一種可徹底特異性酶解依諾肝素鈉的肝素酶組合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于檢測依諾肝素鈉中1，6酐含量的不含肝素酶I的肝素酶組 合物及其應用與其檢測方法，屬于醫藥生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 依諾肝素鈉 （Enoxaparin Sodium，ES)是一種低分子肝素鈉鹽，由豬腸粘膜肝素芐 基酯衍生物進行堿解聚而獲得，美國專利US005389618A詳述了這種依諾肝素鈉制備過程。 美國藥典和歐洲藥典等對于依諾肝素鈉的質量控制有著諸多要求，除了對效價、分子量分 布、重金屬含量和試劑殘留含量等理化項目檢測外，還要求測定1，6-酐含量。由于1，6-酐 環結構低聚糖鏈的百分數是依諾肝素鈉低聚糖混合物的特征，藥典中規定其1，6-酐環結 構需占全部糖單元的15% -25%。基于依諾肝素鈉的結構與組成的高度復雜性，目前常規 的檢測尚難以涉及其分子的細節結構，在結構確證與質量標準控制上存在一定的不確定 性。
[0003] 美國藥典描述了一種1，6_酐含量測定方法（USP32附錄〈207> "依諾肝素鈉的 1，6-酐衍生物檢查")，是利用三種肝素酶等量混合，酶解依諾肝素鈉樣品兩天，產物再經還 原后HPLC分析。但實際應用中按此方法進行，其結果往往不能符合標準，主要原因在于肝 素酶性質特別，往往酶解過程無法完成徹底，使得樣品性能不能判斷。特別是肝素酶I不穩 定，價格高，選擇性差，不同來源的肝素酶對1，6-酐含量測定方法影響很大。所以導致該方 法的穩定性差，重復性差，至今該方法只是一個一般檢測方法，而沒有作為依諾肝素的質檢 放行方法。
【發明內容】
[0004] 鑒于上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提出一種可徹底特異性酶解依諾 肝素鈉的肝素酶組合物及其檢測方法。
[0005] 本發明的目的，將通過以下技術方案得以實現：
[0006] -種可徹底特異性酶解依諾肝素鈉的肝素酶組合物，所述肝素酶組合物為肝素酶 Π 與肝素酶III的混合物，所述肝素酶II :肝素酶III的酶量活性比為3:1。
[0007] 優選地，所述肝素酶II與肝素酶III為酶溶液或凍干酶粉。
[0008] 優選地，所述肝素酶組合物用于依諾肝素鈉的特異性酶解還原制得1，6-酐衍生 物。
[0009] 優選地，所述肝素酶組合物酶解還原制得1，6-酐衍生物包括如下步驟，
[0010] S1，完全酶解依諾肝素鈉步驟，在待酶解的依諾肝素鈉溶液中加入肝酶素組合物， 置于室溫下酶解至少24小時；
[0011] S2,還原酶解后樣品步驟，在經過酶解后的樣品中添加硼氫化鈉溶液渦旋混合進 行室溫的還原，并經過濾膜的過濾；
[0012] S3,還原產物的HPLC檢測，對S2中的還原產物按照以下色譜條件進行檢測：
[0013]
【主權項】
1. 一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物，其特征在于：所述肝素酶組合 物為肝素酶II與肝素酶III的混合物，所述肝素酶II;肝素酶III的酶量活性比為3:1。
2. 如權利要求1所述一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物，其特征在 于；所述肝素酶II與肝素酶III為酶溶液或凍干酶粉。
3. 如權利要求1所述一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物的應用，其特 征在于：所述肝素酶組合物用于依諾肝素鋼的特異性酶解還原制得1,6-酢衍生物。
4. 如權利要求3所述一種可徹底特異性酶解依諾肝素鋼的肝素酶組合物的應用，其特 征在于：所述肝素酶組合物酶解還原制得1,6-酢衍生物包括如下步驟， S1，完全酶解依諾肝素鋼步驟，在待酶解的依諾肝素鋼溶液中加入肝酶素組合物，置于 室溫下酶解至少24小時； 52, 還原酶解后樣品步驟，在經過酶解后的樣品中添加棚氨化鋼溶液禍旋混合進行室 溫的還原，并經過濾膜的過濾； 53, 還原產物的HPLC檢測，對S2中的還原產物按照W下色譜條件進行檢測：
54, 分析圖譜得出糖單元種類和含量； 根據色譜圖的分離度，得出洗脫還原產物為1，6-酢衍生物，并按照公式計算還原產物 中1，6-酢摩爾百分含量，1，6-酢摩爾百分含量為
S種主要的1，6-酢衍生物的摩爾百分含量的計算，S種所述1，6-酢衍生物分別 包括 4# 峰l,6-anhyho_IIS與l,6-anhy^o_IISeP\9# 峰l,6-anhy^o_IS和 11# 峰 1，6-anhy化0-IS-ISepi; 其中Mw;依諾肝素鋼平均分子量；Mwx;各個衍生物X的相對分子量；Ax;各個衍生 物X的峰面積；A1 ;1，6-AnhydroAIs的峰面積；A2 ;1，6-AnhydroAIIs的峰面積；A3 ; 1. 6-AnhydroAIs-Is的峰面積 S5,判斷1，6-酢衍生物中1，6-酢含量是否合格；當1，6-酢衍生物中1，6-酢含量的摩 爾百分含量結果在15-25%范圍內，則判定為合格，否則即判定為不合格。
【專利摘要】本發明提供了一種可徹底特異性酶解依諾肝素鈉的肝素酶組合物，所述肝素酶組合物為肝素酶Ⅱ與肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量活性比為3:1。通過本發明的肝素酶組合物可以徹底的酶解依諾肝素鈉形成并經還原制得1,6-酐衍生物，且含量均在合格范圍，本發明的肝素酶組合物不用肝素酶I減少了酶雜質的引入，使方法更可靠，是對幾大藥典方法的重要補充，具有很高的實際使用價值和意義。
【IPC分類】G01N30-02, G01N3-06
【公開號】CN104792896
【申請號】CN201510197244
【發明人】金永生, 姚亦明, 王寧霞, 王林林, 閆倩倩
【申請人】蘇州融析生物科技有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月23日