一種熒光探針在過氧化氫分子檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種巧光探針在過氧化氨分子檢測中的應用，屬于分析化學技術領 域。
【背景技術】
[0002] 活性氧（R0S)是生物體內在很多生理和病理過程起著非常重要作用的一些含氧自 由基(哲基自由基和超氧陰離子自由基等)和非自由基(過氧化氨和次氯酸等)的總稱。生物 體內在氧化應激、炎癥等生理和病理情況下通過酶促和非酶促反應產生各種R0S。近代的生 物醫學研究表明，體內產生的R0S與一些疾病的發生、發展和機體的老化有著密切的關系。 過氧化氨（&〇2)作為信號分子參與各種各樣的信號傳導過程，也是氧化應激等相關疾病的 標記物，抵抗病原物的侵害，W及介導細胞死亡等。在細胞內，細胞因子，生長因子和神經遞 質等激活白細胞氧化酶（NADPH氧化酶)，催化細胞周圍環境中的氧生成&〇2。體內適量水平 的&〇2對生物正常的生理過程是有益的，它們參與細胞內蛋白質的可逆氧化，調節蛋白質 的磯酸化到基因表達等細胞過程。然而，體內&〇2濃度的異常變化也與人類的許多疾病密 切相關，例如癌癥，糖尿病，屯、血管疾病和神經系統性疾病。因此，檢測生物體系中&化的產 生與動態變化對于調查研究相關疾病的發生、發展與研究&〇2的功能是非常重要的。
[0003] 然而目前對&〇2的檢測缺少祀向性，不能對細胞內某一特定的細胞器內的過氧化 氨進行檢測，特別缺少對細胞內溶酶體祀向的過氧化氨探針，從而缺少研究細胞病變過程 中對溶酶體中過氧化氨濃度變化情況的檢測工具。
【發明內容】
[0004] 針對目前過氧化氨分子巧光探針檢測所面臨的問題現狀，本發明通過分子設計， 合成出一種具有響應時間快W及溶酶體祀向性的過氧化氨分子巧光探針，簡記為Lys-&化，可W檢測細胞溶酶體中的過氧化氨，與商業化溶酶體紅進行共定位實驗其共定位系數 為 0.94。
[0005] 本發明采用W下技術方案： 一種如式I所示的巧光探針在過氧化氨分子檢測中的應用，其特征在于，所述巧光探 針用于水環境和細胞溶酶體中過氧化氨的含量傳感檢測；所述的傳感檢測包含巧光檢測， 目視定性檢測，細胞成像檢測；
[0006] 上述過氧化氨分子巧光探針的合成路線如下：
上述過氧化氨分子巧光探針的制備方法如下： 1) 將leq的4-漠-1,8-蒙二甲酸酢與leq的N-(2-氨基己基）嗎咐溶于己醇中，氮 氣保護，100°C加熱回流，反應5h，用T化板檢測反應，反應完全后，用己酸己醋萃取，無水硫 酸鋼干燥，旋干，并用硅膠柱進行分離，得到化合物1，其結構式如下：
2) 將leq化合物1，1. 5eq聯棚酸頻哪醇醋與3eq己酸鐘溶于1，4-二氧六環中，再加 入0.leq的雙（二苯基磯基）二茂鐵氯化鈕，氮氣保護，加熱回流，反應10h，用T化板檢測 反應，反應完全后，用己酸己醋萃取，無水硫酸鋼干燥，旋干，并用硅膠柱進行分離，得到目 標探針化合物Lys-Hg化。
[0007] 所述步驟1)中硅膠柱分離洗脫劑配比為甲醇；二氯甲燒=1:40。
[0008] 所述步驟2)中硅膠柱分離洗脫劑配比為己酸己醋甫油離=1: 1。
[0009] 本發明的優點；（1)本發明實現了 &〇2分子探針的選擇性快速檢測，并且選擇性 好，抗其他分子干擾能力強。此外，用肉眼就可W觀察到溶液顏色的變化，伴隨著紫外燈下 同樣可W觀察到巧光顏色變化，是一種具有生色傳感功能的巧光探針。（2)此探針可W應 用于檢測細胞內溶酶體中的過氧化氨的檢測，通過與商業化溶酶體染料進行比較其對溶酶 體內過氧化氨成像的重合率高，兩種染料的共定位系數為0.94,說明此探針可W作為細胞 內溶酶體內過氧化氨檢測探針。基于此探針的特異性且顯著的顏色變化，該試劑也可作為 顯示水溶液中過氧化氨分子存在的專一性指示劑，可進行實時定性及定量的目視比色法檢 巧。。故而，本發明是一種簡單，快速，靈敏的過氧化氨分子特異性檢測試劑，在生物分子檢測 領域具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0010] 圖1是實施例1中探針Lys-H2〇2的電NMR圖譜； 圖2是探針Lys-H2〇2隨過氧化氨的加入巧光譜圖的變化情況； 圖3是探針Lys-H2〇2對不同離子和分子的選擇性巧光譜圖； 圖4是探針Lys-H2化對不同離子和分子的選擇性柱狀圖數據，其中1.空白；2.谷脫 甘膚；3.過氧叔了醇；4.過氧叔了離；5.Mn(V; 6.S2-; 7.畑2畑2; 8.畑3; 9.S〇32-; 10.SO42-; 圖5是探針Lys-H2〇2溶液在過氧化氨加入前后溶液顏色的變化圖； 圖6是探針Lys-H2〇2溶液在過氧化氨加入前后溶液用紫外燈照射后巧光顏色的變化 圖； 圖7是探針Lys-H2〇2檢測外源性過氧化氨巧光成像圖，圖中a)過氧化氨加入前巧光成 像圖，b)探針濃度為5yM加入到Si化細胞中培養30min后明場圖，C)過氧化氨20yM加 入后5min后的綠通道巧光成像圖，d)明場與巧光成像圖重合圖片； 圖8是Lys-H2化巧光探針檢測外源性過氧化氨巧光成像圖與商業化染料溶酶體紅的共 定位成像圖，圖中a)探針濃度為5yM與溶酶體紅加入到Si化細胞中培養30min后明場 圖，b)加入雙氧水后綠通道巧光成像圖，C)商業染料溶酶體紅巧光成像圖，d)明場、綠通 道與紅通道疊加圖，e)綠通道與紅通道疊加圖，f)綠通道與紅通道疊加箭頭部分巧光強 度比較，g)綠通道與紅通道疊加畫圈部分強度散點圖。
【具體實施方式】
[0011] 下面結合具體實施例和附圖對本發明做進一步的詳細說明。
[001引實施例1 1)化合物1的合成：
將4-漠-l，8-蒙二甲酸酢（2.77g，10mmol，leq)與N-(2-氨基己基）嗎咐a.3mg， 10mmol，leq)溶于50血己醇中，氮氣保護，100°C加熱回流，反應5h。用TCL板檢測反應， 反應完全后，用己酸己醋萃取，無水硫酸鋼干燥，濃縮，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小 為200-300目，洗脫劑配比為甲醇/二氯甲燒=1:40,產率為80%。
[001引 2 )化合物Lys-H202的合成：
將化合物 1 (500mg，1.29mmol，leq)，聯棚酸頻哪醇醋（688mg，1.93mmol, 1.5eq) 與己酸鐘（378mg，3. 86mmol, 3eq)溶于20mL1，4-二氧六環中，再加入雙(二苯基磯基） 二茂鐵氯化鈕（94. 4mg，0.013mmol,O.leq)，氮氣保護，加熱回流，反應10h，用TCL板檢 測反應，反應完全后，用己酸己醋萃取，無水硫酸鋼干燥，濃縮，并用硅膠柱進行分離，硅膠 顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為己酸己醋/石油離=1: 1，產率為76%。其核磁譜圖如 圖 1 所示。iH-NMR(400MHz,DMS0) 5 9. 15 (dd, /= 8. 5，1.0Hz, 1H), 8. 59 化 / =7. 3Hz,IH), 8. 33 (d, /= 7. 3Hz,IH), 7.81 (dd, /= 8.4，7.4Hz,IH), 4. 38 (s, 2H), 3.71 (s, 4H), 2.69 (d, / = 43.0Hz, 6H), 1.47 (s,IIH). 實施例2 化合物Lys-H202過氧化氨巧光探針隨過氧化氨加入當量的增加巧光譜圖的變化 取實施例1制備的Lys-H202過氧化氨巧光探針溶于N，N-二甲基甲酯胺（DMF)中，制成Immol/L儲備液。從儲備液中取出30yL加入到5血的離屯、管當中，加入不同當量（0-80 eq)的過氧化氨標準溶液，用PBS緩沖溶液（0.lmol/l，pH=7. 5)與DMF體積比為1:1的溶液 稀釋至3mU測量其巧光性質。，W410nm為激發光，巧光光譜如圖2所示。由圖2可見， 隨著過氧化氨加入當量的增加巧光逐漸增強。
[0014] 實施例3 化合物Lys-H2〇2過氧化氨巧光探針對不同分子或離子的選擇性 從實施例2中巧光探針儲備液中取出30uL加入到5mL的離屯、管當中，分別加入等 摩爾量的競爭分子標準溶液，其中一個加入等摩爾量的過氧化氨標準溶液，30min后W410 nm為激發光檢測溶液的巧光發射光譜變化，由圖3和圖4可W發現，其他金屬離子對化 合物Lys-H2化的巧光幾乎沒有影響，而過氧化氨溶液的加入使化合物Lys-H2化的巧光顯著 增強。
[0015] 實施例4 化合物Lys-H2〇2巧光探針對過氧化氨的可視化檢測 從實施例2中巧光探針儲備液中取出30UL加入到5mL的樣品管當中，加入80摩爾 量的過氧化氨標準溶液，如圖5所示，過氧化氨可W使合物Lys-&化巧光探針的PBS;DMF體 積比為1:1的緩沖溶液發生明顯的顏色變化，溶液顏色從無色變成黃色。伴隨著紫外燈下 肉眼可視的過氧化氨誘導巧光探針發出明亮的黃色巧光（圖6)，說明是一種具有生色傳感 功能的夾光換針。
[001引 實施例5 化合物Lys-H202過氧化氨巧光探針對細胞外源性過氧化氨巧光成像 我們將本發明探針用于SiHa細胞中對外源性的過氧化氨進行巧光成像應用（圖7)。具 體操作步驟如下：將5yMLys-H202過氧化氨探針DMF溶液加入到育有Si化細胞的培養液 中在二氧化碳培養箱中培養30min后用共聚焦顯微鏡進行成像。首先進行明場成像，可W 看到細胞大致的輪廓。然后用藍光進行激發觀察在未加入過氧化氨前的巧光成像情況，此 時觀察不到巧光發射。向體系中加入20yM的過氧化氨水溶液后，等待5min后在用藍光進 行激發可W觀察到有綠光發出，說明此巧光探針可W對外源性的過氧化氨進行巧光成像。 [0017]實施例6 化合物Lys-H2〇2過氧化氨巧光探針對細胞外源性過氧化氨巧光成像與商業溶酶體染 料共定位比較 我們將本發明探針應用于Si化細胞中與商業化的溶酶體染料進行共定位實驗，說明 本探針可W定位到溶酶體中，并對溶酶體內的外源性的過氧化氨進行巧光成像應用（圖8)。 具體操作步驟如下；將5yM Lys-H2〇2過氧化氨探針DMF溶液和商業化溶酶體染料-溶酶 體紅5uM加入到育有Si化細胞的培養液中在二氧化碳培養箱中培養30min后，向體系中 加入20yM的過氧化氨水溶液后，再等待10min后用共聚焦顯微鏡進行成像，此時用藍光 (Ex=488nm)進行激發可W觀察到有綠光發出，此為Lys-H2〇2過氧化氨探針與過氧化氨響 應后發射的光，用綠光（Ex=561nm)進行激發可W觀察到有綠光發出，此為商業化染料溶酶 體紅發出的紅光，用軟件進行處理可W得出兩種染料的共定位系數為0. 94。
【主權項】
1. 一種如式I所示的熒光探針在過氧化氫分子檢測中的應用，其特征在于，所述熒光 探針用于水環境和細胞溶酶體中過氧化氫的含量傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢 測丨_曰細由株始-遍丨-細梅檢測J;
【專利摘要】本發明公開了一種熒光探針在過氧化氫分子檢測中的應用，所述熒光探針用于水環境和細胞溶酶體中過氧化氫的含量傳感檢測；所述的傳感檢測包含熒光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢測。本發明實現了H2O2分子探針的選擇性快速檢測，并且選擇性好，抗其他分子干擾能力強。此外，用肉眼就可以觀察到溶液顏色的變化，伴隨著紫外燈下同樣可以觀察到熒光顏色變化，是一種具有生色傳感功能的熒光探針。此探針可以應用于檢測細胞內溶酶體中的過氧化氫的檢測，通過與商業化溶酶體染料進行比較其對溶酶體內過氧化氫成像的重合率高，兩種染料的共定位系數為0.94。
【IPC分類】G01N21/29, G01N21/64
【公開號】CN104949946
【申請號】CN201510307821
【發明人】林偉英, 任明光, 鄧貝貝
【申請人】濟南大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月8日