一種測定CS/siRNA復合體系中siRNA復合率的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種SiRNA復合率的測定方法，具體說是一種殼聚糖作為SiRNA遞送 載體體系時形成的CS/siRNA復合體系中siRNA復合率的一種檢測方法。
【背景技術】
[0002] 小干擾RNA(siRNA)由21~23個堿基對構成，可在細胞質中特異性與其堿基對互 補的信使RNA(mRNA)結合并使其經核酸酶降解，從而阻斷其編碼蛋白質的表達，即通過RNA 干擾（RNAi)實現基因沉默。因此，siRNA作為藥物在癌癥和流感、炎等病毒感染疾病治療 領域有重要科學意義和應用價值。然而，荷負點的親水性siRNA難以跨越表面負電的疏水 性細胞膜，易被核酸酶降解及快速從血液循環中清除。因此需要安全高效的載體釋放系統 保護并高效運送進入細胞發揮功能。
[0003] 殼聚糖（Chitosan，CS),是由甲殼素（chitin)脫乙酰化制得的一種聚氨基葡萄 糖，是一種含3 (1，4) 2乙酰胺基D葡糖單元和3 (1，4) 2胺基D葡糖單元的共聚物。殼聚糖 是天然多糖中唯一的堿性多糖，含有游離氨基并在酸性條件下能結合氫離子，成為帶正電 荷的電解質，可與帶負電荷siRNA通過靜電相互作用，自聚集形成納米結構復合體系，無需 使用有機溶劑及超聲處理，減少對核酸損傷。由于殼聚糖載體纏繞、包裹而被束縛的siRNA 處于復合態，而不受束縛的siRNA處于游離態。
[0004] 評價CS/siRNA納米復合物質量的指標有粒徑及粒徑分布、表面zeta電位和siRNA 復合率等。其中siRNA復合率（即復合態siRNA占總siRNA百分率）對siRNA最終作用效 果以及殼聚糖材料優化、成本核算等方面有重要影響。目前，用于測定殼聚糖載體體系中 siRNA復合率的方法往往存在較大的問題，如方法的靈敏性、重復性差，甚至無法定量。
[0005] 聚丙烯酰胺及瓊脂糖凝膠電泳法最常用于表征siRNA復合狀態。Xiudong Liu 等人報道了用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)法考察了殼聚糖分子量及脫乙酰度對siRNA 復合的影響（Xiudong Liua, Kenneth A. Howard, Mingdong Dong, et al. The if luence of polymeric properties on chitosan/siRNA nanoparticle formulation and gene silencing [J] ? Biomaterials28 (2007) 1280 - 1288.)。游離態siRNA在電場力作用下沿凝 膠孔遷移，而復合態siRNA由于納米粒空間位阻作用不隨電場力遷移，最終游離態與復合 態siRNA發生分離。后經siRNA熒光染料作用后紫外照射下siRNA呈現明亮的條帶，且條 帶明亮程度與游離siRNA濃度正相關。實驗組游離siRNA條帶與不含載體的對照組siRNA 對比后評價各條件下載體對siRNA復合能力。
[0006] 將納米粒復合物與游離siRNA分離后直接測定后者濃度可以得出siRNA復合率。 Xudong Yuan等利用離心方法將游離siRNA分離并測得siRNA復合率（Xudong Yuan, Bruhal A.Shah, Naimesh K.Kotadia et al. The Development and Mechanism Studies of Cationic Chitosan-Modified Biodegradable PLGA anoparticles for Efficient siRNA Drug Delivery[J]. Pharm Res(2010)27:1285 - 1295.)。制備的納米粒復合物懸液經 3000rpm離心20min后，納米粒沉降而得以與游離siRNA分離。離心上清液經紫外分光光度 計檢測260nm處紫外吸光度值，并利用繪制的siRNA濃度-吸光度標準曲線計算游離siRNA濃度，進而計算得到納米粒體系siRNA復合率為最高位77. 7%。
[0007] 凝膠電泳法表征siRNA復合狀況，結果直觀明了，對比強烈，雖然可以通過圖像處 理軟件分析條帶亮度而給出復合率值，然而這種定量方法重復性難以滿足要求。離心、超濾 等方法分離游離siRNA并測定其濃度得出復合率的方法可以實現精確定量，但分離操作繁 瑣，且分離過程對siRNA復合狀態產生不可避免的影響，最終導致得到的復合率結果準確 性差。同時，紫外燈檢測方法特異性弱，靈敏性差。
【發明內容】
[0008] 針對現有方法的缺陷，本發明的目的在于提供一種定量測定CS/siRNA體系中 siRNA復合率的方法，該方法無需將納米粒與游離siRNA分離，原位加入核酸燃料便可根據 熒光強度變化精確測定游離siRNA濃度。
[0009] 本發明定量檢測siRNA復合率是利用核酸染料與游離siRNA結合后熒光特性發生 改變的特性，根據siRNA濃度-熒光強度計算體系中游離siRNA濃度，進而計算到siRNA復 合率。本發明所用核酸染料指SYBRU:Gold及SYBRliGreenI，均購自美國Molecular Probes公司，原液為DMSO為溶劑濃度為10000X(10000倍）濃縮液，使用時根據需要選擇 合適的緩沖溶液將其稀釋至合適的濃度，如稀釋10000倍得濃度IX工作液，稀釋2000倍得 濃度5X工作液。核酸染料未與siRNA結合時，所發射熒光極其微弱，而嵌入siRNA后其熒 光強度增強500-1000倍。在CS/siRNA體系中核酸染料可與游離siRNA自由結合，而siRNA 復合后由于自身構象變化及殼聚糖空間位阻作用將無法與染料嵌合。因此，根據加入核酸 染料后樣品熒光強度并結合siRNA濃度-熒光強度標準曲線即可得出siRNA復合率。
[0010] 由此，本發明人利用核酸染料該熒光性質，提出如下精準測定CS/siRNA體系中 siRNA復合率的方法。
[0011] 本發明提出的具體技術方案：
[0012] (1)將摩爾濃度為Csi，體積為Vsi的SiRNA加入到質量濃度為Wes，體積為Ves的殼 聚糖（chitosan，CS)溶液中，反應經時間T1后形成CS/siRNA復合物。
[0013] (2)將濃度為Csy、體積為Vsy核酸染料加入到步驟（1)制備的復合物溶液中，反應 時間T2。
[0014] (3)將步驟（2)獲得的溶液測定熒光強度(激發波長Ai為470-510nm，發射波長 入 2 為 520_550nm)。
[0015] (4)配制系列siRNA濃度溶液，繪制siRNA濃度-熒光強度標準曲線。
[0016] (5)使用步驟（3)獲得的熒光強度通過步驟（4)的標準曲線計算得到體系中游離 siRNA濃度為Csi_&M，并按照如下公式計算得出siRNA復合率CE:
【主權項】
1. 一種測定CS/siRNA復合體系中SiRNA復合率的方法，其特征在于：將核酸染料加入 到CS/siRNA復合物溶液中，反應5-60min，通過測定溶液中核酸染料的熒光強度，得到CS/ siRNA復合物體系中游離siRNA濃度，從而計算出siRNA復合率。
2. 按照權利要求1所述的測定CS/siRNA復合體系中siRNA復合率的方法，其特征在于 所述方法的具體步驟如下： (1) 將摩爾濃度為Csi、體積為Vsi的siRNA加入到質量濃度為Wes、體積為V es的殼聚糖 (chitosan，CS)溶液中，反應經時間T1后形成CS/siRNA復合物； (2) 將濃度為Csy、體積為Vsy核酸染料加入到步驟（1)制備的復合物溶液中，反應時間 T2; (3) 將步驟（2)獲得的溶液測定熒光強度；熒光的激發波長λ i為470-510nm，發射波 長 λ 2 為 520-550nm ; (4) 配制體積為 Vsi+Vcs、摩爾濃度分別為 80nM、160nM、240nM、320nM、400nM 的 siRNA 溶 液，并加入將濃度為Csy、體積為Vsy核酸染料，反應時間T2后檢測各濃度siRNA樣品熒光強 度，繪制siRNA濃度-熒光強度標準曲線；熒光的激發波長λ i為470-510nm，發射波長λ 2 為 520_550nm ; (5) 將步驟（3)獲得的熒光強度代入步驟（4)的標準曲線，計算得到體系中游離siRNA 摩爾濃度為Csi_f_，并按照如下公式計算得出siRNA復合率CE :
3. 按照權利要求1或2所述的測定CS/siRNA復合體系中siRNA復合率的方法，其特征 在于：核酸染料為SYBRu Gold或SYBRx Green I。
4. 按照權利要求1所述的測定CS/siRNA復合體系中siRNA復合率的方法，其特征 在于：所述 Csi 為 0· 1-10μΜ，Vsi 為 l-100μ L，Wcs 為 0· 01-lmg/mL，Vcs 為 l-100μ L，T1 為 5-60min，Csy 為 0· 5-5Χ，Vsy 為 10-100 μ L，T2 為 5-60min。
5. 按照權利要求1或2所述的測定CS/siRNA復合體系中siRNA復合率的方法，其特征 在于：該方法適合測定分子量20kDa-500kDa，脫乙酰度60%-95%范圍內的殼聚糖所制備CS/ siRNA復合物中siRNA復合率。
【專利摘要】本發明公開了一種測定殼聚糖（CS）基載siRNA復合物體系中siRNA復合率的方法。本發明以與雙鏈siRNA特異性結合的核酸染料加入到CS/siRNA復合物溶液中，通過測定溶液熒光強度并結合染料熒光強度-siRNA濃度標準曲線計算體系中游離siRNA濃度并得出siRNA復合率。本發明提供的方法無需將復合物與游離siRNA分離便可精確測定復合物體系中siRNA復合率，且具檢測結果準確、精密度高、容易操作等優點。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號】CN104655600
【申請號】CN201410081450
【發明人】馬小軍, 張德蒙, 劉袖洞, 于煒婷
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年3月6日