Metrnl蛋白作為結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及METRNL蛋白作為結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物， 及其在制備結(jié)腸癌的診斷試劑或試劑盒中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)腸癌是由于結(jié)腸粘膜上皮在環(huán)境和遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性癌 變，是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在許多國(guó)家是導(dǎo)致死亡的主要病因。結(jié)腸癌起病隱 匿，早期常無(wú)明顯的臨床癥狀，而且病情發(fā)展較慢，病人出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)大多已經(jīng)到了中晚 期。目前，結(jié)腸的治療主要是以手術(shù)為主，但結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移后的化療效果差，術(shù)后約有40 %的 患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，且晚期患者術(shù)后生存率較低。因此，尋找發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于提高 結(jié)腸癌的診斷和預(yù)測(cè)發(fā)生、發(fā)展及改善預(yù)后具有重要的臨床指導(dǎo)意義。結(jié)腸癌是一種多因 素協(xié)同作用的結(jié)果，與飲食、環(huán)境、遺傳等密切相關(guān)，但其具體的分子機(jī)制尚未完全闡明。盡 管有許多學(xué)者已經(jīng)做了大量成功的關(guān)于結(jié)腸癌分子水平的研宄，但是目前仍然缺乏有效地 早期診斷結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物可以有效地作為臨床診斷依據(jù)，可以監(jiān)聽(tīng)高位 人群、早期診斷、指導(dǎo)治療、判斷治療療效、檢測(cè)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，是腫瘤患者的重要檢查指標(biāo)、 具有重要的臨床意義。結(jié)腸癌的發(fā)生前期會(huì)有一段時(shí)間的癌前病變，如結(jié)腸息肉，因此在早 期發(fā)現(xiàn)并阻斷或延遲癌癥的發(fā)展，有極其重要的意義
[0003] Metrnl蛋白共由311個(gè)氨基酸組成，在NCBI中的注冊(cè)號(hào)為NM_001004431. 1，注 釋為人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子meteorin樣分子。Metrnl蛋白已經(jīng)在人、小鼠、牛、雞、 非洲瓜蟾和斑馬魚(yú)中鑒定出來(lái)。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN200980137344. 4,公開(kāi)了 Metrnl的治療 用途，用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、疾患或損害的藥物，并指出Metrnl是分泌性生長(zhǎng)因 子，可促進(jìn)神經(jīng)迀移、再生和分化，可用于治療一般性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是用于治療涉 及腦、腦干或脊髓和/或外周神經(jīng)損傷的疾病。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN201310525184.9,公開(kāi)了 Metrnl蛋白在制備降血糖藥物或保健食品中的應(yīng)用。
[0004] 然而，關(guān)于Metrnl蛋白作為結(jié)腸癌診斷血清標(biāo)志物的應(yīng)用及其試劑盒，還目前還 未見(jiàn)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明目的在于提供METRNL蛋白的新用途。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)免疫組織化學(xué)芯片，對(duì)30對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌組織與癌旁組織進(jìn)行免疫組 織化學(xué)，證實(shí)了 METRNL蛋白在人類(lèi)結(jié)腸癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)（在癌組織 中表達(dá)上調(diào)）。
[0007] 基于METRNL蛋白與結(jié)腸癌的這種相關(guān)性，發(fā)明人認(rèn)為METRNL蛋白可以作為檢測(cè) 結(jié)腸癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物，或用于制備檢測(cè)結(jié)腸癌的診斷試劑或試劑盒，通過(guò)對(duì)METRNL 蛋白的表達(dá)量進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，用于檢測(cè)結(jié)腸癌。
[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，METRNL蛋白在作為檢測(cè)結(jié)腸癌的蛋白分 子標(biāo)記物的用途。
[0009] 本發(fā)明的再一的目的是，提供METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中 的應(yīng)用。
[0010] 所述的METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其中的腫瘤具 體指結(jié)腸癌。
[0011] 所述的METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，是以常規(guī)方法 制備抗METRNL蛋白的抗體，建立檢測(cè)METRNL蛋白的定性或定量方法及配套的試劑或試劑 盒。
[0012] 所述的以常規(guī)方法制備抗METRNL蛋白的抗體，常規(guī)的方法可以是指用外源表達(dá) 的METRNL蛋白或化學(xué)合成的METRNL蛋白多肽作為抗原免疫動(dòng)物試驗(yàn)制備的抗體（參見(jiàn) 《抗體制備與使用實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2010年）。
[0013] 所述的抗METRNL蛋白的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。
[0014] 所述的檢測(cè)METRNL蛋白的定性或定量的方法及配套的試劑或試劑盒，具體是體 外檢測(cè)結(jié)腸組織中METRNL蛋白的表達(dá)是否異常。
[0015] 體外檢測(cè)結(jié)腸組織中METRNL蛋白的表達(dá)是否異常，首先是檢測(cè)待測(cè)結(jié)腸組織中 METRNL蛋白的表達(dá)量，其次是與正常結(jié)腸組織中的METRNL蛋白的表達(dá)量進(jìn)行比較，最后判 斷這種蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物在待測(cè)結(jié)腸組織中是否存在上調(diào)表達(dá)。
[0016] 所述的試劑或試劑盒，可以是聯(lián)酶免疫ELISA試劑盒、化學(xué)發(fā)光法試劑盒、固態(tài)或 液態(tài)芯片試劑盒，或者根據(jù)抗體包被檢測(cè)抗原的方法制備的其它試劑盒。
[0017] 鑒于到目前為止，尚未有關(guān)METRNL蛋白與結(jié)腸癌的任何相關(guān)性報(bào)道。因此，本發(fā) 明的這一發(fā)現(xiàn)將為結(jié)腸癌的診斷提供一條全新的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 附圖1為結(jié)腸癌組織芯片中METRNL蛋白的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，從左到 右點(diǎn)位置縱坐標(biāo)分別為1-10 ;從上到下點(diǎn)位置橫坐標(biāo)分別為A-G ;點(diǎn)位置（G，I)、（G，2)為 定位備用點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。
[0020] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照《分子克隆》中所述常規(guī)條 件，或試劑制造廠商所建議的條件實(shí)施。
[0021] 實(shí)施例METRNL蛋白在結(jié)腸癌組織芯片中的免疫組織化學(xué)分析
[0022] 為證實(shí)METRNL蛋白在結(jié)腸癌組織和癌旁組織之間的表達(dá)差異，隨機(jī)選取30對(duì)結(jié) 腸癌的癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本，使用結(jié)腸癌組織芯片（0D-CT-DgC 〇103-003,購(gòu)自上 海芯超生物科技有限公司）進(jìn)行免疫組織化學(xué)研宄，其中選取的樣本的具體資料如表1所 不O
[0023] 免疫組織化學(xué)研宄的實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果判定：
[0024] 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
[0025] 1、人類(lèi)結(jié)腸癌組織芯片用含10%的山羊血清的PBS室溫封閉20分鐘；
[0026] 2、加入鼠抗人metrnl抗體（購(gòu)自Sigma公司，I :180稀釋?zhuān)?度過(guò)夜，PBS洗3 次，每次5分鐘；
[0027] 3、加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠的抗體（購(gòu)自KLP公司，1:1000稀釋?zhuān)?，?溫孵育30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘；
[0028] 4、二氨基聯(lián)苯胺（DAB)(購(gòu)自Sigma公司）顯色；
[0029] 5、蘇木精-伊紅（購(gòu)自Sigma公司）染色20秒；
[0030] 6、組織切片依次使用：50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇、二甲 苯/乙醇（1:1)、二甲苯，進(jìn)行脫水透明處理；
[0031] 7、使用中性樹(shù)脂封片，于顯微鏡觀察。
[0032] 免疫組化結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出metrnl在結(jié)腸癌組織中呈陽(yáng)性，在癌 旁組織中呈中等陽(yáng)性或弱陽(yáng)性。
[0033] 根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性率對(duì)組織芯片進(jìn)行打分評(píng)估，染色強(qiáng)度打分標(biāo)準(zhǔn)為：陰性為 〇分、弱陽(yáng)性為1分、中等陽(yáng)性為2分、強(qiáng)陽(yáng)性為3分；陽(yáng)性率打分標(biāo)準(zhǔn)為：低于5%為0分， 5% -30%為1分，31-60%為2分，60%以上為3分。將染色強(qiáng)度的得分與陽(yáng)性率的得分相 加，獲得組織切片的綜合得分，得分結(jié)果如表1所示。
[0034] 表1、0D-CT-DgCol03_003結(jié)腸癌組織芯片及打分結(jié)果
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. METRNL蛋白在作為檢測(cè)結(jié)腸癌的蛋白分子標(biāo)記物的用途。 2. METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其 特征在于，所述的腫瘤具體指結(jié)腸癌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其 特征在于，以常規(guī)方法制備抗METRNL蛋白的抗體，建立檢測(cè)METRNL蛋白的定性或定量方法 及配套的試劑或試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的METRNL蛋白在制備腫瘤臨床診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其 特征在于，所述的抗METRNL蛋白的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了METRNL蛋白在作為檢測(cè)結(jié)腸癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物及在制備檢測(cè)結(jié)腸癌診斷試劑或試劑盒中的用途。本發(fā)明通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)30對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌組織與癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)，證實(shí)了METRNL蛋白在人類(lèi)結(jié)腸癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)。因此，可根據(jù)METRNL蛋白在結(jié)腸組織中的表達(dá)量來(lái)檢測(cè)患者是否患有結(jié)腸癌。
【IPC分類(lèi)】G01N33-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104808004
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510224670
【發(fā)明人】繆朝玉, 范茂兵, 李志勇
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年5月6日