一類有機酸分子作為胃癌標志物的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明生物檢測技術領域，具體涉及一類有機酸分子作為胃癌標志物的用途。
【背景技術】
[0002] 胃癌作為全球最常見的第二大惡性腫瘤，也是我國最常見的惡性腫瘤之一，占消 化道惡性腫瘤死亡原因的第一位。我國胃癌的發病率約為20/10萬，每年新發胃癌患者40 萬人，死亡人數30萬人，且青年人患胃癌的比例在增加，15%患者為40歲以下年輕人。大多 數胃癌患者多伴有非特異性上消化道不適癥狀，故對有癥狀的人群進行大規模篩查才能提 高胃癌的檢出率，提高篩查效率。然而有研究提示即使在日本其早期胃癌發現率在40%，僅 少部分為利用纖維胃鏡和放射學檢查的大規模篩選時發現，目前絕大多數醫院主要依賴于 X線，B型超聲、內窺鏡檢查以及活組織病理學檢查等對腫瘤進行診斷。以上檢查有些對患 者創傷較大，對儀器設備要求高，難以用于大規模腫瘤檢查或健康體檢。
[0003] 而適用于大規模腫瘤檢測的胃癌最常用的血清腫瘤標記物主要有CA199、CA724 和癌胚抗原CEA等，可檢測到大約15~50%的任何階段的胃癌，對于早期胃癌的檢測率則 降至大約2~11%。這些標志物存在靈敏度和特異度難以統一等問題，難以成為理想的腫 瘤標記物而用于臨床檢測或大規模人群篩查。這現狀給腫瘤的早期分子檢測、療效及預后 評價、復發及轉移監測和生物治療等方面造成一定的困難。因此需要新的適用于大規模篩 選、非侵入性檢測的胃癌檢測標志物。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種適用于大規模篩選、非侵入性檢測的胃癌檢測標志 物，以克服現有臨床檢測腫瘤標記物如CA125、CA199、CA724、AFP、CEA等標志物存在靈敏度 和特異度不統一等問題。
[0005] 為達此目的，本發明公開了一類有機酸分子作為胃癌標志物在制備胃癌檢測試劑 盒中用途，所述有機酸分子為2-甲基-3-氧代丁酸（Butanoic acid，2-methyl-3_oxo)、乙 酰丙酸（Levulinic acid)中1種或它們的組合。
[0006] 在一些實施方式里，所述胃癌檢測試劑盒所適用的檢測樣品為受檢者的尿液樣 本。
[0007] 在一些實施方式里，所述受試者為肝腎功能正常的人，以減少因肝腎功能異常導 致尿液目標分子含量波動，影響結果。
[0008] 在一些實施方式里，所述尿液樣品取自受試者清晨空腹中段尿液，以有利于檢測。
[0009] 在一些實施方式里，所述胃癌檢測試劑盒適用于色譜法、質譜法、色譜一質譜聯用 法，其中色譜法為氣相色譜法（GC)、液相色譜法（LC)、高效液相色譜法（HPLC)，色譜一質譜 聯用法包括氣相色譜一質譜聯用法（GC/MS)、液相色譜一質譜聯用法（LC/MS)、高效液相色 譜一質譜聯用法（HPLC/MS)、氣相色譜一串聯質譜聯用法（GC/MS-MS)、液相色譜一串聯質 譜聯用法（LC-MS/MS )、高效液相色譜一串聯質譜聯用法（HPLC/MS-MS )。
[0010] 另一方面，本發明還公開了一類用于檢測診斷胃癌的生物標志物，其特征在于 所述生物標志物為2-甲基-3-氧代丁酸（Butanoic acid, 2-methyl-3_oxo)、乙酰丙酸 (Levulinicacid)中1種或它們組合。
[0011] 另一方面，本發明還公開了一種胃癌檢測方法，其通過檢測方法對受檢者的尿液 樣本進行上述生物標志物的定量檢測，當受試者所述生物標志物含量高于上述生物標志物 的診斷實驗臨界值時，受試者即可被診斷為胃癌患者。
[0012] 在一些實施方式里，當上述生物標記物質的診斷實驗臨界值分別為：2-甲基-3氧 代丁酸 I. 159999ug/ml、乙酰丙酸 0· 545333ug/ml。
[0013] 在一些實施方式里，所述受試者為肝腎功能正常的人，以減少因肝腎功能異常導 致尿液目標分子含量波動，影響結果。
[0014] 在一些實施方式里，所述尿液樣品取自清晨空腹中段尿液，以有利于檢測。
[0015] 在一些實施方式里，所述檢測方法可選用色譜法、質譜法、色譜一質譜聯用法，其 中色譜法為色譜法為氣相色譜法（GC)、液相色譜法（LC)、高效液相色譜法（HPLC)，色譜一 質譜聯用法包括氣相色譜一質譜聯用法（GC/MS)、液相色譜一質譜聯用法（LC/MS)、高效液 相色譜一質譜聯用法（HPLC/MS)、氣相色譜一串聯質譜聯用法（GC/MS-MS)、液相色譜一串 聯質譜聯用法（LC-MS/MS)、高效液相色譜一串聯質譜聯用法（HPLC/MS-MS)，優選氣相色譜 色譜一質譜法。
[0016] 在一些實施方式里，所述胃癌為早期胃癌。
[0017] 本發明所述有機酸分子作為胃癌標志物，具有很好的靈敏度和特異性，操作簡單、 耗時少，同時本發明所采用檢測樣品為尿液，避免采用組織、血液樣品時帶給患者肉體痛 苦。因此，無論是從患者的依從性還是從檢測結果的正確率看，本發明所述有機酸分子作為 胃癌標志物具有很好的臨床應用價值。
【附圖說明】
[0018] 圖1.各生物標記物混合標準品分離色譜圖。
[0019] 圖2.各生物標記物分子質譜圖，其中A :2_甲基-3氧代丁酸乙酯；B :乙酰丙酸。
[0020] 圖3.各生物標記物診斷胃癌ROC曲線，其中A :2_甲基-3氧代丁酸乙酯；B :乙酰 丙酸。
[0021] 圖4.生物標記物聯合ROC曲線。
[0022] 實施方式
[0023] 以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
[0024] 實施例1 :儀器、試劑、樣品準備及預處理。
[0025] 試劑與儀器：L-2-氯苯丙氨酸、氯甲酸乙酯、吡啶、無水乙醇、氫氧化鈉、氯仿、無 水硫酸鈉、、2-甲基-3氧代丁酸、乙酰丙酸等以上試劑均為分析純，由上海國藥化學試劑公 司生產。KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司生產）。LD5-2A型臺式 離心機(北京京立離心機有限公司）。氣相色譜質譜儀TurboMass(美國Agilent公司7890A GC/5975C MS)自帶NIST2011譜庫和化學軟件工作站。
[0026] 受檢者樣品：隨機采集尿樣200份，其中89份為健康人，111份為因患胃癌要求手 術治療的入院患者(其中早期胃癌33例)。所有受試者肝腎功能均正常，尿樣均取自清晨空 腹中段尿液。胃癌受試者均經電子胃鏡檢查或手術切除病理檢查證實。
[0027] 樣品預處理：將樣本由低溫冰箱取出自然升至室溫后，進行10000rpmX20min，離 心。吸取上清樣品300ul，加蒸饋水300ul、內標物（0. lmg/mL L-2-氯苯丙氨酸)100ul、無水 乙醇40ul、吡啶lOOul，加蓋子進行酯化羧基反應。加氯甲酸乙酯（ECF)50ul，加蓋振蕩10S， 進行氨基反應。超聲加速反應lmin，加入氯仿300ul提取。振蕩30S后3000rpm X5min，離 心。加入100ul7mol/L的NaOH，調節pH = 9~10,再加入氯甲酸乙酯（ECF)50ul，加蓋、振 蕩10S，超聲加速反應lmin，進行二次反應。振蕩30S后，3000rpmX10min，離心。吸去上層 水層，氯仿層加入少量無水硫酸鈉用于脫水，可上機檢測。
[0028] 實施例2 :儀器掃描方法設定
[0029] 掃描方式為全離子掃描結合選擇離子（SM離子）監測掃描。SM離子設定為 2-甲基-3氧代丁酸74m/z，乙酰丙酸99m/z，樣品首先在氣相色譜毛細管柱（Agilent J&W DB-5MS，30mX0. 25mmX0. 25 μ m)上分離。并采用程序升溫氣相色譜技術，起始溫度為80°C， 以10°C /min速率升至140°C，再以4°C /min速率升至280°C，并保持2min。分離過程中逐 漸增加柱溫，使所有組分都能在各自的最佳溫度下洗脫。質譜儀電子轟擊能量為70eV，離子 源溫度為200°C，進樣口溫度為260°C，載體氣為氦氣，柱流速為lml/min。所有數據在質荷 比30 - 550m/z下收集。每次進樣掃描停留時間為100ms，溶劑延遲時間為3. 5min。檢測 到的樣品中物質使用標準物質質譜圖定性。樣品中物質的濃度使用外標法定量。
[0030] 實施例3 :標準品質譜圖及標準曲線的建立。
[0031] 配制生物標記物標準品混合溶液，依次稀釋成10個濃度梯度，按照實施例1方法 預處理，實施例2方法進樣，結果如表1。各生物標記物標準曲線線性良好，以此作為定量 基礎。各生物標記物保留時間見圖1 (序號分別為1 :2_甲基-3氧代丁酸乙酯；2 :乙酰丙 酸），相應質譜圖見2,以此作為定性基礎。
[0032] 表1各目標分子保留時間（RT)、標準曲線線性范圍（Linear range)及線性擬合度 (r2)
【主權項】
1. 一類有機酸分子作為胃癌標志物在制備胃癌檢測試劑盒中的用途，所述有機酸分子 為2-甲基-3-氧代丁酸、乙酰丙酸中之一或它們的組合。
2. 如權利要求1所述用途，其特征在于有機酸分子為2-甲基-3-氧代丁酸、乙酰丙酸。
3. 如權利要求1所述用途，其特征在于所述胃癌檢測試劑盒所適用的檢測樣品為受檢 者的尿液樣本。
4. 如權利要求3所述用途，其特征在于所述受試者為肝腎功能正常的人。
5. 如權利要求3所述用途，其特征在于所述尿液樣品取自受試者清晨空腹中段尿液。
6. 如權利要求1所述用途，其特征在于所述胃癌檢測試劑盒適用于色譜法、質譜法、色 譜一質譜聯用法。
7. 如權利要求1所述用途，其特征在于所述色譜法為氣相色譜法（GC)、液相色譜法 (LC)、高效液相色譜法（HPLC)。
8. 如權利要求1所述用途，其特征在于所述色譜一質譜聯用法為氣相色譜一質譜聯用 法（GC/MS )、液相色譜一質譜聯用法（LC/MS)、高效液相色譜一質譜聯用法（HPLC/MS )、氣相 色譜一串聯質譜聯用法（GC/MS-MS)、液相色譜一串聯質譜聯用法（LC-MS/MS)、高效液相色 譜一串聯質譜聯用法（HPLC/MS-MS )。
9. 一類用于檢測診斷胃癌的生物標志物，其特征在于所述生物標志物為2-甲基-3-氧 代丁酸、乙酰丙酸中1種或它們組合。
【專利摘要】本發明生物檢測技術領域，具體涉及一類有機酸分子作為胃癌標志物的用途。本發明公開了一類有機酸分子作為胃癌標志物在制備胃癌檢測試劑盒中的用途，所述有機酸分子為2-甲基-3-氧代丁酸、乙酰丙酸中之一或它們的組合。本發明所述有機酸分子具有很好的靈敏度和特異性，操作簡單、耗時少，同時本發明所采用檢測樣品為尿液，避免采用組織、血液樣品時帶給患者肉體痛苦。因此，無論是從患者的依從性還是從檢測結果的正確率看，本發明所述有機酸分子作為胃癌標志物具有很好的臨床應用價值。
【IPC分類】G01N27-62
【公開號】CN104634857
【申請號】CN201310556922
【發明人】于穎彥, 陳逸南, 朱正綱
【申請人】上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月11日