吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品安全檢測技術領域，涉及一種免疫親和攪拌棒及其制備方法，更 具體地說，是一種吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 隨著我國經濟的發展，人們生活水平的日益提高，對各種動物源性食品的需求量 也逐漸增大，食品安全問題自然成為大家關注的焦點。近年來關于獸藥殘留引起的對人身 體健康造成危害的報道屢見不鮮，相關食品安全部門也致力于檢測方法的研究。由于生物 樣品的成分復雜、藥物與樣品成分之間易互相結合和殘留藥物濃度低等均給樣品中藥物的 提取凈化帶來了很大的困難，因此分析方法的選擇性和靈敏度直接決定了檢測的成功與 否。
[0003] 免疫親和攪拌棒（Imunoaffinity stir bar)是免疫親和固相微萃取 (Immunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME) 的一種 裝置形式，將固相微萃取（Solid phase microextraction, SPME)與免疫親和色譜 (IAC, immunoaff inity chromatography)相結合，既具有SPME易于操作、使用溶劑少和節 省時間的優點，又有免疫親和色譜高度選擇性和高親和性的特點，使SPME在獸藥殘留分析 中，選擇性、親和性和靈敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作 樣品的萃取，尤其適用于復雜基質中痕量分析物的提取，與多種檢測手段結合使用進行分 析測定，具有廣闊的應用前景。
[0004] 四環素類藥物因分子結構中具有共同的氫化駢四苯環而得名，屬廣譜抗生素，對 革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及螺旋體、立克次體、衣原體、支原體及原蟲等均有抑制作用。其 抗菌機制主要為抑制菌體蛋白質合成。本類藥物具有酸堿兩性，能與酸或堿生成鹽。但在 堿性水溶液中不穩定，故多制成鹽酸鹽。四環素類藥物重要包括四環素（Tetracycline， TC)、強力霉素（Doxycycline, DC)、金霉素（Chlortetracycline, CTC)和 土霉素 (Oxytetracycline, 0TC)〇
[0005] 1975年，前蘇聯及東歐國家就曾建議禁止在獸藥添加劑中使用四環素、土霉素、青 霉素，現已禁止將醫用抗生素作為飼料添加劑；1976年日本開始執行飼料安全法，禁止將 四環素、土霉素、鏈霉素作為飼料添加劑；2000年歐盟委員會（EC)修訂獸藥法時，對土霉 素、四環素及青霉素規定為有限使用藥物。目前，瑞典和丹麥己禁止在飼料中添加四環素類 抗生素，我國獸藥管理條例中明確規定，凡用于動物疾病，促進動物生長的品種必需經農 業部批準。2002年農業部頒布了關于動物性食品中獸藥最高殘留限量的通知6008,規定了 1〇〇多種獸藥的使用品種及在靶組織中最大殘留限量，2001年7月3日還發布了 5飼料藥 物添加劑使用規范，2003年（265)號公告中明文規定，不得使用不符合獸藥標簽和說明書 管理辦法規定的獸藥產品，不得使用食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單所列21類藥 物及未經農業部批準的獸藥，不得使用進口明令禁用的獸藥。
[0006] 人類在食用了有四環素類藥物殘留的動物性食品后，會造成藥物在體內積累， 對身體造成嚴重的危害。主要包括：①胃腸道反應，表現惡心、嘔吐、胃區不適、腹脹、 腹瀉，重者出現食管潰瘍。②四環素促使核黃素自腎臟排泄增多，造成維生素B2缺 乏，導致口、咽潰瘍，黑毛苔，肛門周圍疼痛及腹瀉等。③引起肝腎功能損害，輕者出現 肝功能異常，長期或大量應用導致肝細胞脂肪浸潤變性。④應用過期失效四環素可出 現類范可尼氏綜合征，臨床出現惡心、蛋白尿、糖尿、氨基酸尿、低血鉀及酸中毒等。 容可引起二重感染。四環素的廣譜抗菌作用使體內敏感菌被消滅，耐藥菌得以繁殖，體內菌 群平衡遭到破壞，出現二重感染。
[0007] 近幾十年來，各種食品安全監測機構、各類從事相關工作的研究人員針對食品和 飼料中四環素的殘留分析進行了深入全面的研究。目前用于CAP檢測的主要技術有：酶聯 免疫吸附分析（ELISA)、氣相色譜法（GC)、和氣相色譜-質譜聯用分析法（GC/MS )及高效液 相色譜（HPLC)等方法。ELISA法主要用于半定量快速篩選；GC和GC/MS由于需衍生化，操 作較為麻煩；HPLC分析較準確且過程相對較簡便，但檢測限比較高。本由于樣品基質成 分復雜，在萃取過程中很容易將待測藥物與其他性質相似的成分一起提取出來，給檢測造 成困難。因此，在檢測之前"凈化"工作是必不可少的，通常采用凈化方法主要有液-液萃 取（LLE)和固相萃取（SPE)。LLE過程需要使用大量有機溶劑，而一些有機溶劑性質穩定，不 易降解，對環境造成污染，而且操作繁瑣。SPE操作簡單、省時，但特異性不強是其主要的缺 點。Immunoaffinity SPME 技術首次于 2001 年被提出，用 Immunoaffinity stir bar 凈化 四環素類藥物目前還尚未見報道，更無商品化的Immunoaffinity stir bar出售。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種吸附4種四環素類藥物的免疫親和攪拌棒及其制備方 法。
[0009]為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容： 一種吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒，其特征在于是由固相載體和與其偶聯的 鹽酸四環素單克隆抗體組成，其中固相載體(玻璃棒，10 cmX 4 mm，偶聯抗體的有效長度為 2. 5 cm)與偶聯的鹽酸四環素單克隆抗體的偶聯長度與重量比為1 cm :2 mg ; 所述的單克隆抗體是由單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3注入小鼠腹腔，純化小鼠腹水得 至1J ;所述的固相載體為10 cmX4 mm玻璃棒，偶聯抗體的有效長度為2. 5 cm。
[0010] 單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3的解釋如下： TC-5G3中TC代表鹽酸四環素，5代表細胞融合過程使用第5塊96孔板，G3中的字母 和數字分別代表96孔板的橫縱編號，96孔板中1-12為橫向編號，A-H為縱向編號。G3代 表融合后的雜交瘤細胞株在96孔板中的位置。
[0011] 本發明進一步公開了吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在 于按如下的步驟進行： (1)固相載體表面的處理：將玻璃棒下半部分浸入到雙氧水：濃硫酸（30:70, v/v) lh， 依次用超純水、無水乙醇和超純水徹底沖洗；其目的是為了進行清潔和形成粗糙表面。 [0012] (2)硅烷化反應：將玻璃棒下半部分浸入ATPES (3-氨丙基三乙氧基硅烷，有市 售。）乙醇溶液中，其中ATPES:超純水：無水乙醇的體積比為5:5:90,室溫下反應24 h; (3)氨基的固定：超純水和純乙醇依次沖洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80 °C并通入氮 氣氮吹15 h ; (4)玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5%的戊二醛PBS (磷酸鹽緩沖液，即1L中含有0. 2g KH2P04,0.2 g KC1，2.9 g Na2HP04.12H20,8.8 g NaCl的溶液，配制緩沖液時所需的試劑均有 市售。）溶液中5 h，之后用超純水沖洗； (5) 偶聯反應：玻璃棒浸入單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3分泌的單克隆抗體PBS溶液， 0? 5 mg/mL 抗體 +0? 05 mg/mL NaN3* 4 °C 輕微攬祥 24 h ; (6) 將玻璃棒上未反應的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3 M)去活化1 h ; (7) 穩固共價鍵：置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4 °C反應 48 h，將酰亞胺還原為胺使共價鍵結合更加牢固；所述固相載體為高硼硅玻璃棒、高純硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
[0013] 所述的單克隆抗體指的是對四環素、強力霉素、土霉素和金霉素有特異性反應的 單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3分泌的。
[0014] 本發明更進一步公開了吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒在制備吸附4種四 環素類藥物的應用。所述吸附四環素類藥物指的是四環素、強力霉素、金霉素和土霉素。
[0015] 本發明的方法對組分凈化的同時還可提供定性信息。本發明的提純方法結合色譜 法可以使樣品中的待測組分得到有效分離和濃縮，便于4種四環素類藥物的含量的檢測， 彌補了單純免疫測定技術直接測定樣本的信息量太少、定量準確差，或理化方法選擇性低 等不足，體現了免疫學技術和常規理化技術在分析機制的互補性：
【主權項】
1. 一種吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒，其特征在于它是由固相載體和與其偶聯 的鹽酸四環素單克隆抗體組成，其中固相載體與偶聯的鹽酸四環素單克隆抗體的偶聯長度 與重量比為Icm:2mg;所述的單克隆抗體是由單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3注入小鼠腹 腔，純化小鼠腹水得到；所述的固相載體為10cmX4mm玻璃棒，偶聯抗體的有效長度為2. 5 cm。
2. 權利要求1所述吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在于按如 下的步驟進行： (1) 固相載體表面的處理：將玻璃棒下半部分浸入到雙氧水和濃硫酸混合溶液中lh， 依次用超純水、無水乙醇和超純水徹底沖洗；其中雙氧水和濃硫酸的體積比為30:70 ; (2) 硅烷化反應：將玻璃棒下半部分浸入ATPES，其中ATPES:超純水：無水乙醇的體積 比為5:5:90,室溫下反應24 h; (3) 氨基的固定：超純水和純乙醇依次沖洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 氣氮吹15h; (4)玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5% (w/w)的戊二醛PBS溶液中5 h，之后用超純水沖 洗； (5)偶聯反應：玻璃棒浸入單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3分泌的單克隆抗體PBS溶液， 0? 5 mg/mL抗體+0? 05 mg/mL NaN3* 4°C輕微攬祥24 h ; (6) 將玻璃棒上未反應的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化Ih; (7) 穩固共價鍵：置于PBS+0. 05mg/mLNaN3+0. 2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反應 48h，將酰亞胺還原為胺使共價鍵結合更加牢固；所述固相載體為高硼硅玻璃棒、高純硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
3. 權利要求2所述吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在于所述 的固相載體表面使用雙氧水：濃硫酸（30:70,v/v)進行清潔和形成粗糙表面。
4. 權利要求2所述吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒的制備方法，其特征在于所述 的單克隆抗體指的是對四環素、強力霉素、金霉素和土霉素4種四環素類藥物具有特異反 應的單克隆雜交瘤細胞株TC-5G3分泌的單克隆抗體。
5. 權利要求1所述免疫親和攪拌棒在制備吸附4種四環素類藥物方面的應用；4種四 環素類藥物指的是：四環素、強力霉素、金霉素和土霉素。
【專利摘要】本發明公開了一種吸附四環素類藥物的免疫親和攪拌棒及其制備方法與應用，它是由固相載體和與其偶聯的鹽酸四環素單克隆抗體組成，其中固相載體與偶聯的鹽酸四環素單克隆抗體的偶聯長度與重量比為1cm:2mg。本發明的提取方法結合色譜法可以使樣品中的待測組分得到有效分離和濃縮，便于四環素類藥物含量的檢測，彌補了單純免疫測定技術直接測定樣本的信息量太少、定量準確差，或理化方法選擇性低等不足，體現了免疫學技術和常規理化技術在分析機制的互補性。
【IPC分類】G01N33-577, G01N33-543
【公開號】CN104698178
【申請號】CN201510116427
【發明人】李存, 張春元, 張偉, 姚凱, 吳銀良, 李留安, 楊琳燕
【申請人】天津農學院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月18日