抗凝血酶Ⅲ活性測定試劑盒的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種臨床檢測試劑制備方法，具體為抗凝血酶III活性測定試劑盒的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 抗凝血酶111(&11衍讓1'〇1111^1111141'111)是凝血酶及因子乂11(1、乂1(1、1乂(1、父(1 等含絲氨酸的蛋白酶的抑制劑。它與凝血酶通過精氨酸-絲氨酸肽鍵相結合。形成ATIII 凝血酶復合物而使酶滅活，肝素可加速這一反應達千倍以上。肝素與ATIII所含的賴氨酸 結合后引起ATIII構象改變，使ATIII所含的精氨酸殘基更易與凝血酶的絲氨酸殘基結 合。一旦肝素-ATIII凝血酶復合物形成，肝素就從復合物上解離，再次與另一分子ATIII 結合而被反復利用。ATIII-凝血酶復合物則被網狀內皮系統所消除。大量相關文獻已經 證明，臨床上血漿中AT-III的活性變化與多種疾病密切相關。AT-III的增多或減少是出 血、血栓的關鍵，它在肝病、腎病、肺病、腫瘤、DIC、妊娠高血壓綜合征等疾病的診斷中具有 重要意義，對腦梗、心梗等突發疾病的協助診斷方面尤顯重要。因此，AT-III活性檢測在臨 床上具有良好的應用前景。
[0003]ATIII發色底物法檢測原理是在待測血漿中加入過量的凝血酶，凝血酶與血漿中 ATIII形成1 : 1復合物，剩余的凝血酶作用于發色底物，裂解出顯色基團，顯色程度與剩 余凝血酶的量呈正相關，而與血漿中ATIII活性呈負相關。在臨床研宄中應用越來越廣泛。 目前進口的AT-III發色底物法活性的試劑盒已有供應，但價格昂貴。因此，研宄開發價格 合理、特異性和靈敏度較高的國內自主品牌的AT-III活性檢測試劑盒對于提高AT-III臨 床診斷水平具有重要意義和價值。
[0004] 專利CN102690862A，公開了一種抗凝血酶III測定試劑盒（發色底物法），由于 采用了肝素衍生物和進口的凝血酶，因此成本比較高。并且該現有技術在全自動凝血儀上 進行ATIII活性檢測時需要更改參數，更改的參數為待測血漿5y1，加入120y1稀釋液后 再取50y1血漿和60y1R1試劑，再加入60y1R2試劑，最后進行顯色。此外在后臺參數的 設計上，需要更改參數光量設置，機器自身在檢測中設置的參數光量值為"200-400"，在檢 測的過程中需要將"200 "改為"0"。該技術由于成本比較高，因此減少了試劑的用量，體積 的縮小可能會引起最后在比色的過程中部分的數值不能顯示。因此，將參數光量值設置調 整為了 "0"。該技術成本較高，并且操作不方便，結果也容易出現誤差。
【發明內容】
[0005]針對上述技術問題，本發明提供一種制備ATIII活性檢測試劑盒的方法。制備得 到的產品成本低，穩定性好，可配套用于多種凝血儀使用，滿足臨床對于ATIII活性檢測的 要求。
[0006] 為實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案，
[0007] 抗凝血酶III活性測定試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
[0008] (1)使用PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl溶液將凝血酶凍干粉末和肝素鈉溶 解，配制成S1試劑，S1試劑的凝血酶濃度為5~20IU/mL，肝素濃度為0. 2~10IU/mL;
[0009] (2)將發色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PHL0 的 10 ~ 50mm〇l/LTris-HCl溶解，配制成底物濃度為2~5ymol/mL的溶液，為S2試劑；
[0010] (3)分別在S1試劑和S2試劑中加入助劑進行凍干，形成S1凍干品和S2凍干品；
[0011] S1試劑加入的助劑在S1試劑中的含量為：BSA為0. 5~5%，KC1濃度為15~ 250mmol/L、EDTA2K濃度為1~10mmol/L、抑肽酶0? 1~5IU/mL、聚乙二醇6000濃度為1~ 5mg/ml；
[0012] S2試劑加入的助劑在S2試劑中的質量比例為：BSA為0. 5~5%、甘露醇為1~ 5% ；
[0013] (4)使用含有PH8. 4 的 10 ~50mmol/LTris-HCl、0. 1 ~0? 5mg/ml疊氮化鈉的S1 試劑復溶液復溶S1凍干品，配制成S1凍干復溶試劑；使用超純水溶解S2凍干品，配制成S2 凍干復溶試劑；
[0014] (5)采取新鮮多人份混合血漿，加入穩定劑、防腐劑物質進行凍干，制備得到 ATIII校準品；
[0015] 采用WH0/BS/10. 2146標準品，在全自動凝血儀CA-1500上對ATIII校準品進行定 值，定值范圍ATIII%為90%~110%;
[0016] (6)在全自動凝血儀CA-1500上，采用定值的ATIII校準品、S1凍干復溶試劑和S2 凍干復溶試劑制作標準曲線，線性相關系數大于〇. 99;
[0017] (7)使用待測血漿樣品在全自動凝血儀CA-1500上進行檢測，檢測得到待測血漿 樣本的0D值，機器自動計算出待測血漿樣本中ATIII的活性值，檢測程序如下：16y1待測 血漿樣品中加入175ylS1凍干復溶試劑和33ylS2凍干復溶試劑后進行顯色反應，整個 過程不調整儀器自身的任何參數。
[0018] 本發明提供抗凝血酶III活性測定試劑盒的制備方法，制備得到的試劑盒成本 低，線性范圍寬達到200 %~3. 1 %，穩定性好，在全自動凝血儀器上檢測不需要更改任何 參數，操作簡單，可配套用于多種凝血儀使用，滿足臨床對于ATIII活性檢測的要求。
【具體實施方式】
[0019] 結合實施例，進一步闡述本發明：
[0020] 實施例以制備ATIII活性檢測試劑以及具體在全自動凝血儀CA-1500上檢測為 例。
[0021] (1)使用10~50mmol/LTris-HClPH8. 4溶液將凝血酶凍干粉末和肝素鈉溶解， 將不同濃度的凝血酶和肝素鈉溶液進行混合，配制成S1試劑，凝血酶濃度為5~20IU/mL， 肝素濃度為〇. 2~10IU/mL。
[0022] (2)將發色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PHL0 的 10 ~ 50mm〇l/LTris-HCl溶解，配制成底物濃度為2~5ymol/mL的溶液，為S2試劑。
[0023] (3)分別在S1試劑和S2試劑中加入穩定劑和賦形劑進行凍干，即可制備成S1 凍干品和S2凍干品。S1試劑加入的助劑在S1試劑中的含量為：0. 5%~5%BSA，20~ 50mmol/LTris-HCl，15 ~250mmol/LKC1、1 ~10mmol/LEDTA2K/L、0. 1 ~5IU/mL抑肽酶、 1~5mg/ml聚乙二醇6000 ;。S2試劑加入的助劑在S2試劑中的質量比例為：BSA為0. 5~ 5%、甘露醇為1~5%。
[0024] (4)使用含有PH8. 4 的 10 ~50mmol/LTris-HCl、0. 1 ~0? 5mg/ml疊氮化鈉的S1 試劑復溶液復溶S1凍干品，配制成S1凍干復溶試劑；使用超純水溶解S2凍干品，配制成S2 凍干復溶試劑。
[0025] (5)在CA-1500上，使用定值好的ATIII校準品制作標準曲線，制作的標準曲線線 性相關系數大于0. 99。
[0026] (6)使用待測血漿樣品在全自動凝血儀CA-1500上進行檢測，檢測得到樣本的0D 值，機器自動計算出待測樣本中ATIII的活性值，檢測程序如下：16wl血漿中加入175y1 S1凍干復溶試劑和33y1S2凍干復溶試劑后進行顯色反應，整個過程不調整儀器自身的任 何參數。
[0027]廣品性能檢驗測試：
[0028] (1)在全自動凝血儀器上的檢測結果
[0029] 用SysmexCA-1500全自動血凝儀及配套抗凝血酶III檢測試劑（SIEMENS)和本 實施例制的的ATIII檢測試劑制作標準曲線，結果見表1。
[0030] 表1ATIII標準曲線制作結果
[0031]
【主權項】
1.抗凝血酶III活性測定試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 使用PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl溶液將凝血酶凍干粉末和肝素鈉溶解，配 制成S1試劑，S1試劑的凝血酶濃度為5~20IU/mL，肝素濃度為0. 2~10IU/mL; (2) 將發色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PH7. 0 的 10 ~50mmol/ LTris-HCl溶解，配制成底物濃度為2~5ymol/mL的溶液，為S2試劑； (3) 分別在S1試劑和S2試劑中加入助劑進行凍干，形成S1凍干品和S2凍干品； S1試劑加入的助劑在S1試劑中的含量為：BSA為0. 5~5 %，KC1濃度為15~250mmol/L、EDTA2K濃度為1~10mmol/L、抑狀酶0. 1~5IU/mL、聚乙二醇6000濃度為1~5mg/ml; S2試劑加入的助劑在S2試劑中的質量比例為：BSA為0. 5~5%、甘露醇為1~5% ; ⑷使用含有PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl、0. 1~0? 5mg/ml疊氮化鈉的S1試劑 復溶液復溶S1凍干品，配制成S1凍干復溶試劑；使用超純水溶解S2凍干品，配制成S2凍 干復溶試劑； (5) 采取新鮮多人份混合血漿，加入穩定劑、防腐劑物質進行凍干，制備得到ATIII校 準品； 采用WH0/BS/10. 2146標準品，在全自動凝血儀CA-1500上對ATIII校準品進行定值， 定值范圍ATIII%為90%~110% ; (6) 在全自動凝血儀CA-1500上，采用定值的ATIII校準品、S1凍干復溶試劑和S2凍 干復溶試劑制作標準曲線，線性相關系數大于〇. 99 ; (7) 使用待測血漿樣品在全自動凝血儀CA-1500上進行檢測，檢測得到待測血漿樣本 的0D值，機器自動計算出待測血漿樣本中ATIII的活性值，檢測程序如下：16y1待測血漿 樣品中加入175ylS1凍干復溶試劑和33ylS2凍干復溶試劑后進行顯色反應，整個過程 不調整儀器自身的任何參數。
【專利摘要】本發明涉及一種臨床檢測試劑制備方法，具體為抗凝血酶III活性測定試劑盒的制備方法，Tris-HCl溶解凝血酶凍干粉末和肝素鈉制成S1試劑，將凝血酶發色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用Tris-HCl溶解制成S2試劑，S1試劑和S2試劑凍干形成S1凍干品和S2凍干品；含Tris-HCl疊氮化鈉溶液復溶S1凍干品配制成S1凍干復溶試劑；超純水溶解S2凍干品制成S2凍干復溶試劑；多人份混合血漿進行凍干，制備得到ATIII校準品；對ATIII校準品進行定值，定值范圍ATIII％為90％～110％；采用定值的ATIII校準品、S1凍干復溶試劑和S2凍干復溶試劑制作標準曲線，線性相關系數大于0.99；待測血漿樣品中加入S1凍干復溶試劑和S2凍干復溶試劑后進行顯色反應。該方法制備得到的試劑盒成本低，線性范圍寬，穩定性好，操作簡單。
【IPC分類】G01N33-86
【公開號】CN104714036
【申請號】CN201510151571
【發明人】肖薇, 林方昭, 謝兆林, 楊顯福, 孫小成, 肖玲
【申請人】成都協和生物技術有限責任公司, 中國醫學科學院輸血研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月1日