一種大豆食品致敏性的檢測評價方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品安全檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]大豆是我國主要的植物性蛋白食物資源，但同時大豆也是8類主要致敏食物之一，目前約有0.5%的世界人口患有大豆過敏癥，此外，隨著大豆食品種類的增多，大豆過敏發病率也在不斷上升。如何開展現有大豆食品中潛在致敏性的評價已成為食品安全領域的一個新興的研宄方向和內容。
[0003]目前國際上對大豆食品致敏性的評價方法分為體內試驗和體外診斷。體內試驗最常用的是皮膚點刺試驗，即將食品中所提取的大豆蛋白注入人體真皮后，在短時間內可引起組織胺等血管活性物質釋放，使受試部位的皮膚產生風團及紅暈反應，借以測定患者是否對大豆過敏。這種方法簡單、易操作、成本低，然而體內實驗準確性低，結果帶有主觀性，并且令患者不便、痛苦。大豆食品致敏性的體外評價主要是血清學和生物信息學方法。血清學評價的原理是利用大豆過敏患者的血清來檢測待評價食品是否具有結合大豆致敏原特異性IgE的能力，但是該試驗的可信度取決于過敏病人的血清數量。生物信息學方法是結合氨基酸序列和結構信息預測蛋白質的潛在致敏性，試驗易出現假陽性。綜上所述，這些評價方法只能局部的反映過敏原的性質，不能很好的模擬人體內的復雜環境。因此，缺乏一種評價大豆食品致敏性最直接的方法。
[0004]在多數情況下，引起人類過敏的食物過敏原可導致某些敏感動物過敏，因此可以通過合適的方式模擬人類過敏反應建立敏感動物的食物過敏原模型，研宄實驗動物對過敏原免疫應答的特異性與敏感性以及相應的檢測指標。這種方法既可彌補單純體外試驗結果與機體不可直接聯系的缺陷，又避免了開展人體試驗所帶來的安全與倫理顧慮，是一種可靠、最直接的過敏原檢測與評價技術。在利用動物實驗評價食物致敏性的研宄中，BALB/c小鼠是最常用的動物模型，這主要是因為其體積小，繁殖周期短，實驗成本低，且與人的免疫機制很相似，現已廣泛用于各種IgE介導的過敏性疾病的分子和細胞機制研宄。
[0005]食物過敏的評價指標有多種，但由于其過敏反應的機制比較復雜，單一的指標并不能反應機體的過敏狀態，實際中需聯合多種指標進行檢測。研宄表明，食物過敏反應導致特異性抗體IgE水平升高，肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺活性物質，肥大細胞經IgE抗體橋聯后還可釋放多種細胞因子如IL4、IL5、IL13、IFNy等。因此我們可以根據動物體內的特異性抗體IgE含量的高低和過敏反應臨床癥狀的強弱，來評價食物過敏原的致敏性強弱。迄今為止，國內尚缺乏一種普遍適用的體外評價大豆食品致敏性的方法。
【發明內容】
[0006]本發明的主要目的在于提供一種大豆食品致敏性的檢測評價方法，以解決現有的評價方法不能準確反映大豆食品中過敏反應的問題。
[0007]本發明所采取的技術方案如下。
[0008](I)用50 mM，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液提取食品中的大豆蛋白，備用。
[0009](2)選取清潔級雌性BALB/c小鼠，體重20±2 g，4_6周齡，自由飲用自來水與進食不含豆柏的飼料，在飼養的第7、14、21、28天，對小鼠灌胃2-10 mg步驟(I)制備的大豆蛋白和10 y g霍亂毒素，使小鼠處于致敏狀態，在飼養的第35天，對小鼠大劑量的灌胃5-25mg步驟(I)制備的大豆蛋白，使小鼠處于過敏狀態。
[0010](3)所述步驟(2)后的30-60 min，檢測并記錄小鼠的致敏臨床癥狀得分。
[0011](4)所述步驟(3)后，對小鼠進行眼眶取血和脫臼致死，取血清，測其特異性抗體IgE含量。
[0012]步驟(3)所述的小鼠致敏臨床癥狀得分:無癥狀，O分；騷耳抓嘴，I分；眼睛嘴巴周圍腫脹，活動緩慢，2分；呼吸急促，嘴巴尾巴周圍出現皮瘆，3分；顫抖，刺激后無反應，4分；死亡，5分。
[0013]與現有的技術相比，本發明的優點是:1、本發明克服了體外試驗只能局部反映過敏原的性質，不能直接顯示其與機體作用結果的缺陷，可直接、準確的評價大豆食品的致敏性。2、本發明能夠全面反映大豆食品的過敏反應能力，可用于評價食品原料及各種加工食品的大豆致敏性，從根本上降低了食品過敏的風險。3、本發明具有費用少、易獲得和易操作的優勢。本發明對于保障大豆過敏人群的攝入安全具有重要價值。
【附圖說明】
[0014]圖1小鼠過敏癥狀得分。標有不同小寫字母表示組間差異性顯著(P〈0.0Do
[0015]圖2小鼠體內特異性抗體IgE水平。標有不同小寫字母表示組間差異性顯著
(P〈0.0Do
【具體實施方式】
[0016]本發明將通過以下具體實施例作進一步說明。
[0017]實施例1。
[0018]—、方法。
[0019]1、大豆蛋白的提取。
[0020]將所得的大豆食品在低溫條件下輔以液氮研磨粉碎，隨后用丙酮脫脂，得到脫脂大豆粉；然后稱取適量的脫脂大豆粉，于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH8.0)中浸提3 h，10, 000 rpm離心20 min取上清液，經過透析除鹽和超濾濃縮后即得大豆蛋白液。
[0021]2、大豆致敏小鼠模型的建立。
[0022](I)選取清潔級雌性BALB/c小鼠，體重20±2 g，4-6周齡，飼養于小鼠籠中，自由飲用自來水與進食不含豆柏的飼料。
[0023](2)在飼養的第7、14、21、28天時，對小鼠灌胃5 mg大豆蛋白，并輔以10 Ug霍亂毒素為佐劑，使動物處于致敏狀態。
[0024](3)在飼養第35天時，對小鼠大劑量的灌胃20 mg大豆蛋白，使小鼠處于過敏狀
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[0025]3、大豆食品過敏反應的檢測。
[0026](I)大劑量灌胃大豆蛋白后的30-60 min內，記錄小鼠的致敏癥狀得分。其中無癥狀，O分；騷耳抓嘴，I分；眼睛嘴巴周圍腫脹，活動緩慢，2分；呼吸急促，嘴巴尾巴周圍出現皮瘆，3分；顫抖，刺激后無反應，4分；死亡，5分。
[0027](2)大劑量灌胃大豆蛋白后的30 min后，摘眼球采血處死小鼠，收集血清用于特異性抗體IgE的檢測。具體實施過程包括以下步驟:
a.抗原包被:用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將大豆蛋白稀釋成濃度為1.0 μ g/mL，每孔加Λ 100 yL，4°C包被過夜。
[0028]b.封阻:次日傾去未包被上的液體，用PBST洗滌三次，拍干。加入280 μ L 3%的明膠，37°C孵育lh?
[0029]c.一抗反應:檢測IgE水平時，小鼠血清用PBS 1:20稀釋。每孔加入100 μ L，37°C孵育 Iho
[0030]d.二抗反應:PBST洗凈后，分別加入以1:6000稀釋的羊抗鼠IgE，每孔100 μ L，37°C孵育 Iho
[0031]e.顯色:二抗孵育結束后PBST洗滌三次，每次5min。加入OPD顯色液100 μ L，37°C恒溫箱中避光顯色15min。
[0032]f.終止:顯色結束后立即加入50 yL 2M H2SO4終止反應。用酶標儀檢測490 nm下的OD值。
[0033]二、結果。
[0034]對已知具有大豆過敏原的食品進行蛋白提取，按照上述建立的致敏性檢測方法進行檢測評價。結果表明，與灌胃PBS的正常對照組小鼠相比較，灌胃含有大豆過敏原的食品的實驗組小鼠均表現出一定程度的過敏臨床癥狀和特異性抗體IgE水平的升高，證明本發明提供的檢測方法的準確性和可靠性。
[0035]過敏臨床表現也是表征過敏反應的一個重要指標。為了對過敏反應的輕重程度進行判斷，采用過敏癥狀得分對此進行評定。小鼠的過敏臨床癥狀得分如圖1所示。從圖中可以看出，空白組的小鼠沒有表現任何異常行為，與刺激前行為幾乎一致。灌胃大豆蛋白的實驗組小鼠中，所有小鼠均出現了不同程度的過敏癥狀，其中4只小鼠在激發30 min內表現為痙攣，刺激后無活力的癥狀；1只小鼠表現出呼吸急促、發抖的行為?’另I只也表現為鼻子身上毛發直立的癥狀。
[0036]食物過敏反應的致敏階段是指過敏原的反復刺激使機體產生特異性的IgE抗體；而當機體再次接觸該過敏原時，結合在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE抗體能激活這些細胞使之發生脫顆粒行為，釋放出組胺、白三烯、肽等活性物質，導致IgE水平升高。小鼠血清中特異性抗體IgE水平如圖2所示。從圖中可以看出，灌胃大豆蛋白的實驗組小鼠產生了高水平的IgE抗體，而空白對照組的小鼠的IgE抗體水平趨于零。
【主權項】
1.一種大豆食品致敏性的檢測評價方法，其特征是包括以下步驟: (1)用50mM，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液提取食品中的大豆蛋白，備用； (2)選取清潔級雌性BALB/c小鼠，體重20±2g，4_6周齡，自由飲用自來水與進食不含豆柏的飼料，在飼養的第7、14、21、28天，對小鼠灌胃2-10 mg步驟(I)制備的大豆蛋白和.10 Ug霍亂毒素，使小鼠處于致敏狀態，在飼養的第35天，對小鼠大劑量的灌胃5-25 mg步驟(I)制備的大豆蛋白，使小鼠處于過敏狀態； (3)所述步驟(2)后的30-60min，檢測并記錄小鼠的致敏臨床癥狀得分； (4)所述步驟(3)后，對小鼠進行眼眶取血和脫白致死，取血清，測其特異性抗體IgE含量; 步驟(3)所述的小鼠致敏臨床癥狀得分:無癥狀，O分；騷耳抓嘴，I分；眼睛嘴巴周圍腫脹，活動緩慢，2分；呼吸急促，嘴巴尾巴周圍出現皮瘆，3分；顫抖，刺激后無反應，4分；死亡，5分。
【專利摘要】一種大豆食品致敏性的檢測評價方法，包括以下步驟：（1）用50mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液提取食品中的大豆蛋白；（2）選取清潔級雌性BALB/c小鼠，體重20±2g，4-6周齡，自由飲用自來水與進食不含豆粕的飼料，在飼養的第7、14、21、28天，對小鼠灌胃2-10mg步驟（1）的大豆蛋白和10μg霍亂毒素，使小鼠處于致敏狀態，在飼養的第35天，對小鼠大劑量的灌胃5-25mg步驟（1）的大豆蛋白，使小鼠處于過敏狀態；（3）30-60min后，檢測并記錄小鼠的致敏臨床癥狀得分；（4）之后，對小鼠進行眼眶取血和脫臼致死，取血清，測其特異性抗體IgE含量。本發明可直接、準確的評價大豆食品的致敏性，全面反映大豆食品的過敏反應能力，具有費用少、易獲得和易操作的特點。
【IPC分類】G01N33/53, G01N33/02
【公開號】CN104965053
【申請號】CN201510380109
【發明人】陳紅兵, 楊慧, 楊安樹, 程友飛, 范臏
【申請人】南昌大學
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月2日