩層結(jié)構(gòu)組成，包括下層的樣品通道層(圖中實(shí)線部分)和上層控制樣品通道開關(guān)的氣動(dòng)微閥層(圖中虛線部分)。下層樣品通道層如圖2所示，由尿液樣本入口 1、尿液樣品主通道2、尿液樣本出口儲(chǔ)液池3組成尿液樣品的通道，其中尿液結(jié)石攔截單元4-1、膀胱移行上皮癌細(xì)胞檢測(cè)單元4-2、膀胱腺癌細(xì)胞檢測(cè)單元4-3、膀胱鱗癌細(xì)胞檢測(cè)單元4-4、血細(xì)胞檢測(cè)單元4-5、細(xì)菌檢測(cè)單元4-6在尿液樣品主通道2上串聯(lián)呈圓對(duì)稱分布。在尿液樣品主通道2外側(cè)，通過上述各檢測(cè)單元注入口分別注入膀胱移行上皮癌細(xì)胞特異抗體5-1、膀胱腺癌細(xì)胞特異抗體5-3、膀胱鱗癌細(xì)胞特異抗體5-5、以及大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌特異性抗體5-9，多余液體通過各自出口流出5-2、5-4、5-6與5-10。尿液樣本從入口流入，沿主通道上依次流經(jīng)各個(gè)檢測(cè)單元，最終通過芯片出口儲(chǔ)液池3流出芯片。
[0010]所述各個(gè)檢測(cè)單元中，尿液結(jié)石攔截單元4-1中設(shè)置有矩形門陣列6-1、6_2，門陣列間距為200 μπι，以攔截尿液樣本中的結(jié)石，如圖3所示；如圖4所示三個(gè)膀胱癌細(xì)胞檢測(cè)單元4-2、4-3、4-4中設(shè)置有圓柱體陣列7-1，圓柱半徑為25 μ m，每一行相鄰圓柱之間圓心間隔100 μm、相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行、圓柱體陣列交錯(cuò)分布，間隔100 μπι ;如圖5所示，血細(xì)胞檢測(cè)單元與細(xì)菌檢測(cè)單元4-5、4-6中設(shè)置有圓柱體陣列7-2，圓柱半徑2.5 μπι，每一行相鄰圓柱之間圓心間隔10 μπκ相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行、圓柱體陣列交錯(cuò)分布，間隔10 μπι。
[0011]上層氣動(dòng)微閥層結(jié)構(gòu)如圖6所示，此氣動(dòng)微閥為常開型下壓氣動(dòng)微閥，由主通道氣動(dòng)微閥8，抗體出入通道氣動(dòng)微閥9組成。
[0012]芯片所有通道和腔室結(jié)構(gòu)采用聚二甲基娃氧燒polydimethylsiloxane，PDMS標(biāo)準(zhǔn)加工方法制作完成，并與潔凈的0.17毫米厚度玻璃片鍵合密封，構(gòu)成玻璃-PDMS型芯片。在三個(gè)膀胱癌檢測(cè)單元4-2、4-3、4-4及細(xì)菌檢測(cè)單元4-6與玻璃片鍵合的區(qū)域使用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)處理玻璃片，使得玻璃片能夠固定特異性抗體。
[0013]本發(fā)明使用微流控芯片作為載體可大大降低檢測(cè)成本，結(jié)合抗原抗體特異性反應(yīng)可大大降低檢測(cè)的假陽性率，無創(chuàng)傷，靈敏度高，有助于膀胱癌的早期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。
【附圖說明】
[0014]圖1微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2下層尿液樣本通道結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖3尿液結(jié)石攔截單元內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖4膀胱癌細(xì)胞檢測(cè)單元內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖5血細(xì)胞檢測(cè)單元與細(xì)菌檢測(cè)單元內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖6上層氣動(dòng)微閥通道結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖中:1尿液樣本入口 ；2尿液樣本主通道；3尿液樣本儲(chǔ)液池及出口 ；4主通道上園對(duì)稱的各個(gè)檢測(cè)單元；5抗體注入通道和出口 ；6矩形攔截陣列；7圓柱體陣列；8主通道氣動(dòng)微閥；9抗體出入通道氣動(dòng)微閥；
[0021]4-1尿液結(jié)石攔截單元；
[0022]4-2膀胱移行上皮癌細(xì)胞檢測(cè)單元；
[0023]4-3膀胱腺癌細(xì)胞檢測(cè)單元；
[0024]4-4膀胱鱗癌細(xì)胞檢測(cè)單元；
[0025]4-5血細(xì)胞檢測(cè)單元；
[0026]4-6細(xì)菌檢測(cè)單元；
[0027]5-1膀胱移行上皮癌細(xì)胞特異抗體；
[0028]5-2膀胱移行上皮癌細(xì)胞特異抗體多余液體出口 ；
[0029]5-3膀胱腺癌細(xì)胞特異抗體；
[0030]5-4膀胱腺癌細(xì)胞特異抗體多余液體出口 ；
[0031]5-5膀胱鱗癌細(xì)胞特異抗體；
[0032]5-6膀胱鱗癌細(xì)胞特異抗體多余液體出口 ；
[0033]5-7血細(xì)胞特異抗體；
[0034]5-8血細(xì)胞特異抗體多余液體出口；
[0035]5-9大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌特異性抗體；
[0036]5-10大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌特異性抗體多余液體出口 ；
[0037]6-1和6-2矩形門陣列；
[0038]7-1和7-2圓柱體陣列。
【具體實(shí)施方式】
[0039]微流控芯片是透明的玻璃-PDMS芯片，具有良好的生物相容性。檢測(cè)的過程如下:首先對(duì)主通道氣動(dòng)微閥8施加高氣壓，主通道氣動(dòng)微閥關(guān)閉，然后通過各檢測(cè)單元抗體注入口注入相應(yīng)特異性抗體，抗體即會(huì)結(jié)合到經(jīng)蛋白微陣列技術(shù)處理的玻璃片上。然后將主通道氣動(dòng)微閥壓力恢復(fù)正常水平，主通道氣動(dòng)微閥打開。接下來，對(duì)抗體出入通道氣動(dòng)微閥9施加高氣壓，抗體出入通道關(guān)閉，保證尿液樣本只流過主通道和各個(gè)檢測(cè)單元。從尿液樣本入口 I注入尿液樣本，經(jīng)過一定時(shí)間后，樣本經(jīng)過各個(gè)檢測(cè)單元流入儲(chǔ)液池出口 3，細(xì)胞或細(xì)菌即可粘附到相應(yīng)的特異抗體包被的檢測(cè)單元。此時(shí)可取芯片在顯微鏡下觀察各個(gè)檢測(cè)單元中是否出現(xiàn)了特異粘附的細(xì)胞或細(xì)菌，即可檢測(cè)尿液樣品中是否有各型膀胱癌細(xì)胞和細(xì)菌。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種同時(shí)檢測(cè)尿液中膀胱癌細(xì)胞、結(jié)石、血細(xì)胞和細(xì)菌的微流控芯片，包括兩層結(jié)構(gòu):下層的樣品通道層和上層控制樣品通道開關(guān)的氣動(dòng)微閥層；其特征是， 下層的樣品通道層由尿液樣本入口(I)、尿液樣品主通道(2)、尿液樣本出口儲(chǔ)液池(3)組成，尿液樣品主通道(2)上各檢測(cè)單元；檢測(cè)單元包括尿液結(jié)石攔截單元(4-1)、膀胱移行上皮癌細(xì)胞檢測(cè)單元(4-2)、膀胱腺癌細(xì)胞檢測(cè)單元(4-3)、膀胱鱗癌細(xì)胞檢測(cè)單元(4-4)、血細(xì)胞檢測(cè)單元(4-5)和細(xì)菌檢測(cè)單元(4-6)，各檢測(cè)單元串聯(lián)且呈圓對(duì)稱分布； 三個(gè)膀胱癌檢測(cè)單元(4-2、4-3、4-4)及細(xì)菌檢測(cè)單元(4-6)與玻璃片鍵合的區(qū)域使用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)處理玻璃片，使得玻璃片能夠固定特異性抗體； 氣動(dòng)微閥層由主通道氣動(dòng)微閥(8)，抗體出入通道氣動(dòng)微閥(9)組成，氣動(dòng)微閥為常開型下壓氣動(dòng)微閥。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是，尿液結(jié)石攔截單元(4-1)中設(shè)置有矩形門陣列(6-1)、(6-2)，門陣列間距為200 μ m。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的的微流控芯片，其特征是，三個(gè)膀胱癌細(xì)胞檢測(cè)單元(4-2、4-3、4-4)中設(shè)置有圓柱體陣列(7-1)，圓柱半徑為25 μπι，每一行相鄰圓柱之間圓心間隔ΙΟΟμπκ相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行、圓柱體陣列交錯(cuò)分布，圓心間隔100 μ m04.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流控芯片，其特征是，血細(xì)胞檢測(cè)單元與細(xì)菌檢測(cè)單元(4-5,4-6)中設(shè)置有圓柱體陣列(7-2)，圓柱半徑2.5 μπι，每一行相鄰圓柱之間圓心間隔10 μm、相鄰兩行圓柱之間圓心所在直線平行、圓柱體陣列交錯(cuò)分布，圓心間隔10 μm。5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的微流控芯片，其特征是，該微流控芯片按照聚二甲基硅氧烷PDMS標(biāo)準(zhǔn)制作，用厚度0.17毫米玻璃片鍵合密封，構(gòu)成玻璃-PDMS型芯片。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流控芯片，其特征是，該微流控芯片按照聚二甲基硅氧烷PDMS標(biāo)準(zhǔn)制作，用厚度0.17毫米玻璃片鍵合密封，構(gòu)成玻璃-PDMS型芯片。
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞檢測(cè)裝置技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)檢測(cè)尿液中膀胱癌細(xì)胞、結(jié)石、血細(xì)胞和細(xì)菌的微流控芯片。其下層的樣品通道層和上層控制樣品通道開關(guān)的氣動(dòng)微閥層；下層的樣品通道層由尿液樣本入口、尿液樣品主通道、尿液樣本出口儲(chǔ)液池組成，尿液樣品主通道上各檢測(cè)單元；檢測(cè)單元包括尿液結(jié)石攔截單元、膀胱移行上皮癌細(xì)胞檢測(cè)單元、膀胱腺癌細(xì)胞檢測(cè)單元、膀胱鱗癌細(xì)胞檢測(cè)單元、血細(xì)胞檢測(cè)單元和細(xì)菌檢測(cè)單元，各檢測(cè)單元串聯(lián)且呈圓對(duì)稱分布。本發(fā)明的芯片具有高特異性，高靈敏性，可以實(shí)現(xiàn)僅僅檢測(cè)尿液就可以判斷是否患有膀胱癌和尿路癥狀，是一種廉價(jià)高效的尿液檢測(cè)工具。
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/574
【公開號(hào)】CN104965082
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510263042
【發(fā)明人】劉波, 李馳宇, 李旺, 耿春陽, 辛嘉龍
【申請(qǐng)人】大連理工大學(xué)
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日