一種用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的elisa免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)在全球范圍內對養豬業造成了巨大的經濟損失。該 病于20世紀八十年代首次幾乎同時出現在德國和美國，此后，PRRS在全球范圍內爆發和 流行。2006年春，在中國中部暴發豬高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highly pathogenic PRRS，PHFD)以高達20%~100%的死亡率引起了社會廣泛的關注。
[0003] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)是導致該病主要病原。其屬于動脈炎病毒科， 動脈炎病毒屬。各種年齡的豬均易感，妊娠母豬感染后可引起流產、死胎、木乃伊胎及弱胎， 仔豬可發生呼吸障礙和高病死率，其他豬常呈隱性感染或僅出現輕度的呼吸道癥狀。PRRS 病毒包括歐洲型和美洲型兩種主要抗原型，分別以LV和VR-2332為代表株。由于其對養豬 業的嚴重威脅性，國際獸疫局（1996)已將本病例為B類傳染病。
[0004] 目前檢測PRRSV的方法主要有病毒分離鑒定、間接免疫熒光試驗和血清中和試驗 等診斷方法。以上技術要么工作量太大，要么要操作活病毒，要么特異性和敏感性不足，要 么診斷時間過長，影響了疫病控制，要么不能夠方便的進行臨床檢測。因此，開發一種具有 特異性、敏感性良好，適用于臨床檢測，勞動強度不高，檢測時間較短，檢測費用較低的抗體 檢測試劑盒具有良好的應用價值和市場價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種用于檢測美洲型豬繁 殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試劑盒，通過純化的該病毒的核蛋白為檢測抗原， 以標準血清作為對照，能夠簡單快速準確的檢測待檢豬血清中美洲型豬繁殖與呼吸綜合征 病毒抗體值。
[0006] 本發明提供一種用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試 劑盒，包括已包被抗原的酶聯板，所述包被抗原為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分 或全部核蛋白基因的重組核蛋白；所述試劑盒還包括兔抗豬的酶標二抗，所述酶為辣根過 氧化物酶。
[0007] 優選地，包被抗原時使用的封閉液為5%脫脂奶粉和5%的馬血清。
[0008] 優選地，所述包被抗原的包被濃度為234ng/ml。
[0009] 優選地，所述酶標二抗的工作濃度為1:20000。
[0010] 優選地，所述試劑盒還包括標準血清、顯色液、終止液。
[0011] 本發明的第二個目的是提供上述試劑盒在檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒 抗體中的應用。
[0012] 本發明的第三個目的是提供應用上述試劑盒檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病 毒抗體的方法，步驟如下：
[0013] (1)取出預包被抗原的酶標板，在不同孔中分別加入陽性標準血清和陰性標準血 清；然后在其他孔內加入稀釋后的待檢豬血清，反應，棄反應液，洗滌；
[0014] (2)加入1:20000倍稀釋的兔抗豬的酶標二抗，反應，棄反應液，洗滌；
[0015] (3)加入TMB顯色液避光顯色，加入反應終止液，在酶標儀上讀取OD45tl數值；
[0016] (4)若陽性標準血清OD45tl彡0. 45，陰性標準血清OD 45Q〈0. 45，且陽性對照血清 OD45tl/陰性對照血清OD45tlS 2. 10,則判定為試驗成立；若試驗成立，依據待檢豬血清的OD 45Q 數值進行判斷，OD45tlS 0. 45即為陽性，反之為陰性。
[0017] 本發明的有益效果為：本發明提供的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的間接 ELISA檢測試劑盒可以準確的測定美洲型豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒的抗體，其操作簡 單，所需I. 5h，僅為法國LISSEU公司的檢測美洲型PRRSA的ELISA檢測試劑盒檢測方法的 一半，且與其具有良好的一致性，可以用于大量樣品檢測和流行病學調查。
【附圖說明】
[0018] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0019] 圖1為原核表達系統純化產物的SDS-PAGE檢測結果，其中M為蛋白marker ;1為 空白，2為純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的核蛋白基因。
[0020] 圖2為原核表達系統純化產物的western blot檢測結果，1對照，2為表達的豬繁 殖與呼吸綜合征病毒的核蛋白基因。
【具體實施方式】
[0021] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0022] 實施例1
[0023] 本發明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ELISA試劑盒的組成及制備方法為：
[0024] 1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒原核表達系統表達的核蛋白的制備、包被及封閉：
[0025] 美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重組核蛋白接種大 腸桿菌表達系統在37°C培養16h，收集培養物利用鎳柱進行重組蛋白純化，包被時用包被 液（包被液為碳酸氫鹽緩沖液，PH9. 6)稀釋成234ng/ml，取50 μ 1/孔的量加到酶聯板上， 4°C包被過夜；以PBST洗滌3遍，每孔加入100 μ 1封閉液（5%脫脂奶粉和5%的馬血清）， 37°C放置2h。棄掉洗滌液，PBST洗滌3遍，采用鋁箔袋真空封口，4°C保存。該封閉液能很 好地封閉非特異型反應。
[0026] 2、標準陽性血清的制備：
[0027] 以美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒按照免疫程序接種20kg的豬，采集免疫前和 免疫后2周的血清，分離血清，測定血清抗體效價，無菌分裝備用。OD 45tlS 0. 45為合格。
[0028] 3、標準陰性血清的制備：
[0029] 選用20kg左右、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體陰性的健康斷奶仔豬4頭，無菌采 血，分離血清，一 25°C保存。按《中華人民共和國獸藥典》進行無菌檢驗，豬繁殖與呼吸綜合 癥病毒抗體〇D45(l< 0. 215為合格。
[0030] 4、酶標記物：兔抗豬的酶標二抗。含有淡紅色指示劑。指示劑是為了在檢測時防 止漏加，同時指示抗體稀釋液的PH值；所述的酶為辣根過氧化物酶（HRP)。
[0031] 5、標準陰陽性血清和待檢血清稀釋度的選擇：
[0032] 棋盤滴定確定標準陰陽性血清和待檢血清稀釋度為1:200。
[0033] 6、抗原抗體最適宜濃度的選擇：
[0034] 棋盤滴定確定酶標抗體的工作濃度為1:20000,標準陰陽性血清和待檢血清稀釋 度為1:200,相應抗原的最適包被濃度為234ng/ml。
[0035] 7、TMB顯色液1瓶，購自Sigma公司。
[0036] 8、終止液1瓶，為I. 25M的硫酸。
[0037] 9、25XPBST 為 1 瓶。
[0038] 10、樣品稀釋液1瓶，為含2%吐溫-20的PBS，且含有淡綠色指示劑。指示劑是為 了在檢測時，防止漏加，同時指示血清稀釋液的PH值。
[0039] 11、真空包裝鋁箔盒包裝的試劑盒2個。
[0040] 12、說明書一份。
[0041] 試劑盒的組成具體參見表1，按照表1所列的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中 和抗體競爭ELISA檢測試劑盒內容，裝配試劑盒，組成后裝于4°C保存。
[0042] 表1美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中和抗體競爭ELISA檢測試劑盒
【主權項】
1. 一種用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試劑盒，包括已包 被抗原的酶聯板，其特征在于：所述包被抗原為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分或 全部核蛋白基因的重組核蛋白；所述試劑盒還包括兔抗豬的酶標二抗，所述酶為辣根過氧 化物酶。
2. 根據權利要求1所述的用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫 試劑盒，其特征在于：包被抗原時使用的封閉液為5%脫脂奶粉和5%的馬血清。
3. 根據權利要求1或2所述的用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA 免疫試劑盒，其特征在于：所述包被抗原的包被濃度為234ng/ml。
4. 根據權利要求1或2所述的用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA 免疫試劑盒，其特征在于：所述酶標二抗的工作濃度為1:20000。
5. 根據權利要求3或4所述的用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA 免疫試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括標準血清、顯色液、終止液。
6. 權利要求1-5所述的試劑盒在檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體中的應用。
7. 應用權利要求1-5所述的試劑盒檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的方法， 其特征在于：步驟如下： (1) 取出預包被抗原的酶標板，在不同孔中分別加入陽性標準血清和陰性標準血清；然 后在其他孔內加入稀釋后的待檢豬血清，反應，棄反應液，洗滌； (2) 加入1:20000倍稀釋的兔抗豬的酶標二抗，反應，棄反應液，洗滌； (3) 加入TMB顯色液避光顯色，加入反應終止液，在酶標儀上讀取OD45(l數值； (4) 若陽性標準血清OD45Q> 0. 45,陰性標準血清OD 45Q〈0. 45,且陽性對照血清OD45(/陰 性對照血清〇D45(l> 2. 10,則判定為試驗成立；若試驗成立，依據待檢豬血清的OD 45(|數值進 行判斷，〇D45(l> 0. 45即為陽性，反之為陰性。
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的ELISA免疫試劑盒，包括已包被抗原的酶聯板，所述包被抗原為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重組核蛋白；所述試劑盒還包括兔抗豬的酶標二抗，所述酶為辣根過氧化物酶。本發明提供的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的間接ELISA檢測試劑盒可以準確的測定美洲型豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒的抗體，其操作簡單，所需1.5h，僅為法國LISSEU公司的檢測美洲型PRRSA的ELISA檢測試劑盒檢測方法的一半，且與其具有良好的一致性，可以用于大量樣品檢測和流行病學調查。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-569
【公開號】CN104678104
【申請號】CN201510002979
【發明人】丁耀忠, 張中旺, 張 杰, 周建華, 張永光
【申請人】中國農業科學院蘭州獸醫研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年1月5日