一種黃曲霉毒素b1的免標記可視化檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】—種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測方法及檢測試劑合
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技術領域
[0001]本發明屬于食品安全檢測領域，涉及一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]黃曲霉毒素BI (Aflatoxin BI，AFBl)是真菌的次級代謝產物，屬于真菌毒素，主要由黃曲霉、寄生曲霉以及特曲霉等產生，在發霉的糧油制品中普遍存在，嚴重危害食品安全和人體健康。AFBl具有強烈的毒性和致癌性，是目前化學致癌物中最強的一種致癌誘變劑，其毒性比氰化鉀強10倍。AFBl被國際腫瘤研宄機構列為I類致癌物質。因此對AFBl的快速檢測具有重要意義。傳統的AFBl的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、質譜法等，這些方法需要繁瑣的樣品前處理和昂貴的儀器，檢測成本高、費時耗力，需要經驗豐富的操作人員難以實現大批量樣本的現場快速分析。另一種方法是以抗體來檢測AFB1，但是抗體的制備過程繁瑣，保存麻煩，而且要涉及多次洗滌與分離過程，因而限制了它們的廣泛應用。
【發明內容】
[0003]為了解決現有技術中所存在的不足，本發明旨在以AFBl的核酸適體為分子識別元件，結合膠體金技術，建立一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測方法及檢測試劑盒。
[0004]本發明所采取的技術方案是:
一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測試劑盒，其包括:
(1)黃曲霉毒素BI的核酸適體；
(2)膠體金；
(3)NaClo
[0005]作為優選的，所述黃曲霉毒素BI的核酸適體的核苷酸序列如下所示:
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’ 。
[0006]作為優選的，所示試劑盒中還包括pH 7.4的Tris-HCl緩沖液。
[0007]一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測方法，包括如下步驟:
(I)將膠體金與黃曲霉毒素BI的核酸適體分散于緩沖液中，混勻；
(2 )往步驟(I)混合液中加入待檢樣品，混勻；
(3 )往步驟(2 )混合溶液中加入NaCl，混勻，觀察顏色變化，溶液保持紅色，表明待檢樣品中不含黃曲霉毒素BI，溶液變成藍紫色，表明待檢樣品中含有黃曲霉毒素BI。
[0008]作為優選的，所述黃曲霉毒素BI的核酸適體的核苷酸序列如下所示:
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA -3’ 。
[0009]作為優選的，所述緩沖液為pH 7.4的Tris-HCl緩沖液。
[0010]一種黃曲霉毒素BI的核酸適體，其為如下核苷酸序列所示DNA分子或者是與其互補的核苷酸序列所示的DNA分子:
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’ 。
[0011]本發明的有益效果是:
本發明以AFBl的核酸適體為分子識別元件，通過膠體金的顏色變化來檢測AFBl，檢測結果直接肉眼可見，無需任何檢測儀器；操作簡單，無需抗體，無需任何標記修飾，無需任何洗滌分離過程，適于現場快速檢測；成本低廉，經濟便宜，響應迅速，適于廣泛推廣。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明所述的檢測方法的原理圖；
圖2為對不同濃度的AFBl檢測的結果圖；
圖3為特異性實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0014]實施例1
一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測試劑盒包括以下成分:
(1)AFBl的核酸適體，序列如下:
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’ (SEQ ID N0.1)；
(2)膠體金溶液；
(3)50 mM Tris-HCl 沖液(pH 7.4)；
(4)10 mM NaCl 溶液。
[0015]一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測方法，包括如下步驟:
(1)AFBl核酸適體用50mM Tris-HCl沖液(pH 7.4)溶解，濃度為20 nM ；
(2)加入粒徑大小約為15nM的膠體金溶液，充分混勻，室溫放置15分鐘；
(3)加入待檢樣品，充分混勻，室溫反應30分鐘；
(4)加入10mM的NaCl溶液，充分混勻，室溫反應10分鐘，觀察顏色變化，溶液保持紅色，表明待檢樣品中不含黃曲霉毒素BI，溶液變成藍紫色，表明待檢樣品中含有黃曲霉毒素Bl0
[0016]反應原理為:將AFBl核酸適體與膠體金溶液混合后，AFBl核酸適體吸附在膠體金表面，當待檢樣品中沒有AFBl時，膠體金表面有核酸適體保護，加入NaCl后，溶液仍然保持紅色；當待檢樣品中含有AFBl時，AFBl與核酸適體特異性結合，從而把膠體金表面吸附的核酸適體置換下來，膠體金表面失去了核酸適體的保護，加入NaCl后，膠體金聚集，溶液變成藍紫色，通過顏色變化即可達到檢測AFBl的目的。
[0017]實施例2
對不同濃度AFBl的檢測:
配制 AFBl 標準溶液，濃度分別為 0.1 ng/mL, I ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL,和 200ng/mL，4度保存。
[0018]將不同濃度的AFBl溶液分別加到實施例1中所述的反應體系中，充分反應后觀察實驗結果，如圖2所示，0.1 ng/mL的AFBl可產生明顯的藍色變化，說明其檢測限為0.1 ng/mL。隨著AFBl濃度的增加，藍色強度增加，并逐漸趨于飽和。
[0019]實施例3
特異性實驗:
配制濃度為100 ng/mL的不同干擾物標準溶液，分別是黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G1、赭曲霉素A、玉米烯酮、展青霉素、桔霉素和雜色曲霉素。
[0020]將100 ng/mL的不同干擾物標準溶液和I ng/mL AFBl標準溶液分別加到實施例1所述的反應體系中，充分反應后觀察顏色變化，如圖3所示，100 ng/mL的黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G1、赭曲霉素A、玉米烯酮、展青霉素、桔霉素和雜色曲霉素仍然保持紅色，對檢測不產生影響。只有當加入AFBl后才會產生藍色變化，這證明該方法對AFBl的檢測具有很好的特異性。
[0021]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測試劑盒，其包括: (1)黃曲霉毒素BI的核酸適體； (2)膠體金；(3)NaClo2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述黃曲霉毒素BI的核酸適體的核苷酸序列如下所示:5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’ 。3.根據根據權利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所示試劑盒中還包括pH7.4的Tris-HCl緩沖液。4.一種黃曲霉毒素BI的免標記可視化檢測方法，包括如下步驟: (I)將膠體金與黃曲霉毒素BI的核酸適體分散于緩沖液中，混勻； (2 )往步驟(I)混合液中加入待檢樣品，混勻； (3 )往步驟(2 )混合溶液中加入NaCl，混勻，觀察顏色變化，溶液保持紅色，表明待檢樣品中不含黃曲霉毒素BI，溶液變成藍紫色，表明待檢樣品中含有黃曲霉毒素BI。5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述黃曲霉毒素BI的核酸適體的核苷酸序列如下所示:5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA -3’ 。6.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述緩沖液為pH7.4的Tris-HCl緩沖液。7.黃曲霉毒素BI的核酸適體，其為如下核苷酸序列所示DNA分子或者是與其互補的核苷酸序列所示的DNA分子:5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’ 。
【專利摘要】本發明公開了一種黃曲霉毒素B1的免標記可視化檢測方法及檢測試劑盒。其以黃曲霉毒素B1的核酸適體為分子識別元件，以膠體金為信號報告分子，把核酸適體加入到膠體金溶液中，當有黃曲霉毒素B1存在時，它會與核酸適體相互作用，從而使膠體金失去核酸適體的保護作用，加入NaCl后，檢測體系由紅色變成藍紫色；如果體系中沒有黃曲霉毒素B1，則溶液保持紅色。本發明方法的檢測結果直接肉眼可見，無需任何檢測儀器；操作簡單，無需抗體，無需任何標記修飾，無需任何洗滌分離過程，適于現場快速檢測；成本低廉，經濟便宜，響應迅速，適于廣泛推廣。
【IPC分類】G01N21/78
【公開號】CN104964969
【申請號】CN201510283427
【發明人】陳俊華, 周順桂
【申請人】廣東省生態環境與土壤研究所
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年5月28日