一種抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學免疫體外診斷試劑領域，具體涉及一種抗環瓜氨酸肽抗體檢測試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 抗環瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP)是環狀聚絲蛋白的多肽片段，是以IgG型為主的抗 體，對類風濕性關節炎（RA)具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破 壞較抗CCP抗體陰性者嚴重。
[0003] 類風濕性關節炎（rheumatoidarthritis,RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾 病。在全世界大約有1%的人罹患此病。RA能引起關節的疼痛、僵直及腫脹。在發病2年 內即可能出現不可逆的骨關節損傷，并可引起多種并發癥，如神經系統疾病、心包炎、淋巴 腺炎等。因此，及早診斷RA及給予緩解病情的藥物治療，對控制病情非常重要。1998年， 國外首次報道的抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cycliccirullinatedpeptideantibodies,抗 CCP抗體）的檢測，對RA具有較高的敏感性和特異性，是RA新的血清標志物。
[0004] 1998 年Schellekens和GirbalNeuhause等根據filaggrin的cDNA序列合成的 多肽證實瓜氨酸殘基是類風濕關節炎特異的抗中間絲相關蛋白（filaggrin)抗體識別表 位的必需組成。通過對基因文庫中各個序列號的filggrin氨基酸序列進行分析，合成了一 條以瓜氨酸代替精氨酸的20個左右氨基酸殘基的肽鏈。并通過一定的試驗顯示了瓜氨酸 是RA患者血清中抗filaggrin相關抗體識別的主要組成性抗原決定簇成分。抗環瓜氨酸 肽抗體（CCP)ELISA法是1998年Schellkens等建立起來輔助診斷RA的檢測方法。應用 ELISA法可定性或定量檢測患者血清中抗CCP抗體。JansenAL等通過不同類型的多關節 疾病患者血清中抗CCP抗體的測定，預測了抗CCP抗體大于50AU/ml即可對早期類風濕性 關節炎有較高的敏感性和特異性。BizzaroN等檢測了RA患者抗CCP抗體的水平，結果也 同樣顯示了抗CCP抗體的臨界值為50AU/ml。并且RA患者清血清中抗CCP抗體的平均水 平為1100AU/ml(范圍為：57~3419AU/ml。而對照組抗CCP抗體的平均水平僅為6. 8AU/ ml(范圍為~39AU/ml)。進一步證實了抗CCP抗體對RA患者的診斷價值。
[0005] 目前檢測抗環瓜氨酸肽抗體的方法主要有三種：1、酶聯免疫吸附測定法 (Enzyme-linkedTmmunoSorbentAssay,ELISA) ;2、免疫膠體金技術（Immunecolloidal goldtechnique) ;3、膠乳增強免疫透射比濁法（PETIA)。ELISA雖然在臨床上用了將近20 年，但在使用上仍然存在不少缺陷，它定量準確定差，操作時間長，樣本量不大，自動化程度 低，單批次測定費用較高，一般只能用于定性檢測；膠體金法只能測較小的樣本量，并且只 能定性檢測；膠乳免疫比濁法是近些年出現的能準確、迅速、穩定、批量測定抗環瓜氨酸肽 抗體的方法。其測定時間短，特異性好，精密度高，準確度好，適用于急門診的檢測。但是 使用膠乳免疫比濁法檢測抗環瓜氨酸肽抗體時，仍然存在一些弊端：在抗環瓜氨酸肽抗體 Anti-CCP的含量極少或極高時，形成的沉淀物Anti-CCP的致敏的膠乳微球復合物很少，甚 至無沉淀形成，檢測試劑將不能準確檢測定Anti-CCP的含量。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是：針對現有技術存在的不足，提供一種檢測靈敏度 高、檢測時間短，即使在抗環瓜氨酸肽抗體的含量極少或極高時也能準確檢測的抗環瓜氨 酸肽抗體檢測試劑盒。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0008] -種抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，包含試劑R1、試劑R2,所述試劑Rl中含有：
【主權項】
1. 一種抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，包含試劑RU試劑R2,其特征在于所述試劑Rl 中含有：
所述試劑R2中含有：
2. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述抗人Ig-G抗 體為驢抗人、羊抗人、兔抗人抗體中的至少一種。
3. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述緩沖液為三 羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、MES緩沖液、甘氨酸緩沖液中的至少一種。
4. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述反應促進劑 選自 PEG-6000、PEG-4000、PEG-2000、PEG-8000 中的至少一種。
5. 如權利要求4所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述反應促進劑 為 PEG-6000。
6. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述穩定劑為 Tween-20, TritonX-lOO、海藻糖、EDTA 中的至少一種。
7. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述防腐劑為疊 氮鈉、硫柳汞、大環內酯類抗生素中的至少一種。
8. 如權利要求1至7任一權利要求所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于 所述CCP致敏膠乳液的制備方法包括以下步驟： (1) 羧基聚苯乙烯膠乳的活化及偶聯：取0. 5ml羧化聚苯乙烯膠乳置于離心管中，用 I. 5mlMES緩沖液洗滌3次，在13000r/min離心20min，取沉淀物，在所述沉淀物中加入碳 化二亞胺〇. 5mg和N-羥基琥珀酰亞胺8mg，在IOOHz超聲10s，室溫攪拌30min，然后在 13000r/min離心，棄上清，用ImlMES緩沖液重懸，得到所述羧基聚苯乙稀膠乳； (2) 向所述羧基聚苯乙烯膠乳中加入0.2ml的抗環瓜氨酸肽抗體，室溫攪拌2小時， 加入在膠乳體系中質量濃度為0. 05 %的牛血清白蛋白做終止劑，繼續反應2小時后，在 13000r/min離心，然后棄上清，用PBS重懸，得到所述CCP致敏膠乳液。
9. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述CCP致敏膠 乳液的粒徑為100~300nm。
10. 如權利要求1所述的抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于：其特征在于所述 試劑Rl中含有：
所述試劑R2中含有·
【專利摘要】本發明公開了一種抗環瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，試劑R1含有：緩沖液0.01mol/L～0.12mol/L，氯化鈉0.1mol/L～0.2mol/L，穩定劑0.01％～0.15％，防腐劑0.004％～0.10％，反應促進劑2％～4％；試劑R2含有：緩沖液0.01mol/L～0.12mol/L，氯化鈉0.1mol/L～0.2mol/L，穩定劑0.01％～0.15％，防腐劑0.004％～0.10％，CCP致敏膠乳液2.0～4％，抗人Ig-G抗體0.003％～0.010％。本發明的試劑盒，融合了雙抗體法和PEG法的優點，同時減少了第二抗體和PEG的用量，節約了成本，提高了靈敏度。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104764888
【申請號】CN201510221084
【發明人】楊帆, 王好玉, 胡學亭, 馬金環, 于剛
【申請人】濰坊市康華生物技術有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年5月4日