一種基于dart-ms/ms測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法
【技術領域】
[OOOU 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種采用實時直接分析離子源值ART)測定 家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法。
【背景技術】
[0002] 丙氨酸是蠶絲中的主要成分，其含量在30% W上，而家蠶的主要食物桑葉中丙氨 酸的含量很低，家蠶為了給蠶絲蛋白提供更多的丙氨酸，通過體內的谷丙轉氨酶將其他氨 基酸轉化為丙氨酸。所W家蠶體內的谷丙轉氨酶活力影響著蠶絲蛋白的合成，進而影響蠶 絲的產量。因此，開發快速、高效、靈敏的新型檢測技術來檢測家蠶中谷丙轉氨酶的活力對 于蠶絲產量的評估和該個蠶業的發展有著重要的意義。
[0003] 傳統的谷丙轉氨酶測定方法為賴氏法該方法采用谷氨酸與丙酬酸鋼作用形 成丙氨酸鋼及a-酬戊二酸，反應完成后，殘余的丙酬酸鋼與2, 4 一二硝基苯阱作用，生成二 硝基苯蹤，在堿性條件下呈棟色。然后采用分光光度計進行檢測。但是該方法存在W下問 題，首先反應底物酬戊二酸容易與2, 4-二硝基苯阱反應生成紅棟色的苯腺硝釀，干擾檢測 結果，需要采用其他繁瑣的方法進行校正。同時，2, 4-二硝基苯阱為易燃易爆物，在存儲方 面要求較高。另外，采用賴氏法反應后生成的硝基苯阱和苯腺硝釀處理困難，極易造成環境 污染。最后，該方法所采用的檢測器為分光光度計，檢測靈敏度較低。
[0004] 實時直接分析值irectAnalysis in Real Time)簡稱DART,是一種熱解析和離子 化技術，DART能在幾秒鐘內分析存在于氣體、液體、固體或材料表面的化合物，從而對樣品 無損耗定性和定量分析。在本發明中，采用DART作為離子源檢測谷丙轉氨酶的活力在研究 中尚屬首次。通過我們的檢測方案，可直接檢測反應生成物丙氨酸，與傳統的賴氏法相比， 在檢測過程中不需要生成物再與其他成分進行顯色反應，簡化了檢測實驗步驟，在檢測過 程中也避免了 2, 4-二硝基苯阱的使用，解決了生產物干擾和環境污染的問題。同時該方 法，相較于傳統的賴氏法分光光度計檢測，其檢測靈敏度更高、重現性更好、定量更加快速。 因此，該方法比傳統的賴氏檢測法具有明顯的優勢，適于代替賴氏檢測法進行推廣應用。
[0005] [1]劉限，李青峰，許方國，王英春.昨蠶不同品種中、后部絲腺細胞數目及谷丙 轉氨酶活性的測定分析.蠶業科學，2003, 29 (2) : 200-202.
[0006] [2]徐鏡波，張淑.月纏魚血清谷丙轉氨酶活性和活性抑制的測定.松迂學 刊，1991,4,4-8.
[0007] [3]陳晨，黃峰，舒秋艷，張麗，周艷萍.共輛亞油酸對草魚生長、肌肉成分、谷 草轉氨酶及谷丙轉氨酶活性的影響.水生生物學報，2010, 34 (3) ,647-651.
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【發明內容】
[0009] 解決的技術問題；本發明提供一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力 的方法，在測定中W DART作為離子源，可直接檢測生成物丙氨酸，定量更加靈敏準確，同時 測定反應中不需要加入2, 4-二硝基苯阱的使用，避免了干擾和環境污染。
[0010] 技術方案：一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，包括如下步 驟；（1)DART-MS/MS檢測；采用DART離子源和S重四級桿質譜在正離子模式或負離子模式 下對丙氨酸進行檢測，載氣為氮氣，加熱溫度為200-500°C，Gridvoltage范圍為100-400V， 氣壓為0. 2-0. 5MPa，檢測方式為反應監測模式（SRM)，碰撞電壓為0-200eV，碰撞氣壓為 0-5mTorr ; (2)谷丙轉氨酶活力單位：谷丙轉氨酶活力定義為ImL的酶液在38±rC，水浴 lOmin，生成1 ymol丙氨酸的量作為1個酶活力單位，活力單位為U/mL ; (3)谷丙轉氨酶活 力計算公式：
[0011]
【主權項】
1. 一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，其特征在于包括如下步 驟： (1) DART-MS/MS檢測；采用DART離子源和S重四級桿質譜在正離子模式或負離子 模式下對丙氨酸進行檢測，載氣為氮氣，加熱溫度為200-500°C，Grid voltage范圍為 100-400V，氣壓為0. 2-0. 5MPa，檢測方式為反應監測模式（SRM)，碰撞電壓為0-200eV，碰撞 氣壓為〇-5mTorr ; (2) 谷丙轉氨酶活力單位：谷丙轉氨酶活力定義為ImL的酶液在38±rC，水浴lOmin， 生成1 y mol丙氨酸的量作為1個酶活力單位，活力單位為U/mL ; (3) 谷丙轉氨酶活力計算公式：
(4) 谷丙轉氨酶活力測定： 巧憤組：將家蠶后部絲腺組織液與5mmol/L的谷氨酸溶液、4mmol/L丙酬酸鋼、抑= 7. 4的磯酸鹽緩沖液按照1:1:1:2的體積比例進行充分混合，在38 + rC恒溫水浴鍋中反應 lOmin，放入70°C水浴30min-lh，將得到的反應液按照步驟（1)中所給條件進行DART檢測； 空白組：采用超純水代替測定組中的家蠶后部絲腺組織液液，其他條件與測定組一致 進行反應，然后將得到的反應液按照步驟（1)中所給條件進行DART檢測。
2. 根據權利要求1所述一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，其特 征在于所述加熱溫度為500°C。
3. 根據權利要求1所述一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，其特 征在于所述Grid voltage范圍為100V。
4. 根據權利要求1所述一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，其特 征在于所述氣壓為0. 5MPa。
5. 根據權利要求1所述一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，其特 征在于所述碰撞電壓為lOeV。
6. 根據權利要求1所述一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法，其特 征在于所述碰撞氣壓為1. 5mTorr。
【專利摘要】一種基于DART-MS/MS測定家蠶中谷丙轉氨酶活力的方法,包括如下步驟：(1)DART-MS/MS檢測；(2)谷丙轉氨酶活力單位；(3)谷丙轉氨酶活力計算公式；(4)谷丙轉氨酶活力測定。本發明采用DART-MS/MS作為檢測手段，可直接檢測酶反應過程中的生成物丙氨酸，該方法具有檢測快速、檢測靈敏度高，抗干擾能力強和定量準確等特點。本發明在檢測過程中不需要加入2,4-二硝基苯肼避免了污染和干擾。該方法操作簡便、檢測快速，便于推廣和應用。
【IPC分類】G01N27-62
【公開號】CN104597106
【申請號】CN201410814288
【發明人】武國華, 張東陽, 唐博志, 李龍
【申請人】江蘇科技大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月24日