一種三維重建觀察細胞在載體內增殖分布的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及活體染料領域，更具體地，涉及一種長時間存留在細胞內部用于觀察細胞在三維支架內部分布及數量變化的活體染料的新用途。
【背景技術】
[0002]自然界組織、器官及生物體細胞的基本形狀均是三維立體形狀。將細胞種植于載體內進行三維培養，研宄細胞之間的相互影響、細胞對各種信號應激或者細胞與支架的聯系，已成為深入探索生命機制的重要方法和細胞研宄的必然趨勢。然而，諸如免疫組化、普通光鏡觀察等傳統的影像學技術不能對三維培養進行立體評估，如果破壞支架提取細胞后再檢測又將影響細胞功能狀態。所以運用影像學技術觀察三維狀態細胞非常重要。已經相繼出現的有關技術，包括超聲成像、核磁共振成像(MagneticResonance Imaging, MRI)、X線成像和核素成像等。這些成像技術不但需要專業的人員操作，可能有放射性，價格昂貴，而且它們的分辨率低(>1μπι)，不能夠很好地觀察細胞在支架內分布和生長。光學成像有效彌補了這一不足，它的分辨率相對較高(>0.1 μπι)，可以觀察細胞及其亞結構，其中利用激光共聚焦顯微鏡對不同焦面掃描后重構出三維立體圖形的成像技術容易實施，操作簡單，成本低，使用安全，是較理想的成像方法。為了使細胞在激光共聚焦顯微鏡下成像，就需要對細胞進行著色，使其易于分辨。我們采用活體染料羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyf luorescein diac-etate，succinimidyl ester, CFDA-SE，南京晶恩生物科技有限公司出產)對細胞著色。自從Lonys首次將CFDA-SE作為活體染料檢測細胞以來，它被廣泛地用于分析多種細胞如淋巴細胞、腫瘤細胞、干細胞等存活。其工作原理為:非極性分子CFDA-SE可以自由透過細胞膜進入細胞，被細胞內酯酶催化分解成羧基熒光素琥珀酰亞胺醋(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)，CFSE不可逆地與細胞內蛋白結合并熒光標記細胞內蛋白上，也不會被降解或者代謝，對細胞生理活動無明顯影響。成熟細胞的熒光標記均勻穩定呈綠色，可持續兩個月以上。細胞分裂后，熒光蛋白可以平均分配到子細胞中，熒光強度減半。通常用流式細胞儀進行分析動力學參數如分裂率、死亡率、進入第I代分裂時間、平均細胞周期等。CFDA-SE染色法相對于傳統的測定細胞增殖染色法3H-TdR摻入法、MTT比色法優勢明顯，細胞用量少，操作簡單，且可以分析單個細胞的增殖信息。
【發明內容】
[0003]本發明的任務是提供一種利用CFDA-SE染色觀測三維培養細胞的方法，即一種三維培養光學成像方法，具體是一種經過CFDA-SE染色的細胞封裝在載體內由激光共聚焦顯微鏡掃描后三維重建來觀察細胞在載體內增殖、分布的方法。該方法簡單快捷，僅需10分鐘染色，價格便宜(相對熒光標記抗體)，可以連續觀察2個月以上。
[0004]按照本發明，提供一種三維重建觀察細胞在載體內增殖分布的方法，該方法過程為:將用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5uM的終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37°C孵育6-15分鐘，洗滌后將染色后的細胞封裝在載體內構建三維培養體系，在不同時間點對該三維培養體系不同層面行激光共聚焦掃描并三維重建，得到僅有綠色球形熒光的重建圖。
[0005]實現本發明的具體方案是:
[0006]本發明提供的三維重建觀察細胞在載體內增殖分布的方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一、細胞染色:用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5微摩爾每升(μΜ)的最終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37°C孵育6-15分鐘，洗滌去除殘余的染色劑后得到著色目的細胞；
[0008]步驟二、構建三維培養體系:將著色目的細胞封裝在載體(如水凝膠、蛋白質、基質等)內構建三維培養體系；
[0009]步驟三、激光共聚焦顯微鏡三維重建:在不同時間點對該三維培養體系不同層面行激光共聚焦顯微鏡掃描并進行三維重建，得到僅有綠色球形熒光的能直接觀察目的細胞在載體內分布的重建圖。
[0010]步驟三中所述的三維重建是利用NIS Elements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件進行的三維重建。
[0011 ] 步驟三所得到的重建圖可以是用CFDA-SE染色細胞得到的。步驟二所構建的三維培養體系可以反復三維重建。
[0012]優選地，在本發明中，重建后圖像分辨率在大于0.1 μ m，而且可以根據需要設定step (每層厚度)，分辨率會更高。按照本發明，經過簡單操作和廉價的檢測就可以直觀觀察目的細胞在載體內的分布與數量變化，彌補了普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡不能很好觀察三維培養的細胞的不足。
【附圖說明】
[0013]圖1.CFDA-SE工作原理示意圖CFDA-SE通透細胞膜進入細胞，可以被細胞內的酯酶分解成CFSE，CFSE不可逆地和細胞內蛋白的氨基發生結合反應，并標記這些蛋白，也不會被降解或代謝。
[0014]圖2.CFDA-SE染色法觀測三維培養細胞的流程圖
[0015]圖3.三維重建后效果圖可見長方體內白色點狀即為細胞
【具體實施方式】
[0016]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0017]實施例1
[0018]如圖2所示，我們分三步實施本發明方法:
[0019]第一步:細胞染色
[0020]我們選取目的細胞為生長狀態良好的第3代臍靜脈內皮細胞，2.5%胰酶-0.02%EDTA液消化I分鐘，DMEM高糖培養基重懸中和胰酶，4°C下100rpm離心5分鐘，PBS重懸制作成濃度為2 X 16的細胞懸液；購自南京恩晶生物科技有限公司5mg的CFDA-SE，用二甲基亞砜溶解成lOmmol/1的儲存液，在_20°C冰箱中保存。臨用前，取適量儲存液用PBS稀釋為5 μ M工作液并平衡至室溫。將該工作液與臍靜脈細胞懸液等體積混勻，37°C避光孵育10分鐘，100rpm離心5分鐘后棄上清，PBS洗滌3次以去除殘余的染色劑，得到著色目的細胞；
[0021]第二步:構建三維培養體系
[0022]我們采取對細胞無毒，溶脹性及降解性良好的載體，載體制作及包封細胞過程為:濃度為I X 14個/ μ I的著色目的細胞與載體等體積混合后，用100 μ I移液器取出30 μ I置入去頭端Iml注射器內，緩慢鋪于注射器活塞平面上。然后置于37°C溫箱內孵育lOmin，待載體呈固態，即構建了三維培養體系，整個過程需要避光；
[0023]第三步:激光共聚焦顯微鏡三維重建
[0024]三維培養體系加入目的細胞培養基中溶脹lOmin，放入37°C溫箱中培養，I天后用激光共聚焦顯微鏡對其進行斷層掃描。利用NIS Elements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件三維重建得到圖3效果，其中白色點狀結構即為細胞。操作如下:
[0025]I)將三維培養體系取出置入直徑35mm的激光共聚焦專用培養皿中，不加入培養基;
[0026]2)設定激光光源488nm波長的綠光，設定綠色通道，點擊Acquire菜單下CaptureZ Series里Capture Automatically選項，即為Z軸序列拍攝，在目鏡下觀察確定需要掃面的頂面和底面并設定，同時設定step，開始掃描。掃描結束后點擊“Show Volume Viewer”進行三維重建；
[0027]3)關閉NIS Elements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件和激光共聚焦顯微鏡，取出三維培養體積置入孔板中繼續培養，便于日后對樣本重復掃描；
[0028]4)使用激光共聚焦顯微鏡時，室內避光，遠離電磁輻射源，環境清潔，控制工作溫度在5?25°C。
[0029]利用CFDA-SE著色后激光共聚焦顯微鏡重建用于多種三維培養狀態的細胞和支架，但是具體染色時間、CFDA-SE濃度和細胞濃度需要自行摸索，以將CFDA-SE對細胞生命活性的影響降到最低。不同時間對同一位置進行掃描和三維重建，必須每次曝光度相同，并對其感興趣區域統計(ROI Statistics)，還能夠分析感興趣區域面積、平均光強、總光強、
信噪比等信息。
【主權項】
1.一種三維重建觀察細胞在載體內增殖分布的方法，包括以下步驟: 步驟一、細胞染色:用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5微摩爾每升的最終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37°C孵育6-15分鐘，洗滌去除殘余的染色劑后得到著色目的細胞； 步驟二、構建三維培養體系:將著色目的細胞封裝在載體水凝膠、蛋白質、基質內構建三維培養體系； 步驟三、激光共聚焦顯微鏡三維重建:在不同時間點對該三維培養體系不同層面行激光共聚焦顯微鏡掃描并進行三維重建，得到僅有綠色球形熒光的能直接觀察目的細胞在載體內分布的重建圖。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三中所述的三維重建是利用NISElements Viewer 3.20圖像采集及處理軟件進行的三維重建。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟三所得到的重建圖的分辨率大于0.1微米。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三所得到的重建圖是用CFDA-SE染色細胞得到的。
5.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于，步驟二所構建的三維培養體系可以反復三維重建。
【專利摘要】本發明提供了一種三維重建觀察細胞在載體內增殖分布的方法，該方法過程為：將用二甲基亞砜和磷酸鹽緩沖液溶解CFDA-SE，以5uM的終濃度加入到目的細胞懸液中染色，37℃孵育6-15分鐘，洗滌后將染色后的細胞封裝在載體內構建三維培養體系，在不同時間點對該三維培養體系不同層面行激光共聚焦掃描并三維重建，得到僅有綠色球形熒光的重建圖。經過CFDA-SE染色的細胞封裝在載體內由激光共聚焦顯微鏡掃描后三維重建來觀察細胞在載體內增殖、分布。該方法簡單快捷，僅需10分鐘染色，相對熒光標記抗體價格便宜，可以連續觀察2個月以上。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號】CN104697970
【申請號】CN201510114737
【發明人】張洪躍, 史嘉瑋, 趙磊, 董念國
【申請人】華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月17日