一種同時分析4種真菌毒素(don、zea、t-2、ht-2)的免疫親和柱制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫親和柱的制備方法，屬于制備技術。
【背景技術】
[0002]單端孢霉烯類真菌毒素是鐮刀菌毒素中一大族化學性質相關的真菌毒素，對人和家畜的健康有很大的危害，廣泛存在于各種糧食作物和加工產品中，多見于潮濕環境中儲藏的發霉糧食中。經常從受污染的糧食和飼料中被檢出的有4種:T-2毒素、ΗΤ-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ΖΕΑ。對于糧食制品中單端孢霉烯類真菌毒素的測定分析方法主要為色譜法，包括氣相色譜-質譜法(GC-MS)，液相色譜(LC)，液相色譜/質譜(LC-MS)和液相色譜/串聯質譜(LC-MS/MS)等。這些色譜方法檢測的目標分析物含量為微量水平，大多需結合前處理步驟，如固相萃取(SPE)。然而，目前的SPE是基于理化功能的表面保留，除獲得目標分析物外易混有其他基質成分，常規的固相萃取技術的缺點是對目標分析物選擇性低。免疫親和柱則是一種具有高選擇性的高效凈化技術，利用抗原抗體的特異性識別和結合實現單個化合物或一類化合物的選擇性萃取。免疫親和柱操作簡便，可重復使用。但是目前還沒有一種高效的單端孢霉烯類真菌毒素多目標(DON、ΖΕΑ、Τ-2、HT-2)免疫親和柱，同時實現幾種真菌毒素的同時凈化，大大節約時間和成本。
【發明內容】
[0003]本發明提供一種同時分析4種真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱制備方法的制備方法，可以克服上述困難。
[0004]本發明是采用以下技術方案來實現的:一種同時分析4種真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱制備方法的制備方法，它包括抗體的制備和純化、基質制備、配體偶聯、裝柱四個步驟，其特征在于:稱取2g CNBr活化過的Sepharose 4B粉末，于20mLlmmol/L HCl中溶脹，使用lmmol/L HCl洗滌15min，然后用1mL偶聯緩沖液洗滌；隨后，迅速將CNBr活化的Sepharose 4B轉移到抗體溶液中，ImL基質Sepharose 4B與I?5mg DON抗體、0.1?Img T-2、HT-2抗體、0.2?Img ZEA抗體偶聯；將上述混合物4°C靜置過夜，取Sepharose 4B，用8倍基質體積的偶聯緩沖液進行洗滌；轉移基質至pH 8.0的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液中，室溫條件下靜置2h封閉所有殘留的活性基團；為除去偶聯后未偶聯上的多余的抗體，依次用低(0.lmol/L pH 4.0醋酸-醋酸鈉，內含0.5mol/L NaCl的緩沖液)、高(0.lmol/L Tris-HCl，pH 8.0內含0.5mol/L NaCl的緩沖液)兩種pH的緩沖液對基質進行洗滌，至少洗滌3個循環，每種緩沖液的使用量為5倍基質體積，最后用200mL pH7.4的PBS溶液洗滌；采用濕法裝柱，每根柱子裝入ImL凝膠，柱子裝好后，用5倍柱床體積的無菌過濾的0.01 % NaN3-PBS過柱，并使用0.01 % NaN3-PBS保存。
[0005]本發明的優點和積極效果:
[0006]設計新穎，工藝先進，方法獨特，用途廣。不但解決了單端孢霉烯類真菌毒素在傳統富集過程中存在的基質干擾、特異性低、成本高等問題，并且實現多目標同時凈化，特異性強，極大地提高了免疫親和柱的使用效率。本單端孢霉烯類真菌毒素多目標免疫親和柱的制備方法使單端孢霉烯類真菌毒素的多目標凈化變得高效、快速、方便，且極具實用性、推廣性。
【附圖說明】
[0007]圖例為本發明同時分析4種真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱制備方法的示意流程圖。
【具體實施方式】
[0008]由圖例給出具體實施例。圖例給出的是一種同時分析4種真菌毒素(DON、ZEA、T-2,HT-2)的免疫親和柱制備的工藝流程圖，它包括抗體的制備和純化1、基質制備2、配體偶聯3、裝柱4。
【主權項】
1.一種同時分析4種真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱制備方法，它包括抗體的制備和純化、基質制備、配體偶聯、裝柱四個步驟，其特征在于:lmL基質Sepharose4B與I?5mg DON抗體、(λ I?Img Τ_2、ΗΤ-2抗體、0.2?Img ZEA抗體偶聯。2.根據權利要求1所述的同時分析4種真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱的制備工藝，其特征在于:抗體偶聯的情況包括D0N、ZEA、T-2三種抗體偶聯；D0N、ZEA、HT-2三種抗體偶聯；D0N、ZEA、T-2、HT-24種抗體偶聯(某些情況下T-2或HT-2 —種抗體可同時用于凈化T-2和HT-2兩種真菌毒素)。3.根據權利要求1所述的同時分析4種真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱的制備工藝，其特征在于:能同時凈化D0N、ZEA、T-2、HT-2四種真菌毒素。
【專利摘要】一種同時分析4種真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫親和柱制備方法的制備方法，屬于制備技術，它包括抗體的制備和純化、基質制備、配體偶聯、裝柱。本發明設計新穎，工藝先進，方法獨特，用途廣。不但解決了單端孢霉烯類真菌毒素在傳統富集過程中存在的基質干擾、特異性低、成本高等問題，并且實現多目標同時凈化，特異性強，極大地提高了免疫親和柱的使用效率，同時易操作，生產成本低，且極具實用性、推廣性。
【IPC分類】G01N33/543, G01N30/60
【公開號】CN104931695
【申請號】CN201510378241
【發明人】丁軻, 張家寧, 韓濤, 陳湘寧
【申請人】北京農學院
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月2日