一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明為一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，結合DNA滾 環復制和核-殼結構的納米粒子拉曼信號探針來實現雙重信號放大。
[0002]
【背景技術】
[0003] 表面增強拉曼檢測技術具有制樣過程比較簡單、非入侵和無損等獨特的優點。表 面增強拉曼檢測手段作為高靈敏的檢測技術，越來越受到了科學界的關注，廣泛應用于特 定序列DNA、檢測蛋白質、體內原位檢測、單堿基錯配等生物分析中。由于其光學透明性，使 用二氧化硅殼在表面增強拉曼散射（SERS)為基礎的生物傳感應用提供了許多優勢，能夠穩 定存在于環境介質中，并改善生物相容性。
[0004] 我們報告了一種新的層層組裝法，由二氧化硅、金納米粒子（AuNP)和SERS信號分 子組成。金納米粒子因為它們通過粒子結構的針孔的表面電磁場定位能力從單個顆粒強增 強效果，這種層層組裝方法的提出，使得硅膠封裝AuNP標簽表現出較強的表面增強拉曼光 譜信號以及出色的多路復用功能。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是：結合DNA滾環復制和核-殼結構的納米粒子拉曼信號探針來實 現雙重信號放大檢測凝血酶。在磁珠表面結合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成 雙鏈DNA探針。在凝血酶存在下，與固定在磁珠表面的雙鏈DNA探針結合，釋放其中的一條 鏈。留在磁珠上的探針作為引物發生滾環復制反應，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結構 納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，通過檢測拉曼信號實現凝血酶的檢測。
[0006] 本發明采用的技術方案為： 制備了金納米粒子（AuNP)，通過層層組裝的方法將羅丹明異硫氰酸酯封裝在AuNP和Si02殼之間。由于一個納米粒子可封裝大量的拉曼信號分子，增大了拉曼信號。制備的核 殼結構的納米粒子表面修飾兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減少交叉反應。
[0007] 用磁珠作為載體，在磁珠表面結合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙 鏈DNA探針。凝血酶與其適體結合釋放到溶液中，磁珠表面留下單鏈DNA探針作為引物。加 入鎖扣式DNA，在T4DNA連接酶和Phi29DNA聚合酶作用下，留下的DNA鏈發生滾環復制 反應，生成長鏈DNA。與所制備的核-殼結構納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，從 而檢測拉曼信號（附圖1)。
[0008] 其具體步驟如下： 1)通過檸檬酸鈉還原HAuC14的方法制備了納米金，通過層層組裝的方法將羅丹明異 硫氰酸酯封裝在AuNP和Si02殼之間。再與比例為10:1的DNA鏈結合形成生物條碼探針。
[0009] 2)通過羧基與氨基的共價鍵將一端帶有氨基的探針信標固定在羧基功能化的磁 性納米顆粒上，再與凝血酶適體雜交，獲得識別探針。
[0010] 3)將目標凝血酶分子與識別探針混合，在磁珠表面進行雜交后，釋放其中的一條 鏈。留在磁珠上的探針作為引物發生滾環復制反應，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結構 納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針。
[0011] 4)在外加磁場的作用下將多余的信號納米粒子探針清洗干凈，檢測拉曼信號。利 用凝血酶的標準溶液獲得檢測的工作曲線，從工作曲線進行凝血酶實際樣品的分析。
[0012] 本發明與現有技術相比，具有以下特點： 本發明用制備的核殼結構納米探針包含大量拉曼信號分子，結合DNA滾環復制形成利 用雙重信號放大，通過拉曼光譜檢測，建立了一種高靈敏的拉曼光譜檢測凝血酶的方法。相 對于現有的檢測方法，有以下特點： (1)通過表面增強拉曼光譜檢測，操作簡單，靈敏度高。
[0013] (2)設計了一種核殼結構納米探針，包含大量拉曼信號分子，可通過金增強作用進 行拉曼信號放大。制備的核殼結構的納米粒子表面修飾兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減 少交叉反應。
[0014] (3)DNA滾環復制可形成具有重復堿基序列的DNA長鏈，一個靶分子可以結合大量 納米粒子探針。
[0015] (4)雙重信號放大提高了檢測靈敏度。
[0016] 四、【附圖說明】 圖1.拉曼光譜檢測凝血酶方法的示意圖 五、【具體實施方式】 實施例1 :核-殼結構的拉曼信號標記納米粒子制備 在快速攪拌下，將混合拉曼標簽（羅丹明異硫氰酸酯）6yL(1.0XKT4M)加入到3mL的金膠溶液，使該混合物平衡反應20分鐘。接下來，加入3mLPAA溶液Ug.L4)，用0. 1M 的NaOH調節pH值至7.0,在劇烈攪拌下逐滴加入，并攪拌3小時。聚合物包封的納米 球的溶液，進行離心分離兩次，以除去過量的聚合物分子，并再分散到水中。加偶聯劑3 -氨基丙基三甲氧基硅烷加入到該溶液中至終濃度為3XKT7M，平衡反應20分鐘。然后二 氧化硅殼長大使用改進的St€ober's方法，即通過使用氨作為催化劑在醇溶液中的正硅 酸乙酯（TE0S)的水解和縮合。簡單地說，依次加入17mL異丙醇和200yL氨水（25%)。在 溫和攪拌下，加入8yL正硅酸乙酯，把它分成四個部分平均每個部分1小時。正硅酸乙 酯添加完成后，使該混合物進行反應12小時，在4500rpm的轉速下，將混合物離心分離 15分鐘，清洗三次。最后，析出的染料編碼拉曼標簽再分散到水中。
[0017] 實施例2 :核-殼結構的拉曼信號標記納米粒子的DNA功能化 把200yL3-三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐（TEPSA，200mM)加入到400yL上 述核-殼結構水溶液中，反應過夜。羧基修飾的核-殼結構離心洗滌三次，分散到200yL PBS(0? 1M，pH7.4)中以供以后使用。把 100yL含有 50mMNHSand200mMEDC溶液 加入到核-殼結構的溶液中來激活-C00H基團。孵育2小時后，加入50yL的氨基修飾的 生物條碼探針溶液，靜置過夜后，將溶液離心，并用PBS洗滌三次，得到洗滌適配體官能化 的顆粒，將其分散在800yL的PBS溶液，放在4°C下以備將來使用。
[0018] 實施例2 :磁珠表面探針的固定 用0. 1M，咪唑-HC1緩沖溶液（pH6. 8, 3X100yL)將50yL羧基修飾的磁珠的懸浮液 (10mg?mL-1)洗滌三次。然后把0. 1M的EDC溶液（100yL)加入到該MB溶液中，將混合 物在室溫下震蕩反應20分鐘，以激活磁性納米顆粒的羧酸酯基團。然后加入將氨基修飾的 捕獲探針和凝血酶適體鏈（1.0X10-10mol?L，溶液，將所得混合物于37 °C下震蕩反應 12小時。磁性分離后，用0.1MPBS緩沖液把磁性納米顆粒洗滌三次。洗滌后的MNP/Si 再分散到200yL的PBS溶液。
[0019]實施例3 :拉曼檢測凝血酶 在10yL探針修飾的磁性納米顆粒分散液中滴入10yL不同濃度的凝血酶溶液反應 40分鐘。加入10yL鎖扣式DNA(10nM)，然后加入T4DNA連接酶Buffer(400U/凡，10 禮！'1^8-11(：1，？117.4，含1〇11111%(：12、1〇111101'1'和11111六了？），室溫下孵育30分鐘，最后 加入T4DNA連接酶（10X)和去離子水混合，在22 °C條件下反應1小時。鎖扣DNA連接成 環狀，并把修飾在磁珠上的DNA(Si)捕獲。磁性分離以除去未被捕獲的鎖扣DNA，加入Phi 29 0嫩聚合酶的緩沖溶液（40禮1'1^8 11(：1，？117.5，含5〇11111((：1、1〇11111%(：12和5 1111 (NH4)2S04)、Phi29DNA聚合酶（0.5A，10U/Z〇，dNTPs(5A，1 禮)，在 37。。下反應 1 小時。反應完成后將反應液加熱到65°C10分鐘至Phi29聚合酶失活以此終止RCA反應。 記錄不同濃度凝血酶溶液與樣品的拉曼信號，獲得凝血酶檢測的工作曲線，并求出樣品中 的凝血酶濃度。
【主權項】
1. 一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，其特征在于：制備了一 種攜帶有大量拉曼信號分子的核-殼結構的生物條碼作為拉曼信號探針；在凝血酶存在 下，與固定在磁珠表面的雙鏈脫氧核糖核酸（以下簡稱DNA)探針結合，釋放其中的一條鏈； 留在磁珠上的探針發生滾環復制反應，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結構納米探針上的 DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，從而檢測拉曼信號。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的方法在磁珠表面結合滾環復制 和核-殼結構的納米粒子信號探針來實現雙重信號放大。
3. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的方法用磁珠作為載體，在磁珠 表面結合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙鏈DNA探針；凝血酶與其適體結合 釋放到溶液中，磁珠表面留下單鏈DNA探針作為引物；加入鎖扣式DNA，在T4 DNA連接酶和 Phi 29 DNA聚合酶作用下，留下的DNA鏈發生滾環復制反應，生成長鏈DNA。
4. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于制備了金納米粒子（AuNP)，通過層層 組裝的方法將羅丹明異硫氰酸酯封裝在AuNP和Si02殼之間；由于一個納米粒子可封裝大 量的拉曼信號分子，增大了拉曼信號。
5. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于制備的核殼結構的納米粒子表面修飾 兩種DNA鏈，形成生物條碼探針，減少交叉反應。
6. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于檢測靶標為凝血酶。
【專利摘要】本發明涉及一種基于納米粒子信號探針的拉曼放大檢測凝血酶的方法，結合DNA滾環復制和核-殼結構的納米粒子拉曼信號探針來實現雙重信號放大。在磁珠表面結合把氨基修飾的DNA，凝血酶適體與其雜交形成雙鏈DNA探針。在凝血酶存在下，與固定在磁珠表面的雙鏈DNA探針結合，釋放其中的一條鏈。留在磁珠上的探針作為引物發生滾環復制反應，生成長鏈DNA，與所制備的核-殼結構納米探針上的DNA雜交，捕獲拉曼信號探針，通過檢測拉曼信號實現凝血酶的檢測。該方法具有廣泛的適用性，適體與靶蛋白質結合引起的DNA分子機器過程相對比較簡單，因此經過改變靶蛋白適體的序列的方法，來間接的檢測相應的靶蛋白，此方法可以得到較為廣泛的應用。
【IPC分類】G01N21-65
【公開號】CN104614358
【申請號】CN201410741458
【發明人】李雪梅, 王琳琳, 羅捷
【申請人】臨沂大學
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月9日