高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蠟中硝基呋喃類代謝物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種測定蜂蠟中硝基快喃類代謝物的方法。
【背景技術】
[0002] 蜂蠟是一種由工蜂腹部下面四對蠟腺分泌的物質，其主要成分是燒醇和燒酸形成 的醋類等，在化妝品、食品和醫藥工業上有較廣泛的應用。蜂農在養殖過程中使用了硝基快 喃類藥物給蜜蜂治病，導致了蜂蠟受到硝基快喃藥物的污染。然而，硝基快喃類藥物由于其 對人體潛在的危害性，已經被歐盟嚴令禁止使用。研究證明硝基快喃類藥物在脊椎動物體 內會迅速分解，因此檢測該類藥物的穩定代謝物的方法已被廣泛認可。目前，檢測蜂產品、 水產品等動物源性食品中硝基快喃類藥物代謝物一般采用液相色譜-質譜聯用方法。由于 蜂蠟的基質復雜，無法采用國內外已公布的檢測蜂蜜、蜂王漿等蜂產品的方法進行檢測。
【發明內容】
[0003] 為了解決上述的技術問題，本發明的目的是提供一種高效液相色譜串聯質譜法測 定蜂蠟中硝基快喃類代謝物的方法。該法簡便、靈敏度高、基質干擾小等優點，可W用于蜂 蠟中硝基快喃代謝物殘留的定性和定量分析。
[0004] 為了實現上述的目的，本發明采用了W下的技術方案： 高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蠟中硝基快喃類代謝物的方法，該方法包括W下的步 驟： 1) 標準工作溶液 快喃挫酬代謝物（A0Z)、快喃它酬代謝物（AM0Z)、快喃西林代謝物（SEM)、快喃妥因代 謝物（A皿）、A0Z-D4、AM0Z-D5、A皿-13C3和SEM.肥レ13C-15N2，用甲醇配制成lmg/mL的 單標儲備液，根據實際需要用流動性稀釋成相應的混合標準工作溶液； 2) 樣品提取和衍生化 稱取試樣2.0g，精確至O.Olg，置于50血具塞塑料離屯、管，準確加入0.10血混合 內標工作溶液禍旋混和后加入lOmL正己燒，內標工作溶液的濃度為100ng/mU禍旋、超聲 溶解成乳濁液，再加入10mL鹽酸溶液和0. 15mL2-硝基苯甲醒溶液，禍旋混勻后，置于恒 溫水浴振蕩器中37°C避光振蕩16h;將上述衍生溶液取出放置至室溫，6000r/min離屯、5 min,取水層； 3) 凈化 在水溶液中加入適量的2.0mol/L磯酸氨二鐘溶液，調節抑至7. 5,倒入OasisHLB固 相萃取柱60mg，3血，OasisHLB固相萃取柱使用前先用5血甲醇和5血水活化，棄去 流出液，5mL水洗漆，再用5mL甲醇水溶液淋洗，甲醇水溶液體積比為5/95,抽干，最后 用8血甲醇洗脫，收集全部洗脫液，氮氣吹干；殘渣中加入1血甲醇/5mmol/L己酸錠溶 解殘渣，甲醇/己酸錠的體積比為2/8,禍旋混勻，過0. 45ym濾膜，供液相色譜串聯質譜儀 測定； 4) 色譜條件 色譜柱：AgilentEclipsePlus-ClS柱，100X2.1mm, 3.5ym;柱溫；40°C;進樣量；50yL;流速；0. 2血/min;流動相；A為己膳，B為5mmol/L己酸錠+0. 1%甲酸；梯度洗 脫程序；〇 ~0. 5min, 15%A;0. 5 ~5. 0min, 15%A~40%A點 0 ~9. 0min, 40%A~90%A; 9. 0 ~11. 0min，90〇/〇A;11 ~11.lmin，90〇/〇A~15〇/〇A;11. 1 ~16. 0min，90〇/〇A; 5) 質譜條件 掃描方式；正模式掃描；檢測方式；多反應監測；干燥氣溫度（GasTemp) ;325°C;干燥 氣流量（GasFlow) ;6L/min;噴霧氣壓力（Nebulizer) ;45psi;銷氣溫度（SheathGas Temp) ;400°C;銷氣流速（SheathGasFlow) ;12L/min;毛細管電壓（Capillary) ;4000V; 4種硝基快喃代謝物的質譜條件：
【主權項】
1.高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蠟中硝基呋喃類代謝物的方法，其特征在于該方法 包括以下的步驟： 1) 標準工作溶液 呋喃唑酮代謝物（AOZ )、呋喃它酮代謝物（AMOZ )、呋喃西林代謝物（SEM)、呋喃妥因代 謝物（AHD)、A0Z-D4、AM0Z-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C-15N2，用甲醇配制成lmg/mL的 單標儲備液，根據實際需要用流動性稀釋成相應的混合標準工作溶液； 2) 樣品提取和衍生化 稱取試樣2.0 g，精確至O.Olg，置于50 mL具塞塑料離心管，準確加入0.10 mL混合 內標工作溶液渦旋混和后加入IOmL正己燒，內標工作溶液的濃度為100 ng/mL，渦旋、超聲 溶解成乳濁液，再加入10 mL鹽酸溶液和0.15 mL2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混勻后，置于恒 溫水浴振蕩器中37°C避光振蕩16h ;將上述衍生溶液取出放置至室溫，6000 r/min離心5 min，取水層； 3) 凈化 在水溶液中加入適量的2.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調節pH至7. 5,倒入Oasis HLB固 相萃取柱60 mg，3 mL，Oasis HLB固相萃取柱使用前先用5 mL甲醇和5 mL水活化，棄去 流出液，5 mL水洗絳，再用5 mL甲醇水溶液淋洗，甲醇水溶液體積比為5/95,抽干，最后 用8 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，氮氣吹干；殘渣中加入I mL甲醇/5 mmol/L乙酸銨溶 解殘渣，甲醇/乙酸銨的體積比為2/8,渦旋混勻，過0. 45 μ m濾膜，供液相色譜串聯質譜儀 測定； 4) 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus_C18 柱，100X2.1 mm，3.5 μπι;柱溫：40°C;進樣量： 50 μ L ;流速：0. 2 mL/min ;流動相：A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨+0. 1%甲酸；梯度洗 脫程序：〇 ~〇· 5 min, 15%A ;0· 5 ~5. 0 min, 15%A ~40%Α ;5· 0 ~9. 0 min, 40%A ~90%A ; 9.0 ~11. 0 min，90%A ;11 ~11.lmin，90%A ~15%A ;11.1 ~16.0 min，90%A ; 5) 質譜條件 掃描方式：正模式掃描；檢測方式：多反應監測；干燥氣溫度（Gas Temp) :325°C ;干燥 氣流量（Gas Flow) :6 L/min;噴霧氣壓力（Nebulizer) :45 psi ;鞘氣溫度（Sheath Gas Temp) :400°C;鞘氣流速（Sheath Gas Flow) :12 L/min ;毛細管電壓（Capillary) :4000 V ; 4種硝基呋喃代謝物的質譜條件：
*定量離子； 6)方法的線性范圍和檢出限 配制一系列不同濃度的標準工作溶液，〇. 5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng /mL，并依次進樣， 分別以測定目標物的峰面積Y為縱坐標，以相應的濃度值為橫坐標，作標準曲線，結果 表明，4種硝基呋喃代謝物目標物在0. 5~ 10 ng/mL范圍內其濃度與峰面積呈良好的線性 關系，相關系數R2大于〇. 998。
【專利摘要】本發明涉及一種高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蠟中硝基呋喃類代謝物的方法，該方法試樣采用正己烷預溶解，酸性水溶液中衍生化，經HLB固相萃取小柱凈化，用Agilent Eclipse Plus-C18柱分離，電噴霧離子源正離子多反應監測模式串聯質譜進行測定。結果表明，4種硝基呋喃類代謝物在0.5ng/mL-10ng/mL范圍內均具有較好的線性關系，相關系數大于0.998。在0.5μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg添加水平下，實際樣品中4種硝基呋喃類代謝物的回收率在71.8%-119.0%之間，相對標準偏差（RSD，n=6）均小于10%，方法定量限（S/N>10）為0.5μg/kg。本方法快速、靈敏、準確，適用于日常蜂蠟樣品中4種硝基呋喃類代謝物殘留的定性、定量分析。
【IPC分類】G01N30-88
【公開號】CN104880523
【申請號】CN201510210053
【發明人】雷美康, 彭芳, 祝子銅, 章應俊, 安欽燕, 吳曉勤
【申請人】衢州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月28日