微生物細胞表面抗原的篩選與鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種簡便、快捷篩選和鑒定微生物細胞表面蛋白抗原的方法。
【背景技術】
[0002] 業已證明，采用疫苗接種是預防微生物疾病有效、經濟的免疫干預途徑。微生物 細胞表面蛋白由于定位于細胞表面，與宿主免疫系統直接接觸，其刺激機體產生的特異性 抗體與相應的微生物細胞表面蛋白結合后，通過中和作用抑制微生物感染，或介導免疫細 胞的吞噬，在病原體入侵最初階段即可發揮作用。因此微生物細胞表面蛋白是良好的疫苗 候選蛋白，也是研究的熱點。如學者發現弧菌細胞表面蛋白OmpA、OmpU等具有良好的免疫 原性和免疫保護性，可作為疫苗的候選蛋白。在微生物細胞表面蛋白抗原篩選方面，常規免 疫蛋白組學采用的是先分離微生物細胞表面蛋白、然后進行免疫印記篩選，但提取細胞表 面蛋白，特別是外膜蛋白存在一定的困難，而且分離外膜蛋白的二維電泳操作繁瑣，重復性 差，對低拷貝蛋白、極端等電點蛋白不能展示。而且現提取分析微生物細胞表面蛋白，破壞 了細胞表面蛋白的天然結果，不能很好反應出體內免疫反應的過程。這在一定程度上限制 了它的應用。
【發明內容】
[0003] 本發明旨在提供一種簡單、快捷的篩選和鑒定微生物細胞表面抗原的方法，其技 術是利用免疫沉淀使微生物全細胞與微生物抗血清中的微生物細胞表面蛋白抗體發生免 疫反應，超聲處理抗體與微生物全細胞復合物，再用蛋白A/G瓊脂糖捕捉抗原抗體復合物。 SDS-PAGE簡單分離抗原抗體復合物，確定具有免疫原性的蛋白質，最后采用質譜技術分析 和鑒定這些免疫原。
[0004] 本發明所說的微生物細胞表面抗原的篩選和鑒定方法的具體步驟如下：
[0005] 1)用微生物全細胞免疫沉淀分離出細胞表面蛋白抗體：微生物細胞收集后與微生 物抗血清按體積比抗血清：微生物=1 :500加入抗血清冰浴孵育，陰性血清作為對照，離心 去除抗血清細胞表面抗體外其他成份,收集微生物細胞與細胞表面抗體復合物；
[0006] 2)將分離出的微生物細胞與細胞表面抗體復合物，超聲波破碎后，用蛋白A/G瓊 脂糖與冰浴孵育，捕捉抗原抗體復合物，洗滌三次后，洗脫抗原抗體復合物；
[0007] 3)洗脫后的抗原抗體復合物SDS-PAGE分析，用銀染觀察結果，陰性對照沒有或很 少，實驗組有或很多的蛋白條帶，該條帶中的所有蛋白即具有免疫原性，再使用超濾管對抗 原抗體復合物進行濃縮后在進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色出現的陽性條帶準備進 行質譜；
[0008] 4)免疫原的定性：取出具有免疫原性的全部考染蛋白質條帶，按常規質譜樣品處 理方法進行樣品制備，然后進行質譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質種類。
[0009] 所說的微生物為細菌，真菌。
[0010] 超聲破碎時所采用的輸出功率、時間、次數和時間間隔可按研究對象進行調整，一 般可采用每次3秒，間隔4秒，超聲2min。 toon] 所說的微生物抗血清是用微生物全細胞免疫動物得到的特異性抗血清。
[0012] 本發明所采取的策略與傳統的免疫蛋白組學不同，是先進行微生物細胞表面蛋白 與抗血清進行免疫反應，再簡單分離具有免疫原性的微生物細胞表面蛋白，最后利用質譜 技術和生物信息學分析確定這些微生物表面蛋白抗原的種類。從而建立了一種新的基于免 疫沉淀的微生物細胞表面蛋白抗原篩選技術，用于高通量篩選具有免疫原性的微生物細胞 表面蛋白質以作為多價疫苗的候選靶位。根據免疫原的豐度和與抗體的親和力，可以確定 其作為免疫原的可能性及其作用的效果。本發明可迅速確定某種微生物細胞表面的具有免 疫原性的全部蛋白質，從而達到高效、快速、經濟、實用的優選免疫原的目的。本發明能夠高 通量篩選具有免疫原性的疫苗候選位點，為確定作為多價疫苗靶位的基因奠定了基礎，提 高了制備多價疫苗靶點的效率。由于所有微生物作為抗原免疫動物后，機體均會產生針對 其抗原的特異性抗體，這些抗體可以用來免疫沉淀實驗，篩選免疫原，而且本發明不用二維 電泳分離細胞表面蛋白，極大得簡化了實驗步驟。故本實驗的原理和方法具有普遍性，操作 步驟簡單快捷，可高效用于細菌、真菌等微生物細胞表面抗原的鑒定。
[0013] 本發明進一步發展了免疫沉淀技術的應用，即建立了一種基于免疫沉淀的微生物 細胞表面抗原篩選技術，從而可以確定與微生物抗血清反應的微生物細胞表面蛋白質。由 于這一設計是基于最簡單的實驗技術，故不僅可以快速確定某種微生物所具有的細胞表面 抗原，還可以得知其在細胞表面的豐度和與抗體的親和力。根據這些免疫原的細胞表面豐 度和與抗體的親和力，確定作為多價靶位疫苗的可能性和判斷其作用效果。
【附圖說明】
[0014] 圖1為微生物細胞表面蛋白抗原篩選的實驗流程圖
[0015] 圖2為病原微生物副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原篩選的電泳結果。
[0016] 其中，A、副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原篩選的銀染SDS-PAGE圖譜，包括對照 組和實驗組；B、副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原篩選的實驗組考染SDS-PAGE圖譜。
[0017] 圖3為病原微生物擬態弧菌ATCC33653表面蛋白抗原篩選的電泳結果。
[0018] 其中，A、擬態弧菌ATCC33653表面蛋白抗原篩選的銀染SDS-PAGE圖譜，包括對照 組和實驗組；B、擬態弧菌ATCC33653表面蛋白抗原篩選的實驗組考染SDS-PAGE圖譜。
【具體實施方式】
[0019] 以下實施將結合附圖對本發明的工藝步驟及其突出效果作進一步說明。
[0020] 實施例1
[0021] 1、細菌培養、計數和收集：微生物采用副溶血弧菌VPL4-90,為本實驗室保存菌 種。將VPL4-90接種于LB培養基，28°C搖床培養18h。培養結束后，取2mL菌液進行平板菌 落計數。其余培養液于5000rpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體3次。用生理 鹽水調整其濃度為IO 9CFUAiL。
[0022] 2、抗病原菌抗血清的制備：向制備的VPL4-90菌體懸液加入體積分數0. 025%甲 醒，30°C下作用4h，制成滅活病原，5000rpm轉速IOmin,再用生理鹽水洗漆三次，最后再用 生理鹽水調整其濃度為10 9CFU/mL，注射新西蘭大白兔，每只lmL，對照組注射生理鹽水；每 隔一周注射一次，第四次免疫的第7天處死大白兔取血，靜置；4000rpm離心10min，取出血 清，分裝，_20°C保存。
[0023] 3、微生物細胞表面蛋白抗體的免疫沉淀，5mL的109CFU/mLVPL4-90PBS懸液加入 1 μ LVPL4-90菌體抗血清，5mLVm PBS懸液加入1 μ LVm菌體抗血清振蕩混勻，冰浴，50rpm搖 床過夜，同時各自加陰性血清作為對照。離心收集菌體，PBS洗滌三次，各加入0. 5ml的免 疫沉淀裂解液重懸，超聲破碎（300W，4s，3s，2min)，加入裝有樹脂和用塞子塞住的免疫沉淀 柱中，冰浴，50rpm8h。免疫沉淀柱用免疫沉淀洗滌液洗滌三次，用條件緩沖液洗滌一次，再 用洗脫液孵育5min后洗脫。
[0024] 4、SDS-PAGE電泳和銀染觀察：將收集到的免疫沉底復合物以及陰性對照進行 SDS-PAGE電泳，電泳結束后，用硝酸銀染色，掃描，輸出照片。參見圖1-A，結果顯示，除抗體 重鏈和輕鏈連個條帶外，比較清楚的蛋白條陽性蛋白條帶有8個。
[0025] 5、樣品濃縮和考染質譜：收集10個實驗組的免疫沉淀柱的樣品，用超濾管在 5000rpm30min濃縮10倍后，上樣進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，掃描，輸出照片。參見圖 1-B，除抗體重鏈和輕鏈連個條帶外，比較清楚的條帶有8個。將與銀染一致的6個條帶切 出送到華大基因和上海博苑進行基質輔助激光解吸附的串聯質譜分析和鑒定，鑒定結果見 表1。6個蛋白條帶鑒定出6個蛋白，其中有4個為副溶血弧菌細胞表面的外膜蛋白抗原，2 個是副溶血弧菌胞內蛋白，但在一些研究中表明，從蛋白質組學中分析，一些胞內蛋白亦在 微生物細胞表面發現，其機制原理有待于深入研究。
[0026] 表1副溶血弧菌細胞表面抗原的MALDI-T0F-T0F/MS鑒定
【主權項】
1. 微生物細胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于其步驟如下： 1) 用微生物全細胞免疫沉淀分離出細胞表面蛋白抗體：微生物細胞收集后與微生物抗 血清按體積比抗血清：微生物=1:500加入抗血清冰浴孵育，陰性血清作為對照，離心去除 抗血清細胞表面抗體外其他成份，收集微生物細胞與細胞表面抗體復合物； 2) 將分離出的微生物細胞與細胞表面抗體復合物，超聲波破碎后，用蛋白A/G瓊脂糖 與破碎液冰浴孵育，捕捉抗原抗體復合物，洗滌三次后，洗脫抗原抗體復合物； 3) 洗脫后的抗原抗體復合物SDS-PAGE分析，用銀染觀察結果，確定陽性條帶，再使用 超濾管對抗原抗體復合物進行濃縮后在進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色準備進行質 譜； 4) 免疫原的定性：取出具有免疫原性的全部考染蛋白質條帶，按常規質譜樣品處理方 法進行樣品制備，然后進行質譜和生物信息分析，以確定抗原的蛋白質種類。
2. 如權利要求1所述的微生物細胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于所說的微 生物為細菌，真菌。
3. 如權利要求1所述的微生物細胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于采用微生 物全細胞免疫沉淀將微生物細胞表面蛋白的抗體從抗血清中分離出來。
4. 如權利要求1所述的微生物細胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于超聲破碎 每次3s，間隔4s，超聲2min。
5. 如權利要求1所述的微生物細胞表面抗原的篩選與鑒定方法，其特征在于用銀染觀 察確定免疫原性蛋白條帶，用考馬斯亮藍染色進行質譜分析。
【專利摘要】微生物細胞表面蛋白抗原的篩選與鑒定方法，涉及一種簡便、快捷篩選和鑒定微生物細胞表面蛋白抗原的方法。用微生物全細胞免疫沉淀分離出細胞表面蛋白的抗體，蛋白A/G瓊脂糖捕捉抗原抗體復合物，洗脫得到抗原抗體復合物，再用SDS-PAGE分析免疫沉淀的蛋白。分析免疫原的豐度、抗體對抗原的親和力、免疫原的定性、確定抗原的蛋白種類。建立基于免疫沉淀的蛋白質組學技術，用于高通量篩選具有免疫原性的蛋白質作為多價疫苗的候選靶位。根據免疫原的豐度和抗體對抗原的親和力，能確定其作為疫苗蛋白的可能性。迅速確定某種微生物細胞表面具有免疫原性的蛋白，高效、快速、經濟、實用。方法具有普遍性，不僅可以用于細菌，還可以用于真菌等微生物免疫原的鑒定。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104634979
【申請號】CN201310574194
【發明人】胡忠, 袁傳飛, 倫鏡盛, 張設熙
【申請人】汕頭大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月15日