一種免標記膠體金比色法用于銀離子的快速檢測及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境污染物快速檢測領域，涉及一種免標記膠體金比色法用于銀離子的快速檢測及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]銀離子(Ag+)是一類普遍存在的環境污染源，嚴重危害生態環境安全和人體健康。Ag+能在人體的皮膚、眼睛以及粘膜等處聚集，進入人體后能與巰基酶結合，抑制含巰基類酶的活性，同時還能與胺、咪唑、羧酸等多種生理代謝產物相互作用，從而導致各種疾病，以及過量的Ag+會弓丨發肺癌、列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等。傳統的的Ag +檢測方法主要有原子吸收光譜法、原子發射光譜法、原子熒光光譜法、電化學分析方法等，這些方法需要繁瑣的樣品前處理和昂貴的儀器，檢測成本高、費時耗力，需要經驗豐富的操作人員難以實現大批量樣本的現場快速分析。
[0003]Ag+能與核酸序列中的2個胞嘧啶堿基(C)形成C-Ag+-C復合物，利用這一特點可設計富含C堿基的核酸序列，以該核酸序列為分子識別元件，可特異性檢測Ag+。目前報道的以富含C堿基的核酸序列來檢測Ag+的技術大多需要標記，成本較高，操作復雜；而且這些技術需要使用檢測儀器，限制了它們的廣泛應用。因此，迫切需要建立一種無須標記的Ag+檢測技術，并使檢測過程無需檢測儀器，檢測結果直接肉眼可見，方便現場快速檢測。
【發明內容】
[0004]為了解決現有技術的不足，本發明的目的在于建立一種免標記可視化的Ag+快速檢測方法以及檢測試劑盒。
[0005]本發明所采取的技術方案是:
一種銀離子的快速檢測方法，包括如下步驟:
(O以富含C堿基的核酸序列為分子識別元件，加入待檢溶液中，混勻；
(2)加入膠體金，混勻；
(3)加入NaCl，混勻；
(4)觀察顏色變化，當溶液顏色變成紫藍色，表明溶液中有Ag+存在。
[0006]作為方案1:所述富含C堿基的核酸序列在有Ag+存在時，首尾兩段通過C-Ag +-C作用，使該單鏈核酸序列本身互補，形成莖環結構。
[0007]作為其中一個案例，所述富含C堿基的核酸序列如下所示:
5' -CCCAGCCCAGACCCAAAAAACCCTCTCCCCTCCC-3' (SEQ ID N0.1)。
[0008]作為方案2:所述富含C堿基的核酸序列30%以上的堿基為C堿基，在有Ag+存在時，兩條富含C堿基的核酸序列通過C-Ag+-C作用互補形成雙鏈結構。
[0009]作為其中一個案例，所述兩條富含C堿基的核酸序列如下所示:
5' -ACGTCCCAGCCCAGACCCATAT-3' (SEQ ID N0.2)；5' -ATATCCCTCTCCCCTCCCACGT-3' (SEQ ID N0.3)。
[0010]一種用于快速檢測銀離子的試劑盒，其包括以下成分:
(1)富含C堿基的核酸序列:
(2)膠體金；
(3)NaClo
[0011]所述富含C堿基的核酸序列如上所示。
[0012]所述試劑盒中還包括pH8.0的Tris-醋酸緩沖液。
[0013]本發明的有益效果是:
通過膠體金的顏色變化來檢測Ag+，檢測結果直接肉眼可見，無需任何檢測儀器，操作簡單，適于現場快速檢測；無需標記，成本低廉，經濟便宜，響應迅速，不需要專業技術人員，無須培訓即可推廣使用。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明所述的檢測方法的原理圖；
圖2為對不同濃度的Ag+檢測的結果圖；
圖3為特異性實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0016]實施例1
1、一種免標記膠體金比色法用于銀離子的快速檢測試劑盒，包括以下成分:
(1)富含C堿基的核酸序列，如下所示:
5' -CCCAGCCCAGACCCAAAAAACCCTCTCCCCTCCC-3' (SEQ ID N0.1)
(2)膠體金溶液
(3)50mMTris-醋酸緩沖液(pH 8.0)
(4)10 mMNaCl 溶液
2、利用上述試劑盒用于銀離子的快速檢測，步驟如下:
(I)用50 mMTris-醋酸緩沖液(pH 8.0)溶解富含C堿基的核酸序列(10 nM)，再加入不同濃度的Ag+，室溫反應15分鐘。
[0017](2)加入粒徑大小約為15 nM的膠體金溶液，充分混勻，室溫放置10分鐘。
[0018](3)加入10 mM的NaCl溶液，充分混勻，室溫反應15分鐘，觀察顏色變化。
[0019]當沒有Ag+時，單鏈核酸吸附在膠體金表面，對膠體金具有保護作用，防止NaCl引起的膠體金聚集變藍。當有Ag+時，通過C-Ag +-C作用，富含C堿基的核酸序列首尾兩端互補，形成莖環結構，從而無法吸附在膠體金表面，失去了對膠體金的保護作用，在NaCl作用下，膠體金聚集，顏色變藍紫色。通過顏色變化即可達到檢測Ag+的目的。
[0020]3、對不同濃度Ag+的檢測:
配制Ag+標準溶液，濃度分別為5 nM, 50nM，100 nM, I mM和5mM，室溫保存。
[0021]將不同濃度的Ag+溶液分別加到實施例1中所述的反應體系中，充分反應后觀察實驗結果，如圖2所示，5nM的Ag+可產生明顯的藍紫色變化，說明其檢測限為5nM。隨著Ag +濃度的增加，藍紫色強度增加，并逐漸趨于飽和。
[0022]4、特異性實驗:
配制濃度為I mM的不同干擾物標準溶液，分別是Hg2+、Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、和 Cd2+。
[0023]將I mM的不同干擾物標準溶液和50 nMAg+標準溶液分別加到實施例1中所述的反應體系中，充分反應后觀察顏色變化，如圖3所示，I mM的Hg2+、CU2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Co2+、和Cd2+仍然保持紅色，對檢測不產生影響。只有當加入Ag+后才會產生藍紫色變化，這證明該方法對Ag+的檢測具有很好的特異性。
[0024]實施例2
1、一種免標記膠體金比色法用于銀離子的快速檢測試劑盒，包括以下成分:
(I)兩條富含C堿基的核酸序列，如下所示:
5' -ACGTCCCAGCCCAGACCCATAT-3' (SEQ ID N0.2)；
5' -ATATCCCTCTCCCCTCCCACGT-3' (SEQ ID N0.3)。
[0025](2)膠體金溶液
(3)50mMTris-醋酸緩沖液(pH 8.0)
(4)10 mMNaCl 溶液
2、利用上述試劑盒用于銀離子的快速檢測，步驟如下:
(I)用50 mMTris-醋酸緩沖液(pH 8.0)溶解富含C堿基的核酸序列(10 nM)，再加入不同濃度的Ag+，室溫反應15分鐘。
[0026](2)加入粒徑大小約為15 nM的膠體金溶液，充分混勻，室溫放置10分鐘。
[0027](3)加入10 mM的NaCl溶液，充分混勻，室溫反應15分鐘，觀察顏色變化。
[0028]當沒有Ag+時，單鏈核酸吸附在膠體金表面，對膠體金具有保護作用，防止NaCl引起的膠體金聚集變藍。當有Ag+時，通過C-Ag +-C作用，兩條富含C堿基的核酸序列通過C-Ag+-C作用互補形成雙鏈結構，從而無法吸附在膠體金表面，失去了對膠體金的保護作用，在NaCl作用下，膠體金聚集，顏色變藍紫色。通過顏色變化即可達到檢測Ag+的目的。
[0029]以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本發明精神的范圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。
【主權項】
1.一種銀離子的快速檢測方法，包括如下步驟: (1)以富含C堿基的核酸序列為分子識別元件，加入待檢溶液中，混勻； (2)加入膠體金，混勻； (3)加入NaCl，混勻； (4)觀察顏色變化，當溶液顏色變成紫藍色，表明溶液中有Ag+存在。2.根據權利要求1所述的銀離子的快速檢測方法，其特征在于，所述富含C堿基的核酸序列在有Ag+存在時，首尾兩段通過C-Ag+-C作用，使該單鏈核酸序列本身互補，形成莖環結構。3.根據權利要求1所述的銀離子的快速檢測方法，其特征在于，所述富含C堿基的核酸序列30%以上的堿基為C堿基，在有Ag+存在時，兩條富含C堿基的核酸序列通過C-Ag +-C作用互補形成雙鏈結構。4.根據權利要求1-3任一項所述的銀離子的快速檢測方法，其特征在于，所述富含C堿基的核酸序列如下所示:5' -CCCAGCCCAGACCCAAAAAACCCTCTCCCCTCCC-3' (SEQ ID N0.1)。5.根據權利要求1-3任一項所述的銀離子的快速檢測方法，其特征在于，所述兩條富含C堿基的核酸序列如下所示: 5' -ACGTCCCAGCCCAGACCCATAT-3' (SEQ ID N0.2)；5' -ATATCCCTCTCCCCTCCCACGT-3' (SEQ ID N0.3)。6.一種用于快速檢測銀離子的試劑盒，其包括以下成分: (1)富含C堿基的核酸序列: (2)膠體金；(3)NaClo7.根據權利要求6所述的快速檢測銀離子的試劑盒，其特征在于，所述富含C堿基的核酸序列如權利要求2-5任一項所示。8.根據權利要求6所述的快速檢測銀離子的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括PH8.0的Tris-醋酸緩沖液。
【專利摘要】本發明公開一種免標記膠體金比色法用于銀離子的快速檢測及檢測試劑盒。以富含C堿基的核酸為分子識別元件，當檢測體系中有銀離子存在時，可與核酸相互作用，形成類似莖環結構形狀，從而失去對膠體金的保護作用，在NaCl的作用，膠體金會聚集，顏色變藍紫色，從而達到檢測銀離子的目的。本發明具有較高的靈敏度，對銀離子的檢測限為5nM，檢測具有很好的特異性，常見的其他干擾重金屬離子對檢測不產生影響。本發明以膠體金為信號報告分子，檢測結果直接肉眼可見，無需使用任何檢測儀器，操作簡單，而且不用任何標記，成本低廉，適于現場快速檢測。
【IPC分類】G01N21/78, G01N33/53
【公開號】CN104965074
【申請號】CN201510283653
【發明人】陳俊華, 周順桂
【申請人】廣東省生態環境與土壤研究所
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年5月28日