一種快速檢測鵝掌楸屬植物花蜜中單糖的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化學分析技術領域，具體是利用毛細管電泳法分離并檢測鵝掌楸屬植 物花蜜中葡萄糖和果糖的含量。
【背景技術】
[0002] 木蘭科鵝掌楸屬（Liriodendron)植物現存2個種，一種是北美鵝掌楸 (L.tulipiferaLinn.);另一種為鶴掌楸〔L.chinense(Hemsl.)Sarg.〕。鶴掌楸屬花兩性， 呈杯狀，與葉同時開放或稍后開放；花被片9,外輪萼片3片綠色，向外開展；內兩輪花瓣6 片直立。鵝掌楸與北美鵝掌楸花顏色相差很大，鵝掌楸花黃綠色，近基部有黃色縱條紋，而 北美鵝掌楸花翠綠色，近基部有橙黃色或橙紅色色帶。鵝掌楸與北美鵝掌楸的花蜜分泌量 差異也很大，北美鵝掌楸單日花蜜分泌量為ml級，而鵝掌楸單日花蜜分泌量為ul級。因此， 在北美洲，北美鵝掌楸為重要的蜜源植物。
[0003] Muller(1883)、Faegri和vanderPijl(1966)認為植物花蜜是吸引昆蟲傳份的 重要誘物之一，也是研宄植物與昆蟲協同進化的重要材料。植物花蜜中含有許多昆蟲所需 的營養物質，而糖類是其中最重要也是含量最高的營養物質。研宄表明，花蜜中的多糖主要 是蔗糖，單糖主要是葡萄糖及果糖，而對于那些開放式花朵的植物，己糖在花蜜的糖類中的 比率占主導性位置。因此花蜜中糖類的檢測分析對于探討植物繁殖生態學的研宄有著重大 的意義。但是由于一般植物花蜜分泌量一般只有ul?ml級，并且含有大量的脂類，酚類等 有機小分子物質。而傳統的化學分析檢測方法檢出限高，操作復雜，耗時長。
[0004] 對于單糖的分析，在采用高效液相色譜分析時，因為糖類本身在紫外區域基本沒 有吸收峰，而且也無熒光。所以一般采用示差折光檢測器檢測。但示差折光檢測器靈敏度 低，檢出限僅為l〇_6g/l水平級。而且高效液相色譜本身具有分析時間長，樣品用量大，糖柱 成本高的缺點。如果采用氣相色譜法測定，由于單糖的沸點較高，難以氣化，需要先轉化為 揮發性的衍生物才可以進行測定。
[0005] 近年來，利用毛細管電泳儀檢測各類生物分子（核酸、蛋白質、糖類）成為一種新 的選擇。毛細管電泳具有分離效率高、分析時間短、進樣量少、檢測限低和多模式等特點。隨 著毛細管電泳技術的不斷完善，以及檢測手段的多樣化，應用毛細管電泳技術分離各類生 物分子也逐漸增多。但迄今為止，還未有利用毛細管電泳技術分離、檢測植物花蜜中單糖種 類與含量的報道。
[0006] 目前，常用的毛細管電泳儀檢測器有UV檢測器、LIF檢測器，以及PAD檢測器。其 中，UV檢測器具有價格低廉、適用性廣、操作簡便的優點，是應用最廣的毛細管電泳儀檢測 器。適用于UV檢測器的單糖的檢測方法一般分為：衍生反應后直接測定法，不經衍生化反 應直接測定和間接測定。而最常用的是衍生反應后直接測定。對于還原性單糖，衍生反應 大都基于還原氨基化反應，也就是分子的還原端與帶電的發色或熒光基團的伯胺反應成為 希夫氏堿，再利用硼氰氫化鈉還原成仲胺，常用的方法有2-氨基吡啶法、CBQA〔3-(4_羧 基甲酰基）_2_喹啉甲醛〕法、PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）法、ANTS(8-氨基、苯 基-1，3, 6-三磺酸）法。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是利用毛細管電泳快速分離檢測鵝掌楸屬植物花蜜 中的葡萄糖和果糖的含量。該方法克服了以往采用的高效液相色譜法所具有的手段復雜， 分析時間長，樣品需求量大的缺點，而且大大節省了檢測成本。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0009] 將花蜜樣品采用濾膜過濾后，在水浴鍋內進行衍生化處理，然后利用毛細管電泳 儀分離樣品中葡萄糖和果糖，并用UV檢測器定性檢測，最后使用外標法對葡萄糖和果糖進 行定量。
[0010] 其中，所述的濾膜，其孔徑為〇. 45ym。
[0011] 其中，在水浴鍋內進行衍生化處理的方法為：將濾液和衍生試劑按照體積比 1:1?5:1 (優選5:1)混合，密封后在60?80°C(優選80°C)水浴鍋內水浴0.5?2h(優 選lh) 〇
[0012] 其中，所述的衍生試劑配方為：143. 2mga-萘胺、35mgNaBH3CN、450y1無水甲醇 和41y1冰乙酸混合，按此配方等比例放大或者縮小。
[0013] 具體衍生步驟如下：
[0014] (1)配制衍生液：稱取143. 2mga-萘胺和35mgNaBH3CN，溶于450y1無水甲醇中， 再加入41yL冰乙酸，混勻。放入冰箱中待用。
[0015] (2)花蜜的柱前衍生：取100ul的花蜜樣品，加入20ul的衍生液置于10ml離心管 中，用封口膜密封。放入80°C水浴鍋中水浴lh。然后加入三氯甲燒和水各lml，充分混勻 后，10000r/min離心5min，重復3次，去上層水相待測。
[0016] 其中，毛細管電泳的反應體系為：選擇50umX46cm的石英毛細管（實際長度 40cm)，以pH9. 5、75mmol/l的Na2B407 ? 10H20 水溶液為背景緩沖液，0? 5psi進樣 8s，UV= 214nm，20kv的電壓下電泳20min〇
[0017] 有益效果：本發明獲得了一種快速分離測定花蜜中葡萄糖、果糖的方法。其優點在 于以下幾個方面：
[0018] 1、使用0. 45um的濾膜過濾樣品，可以有效的去除新鮮花蜜中的微生物和細菌。避 免對電泳結果造成干擾。
[0019] 2、如果電泳背景緩沖液pH值過低，會導致單糖分子無法正常電離，則無法得到 電泳結果。如果電泳背景緩沖液pH值過高，又會降低電泳分離度。使用pH= 9. 5的 Na2B407 ? 10H20緩沖液既可以使單糖分子正常電離，又保持了較高的分離度。
[0020] 3、電壓也是影響分離度的重要因子之一。高電壓雖然會減低電泳時間，但是卻會 降低分離度，低電壓反之。使用20kv的電壓既保持了高分離度，又可以快速地得到電泳結 果。
[0021] 4、大幅度的縮減了樣品的檢測時間，從采樣到獲得檢測結果只需2h。
[0022] 5、本發明方法檢出限為0. 028-0. 320mg/ml，精密度，重現性實驗RSD均小于5%。
【附圖說明】
[0023] 圖1北美鵝掌楸花蜜毛細管電泳圖像
[0024] 圖2鵝掌楸花蜜毛細管電泳圖像
【具體實施方式】
[0025] 根據下述實施的實例，可以更好地理解本發明。實例所描述的內容僅用于說明本 發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0026] 實施例1 :利用毛細管電泳檢測北美鵝掌楸及鵝掌楸花朵花蜜中葡萄糖、果糖含 量
[0027] (1)儀器與藥品：毛細管電泳儀（BeckmanP/ACEMDQ電泳儀）、UV檢測器、毛細 管、0. 45um濾膜、北美鵝掌楸花蜜、鵝掌楸花蜜（均采于江蘇句容市下蜀鎮南京林業大學下 蜀實習林場鵝掌楸種源試驗林）、葡萄糖、果糖、Na2B407 ? 10H20、a-萘胺、NaBH3CN、甲醇、冰 乙酸（試劑均為分析純）
[0028] (2)樣品前處理：將北美鵝掌楸及鵝掌楸的新鮮花蜜稀釋1倍后用0. 45um濾膜過 濾，將濾液放入4°C冰箱待用。
[0029] (3)衍生試劑配制：用電子天平分別稱取143. 2mga-萘胺和35mgNaBH3CN，溶于 450y1無水甲醇中，然后加入41y1冰乙酸。混勻后放入冰箱待用。
[0030] (4)衍生化處理：分別取100y1花蜜濾液，加入20y1衍生試劑置于10ml離心管 中。封口膜密封，放入80°C水浴鍋中水浴lh。然后加入三氯甲燒和水各lml，充分混勻后， 10000r/min離心5min，重復3次。去上層水相定容至5ml，待測。
[0031] (5)電泳檢測：分別取1. 5ml待測樣品檢測，設置電壓為20kv，在pH= 9. 5、 75mmol/lNa2B407 ? 10H20水溶液背景下，0. 5psi進樣8s，電泳檢測20min得到圖1、2,然后 重復測定7次，以檢測重現性。
[0032] (6)本發明方法檢出限為0. 028-0. 320mg/ml，精密度、重現性實驗RSD均小于5%。
[0033] (7)花蜜中葡萄糖、果糖定量計算。首先將葡萄糖和果糖標準品進行衍生化處理 (方法同步驟4)，然后按表1配制標準曲線溶液。分別平行測定3次（條件同步驟5)。
[0034] 表1標準曲線溶液配制（單位：ml)
【主權項】
1. 一種快速檢測鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，將花蜜樣品采用濾膜 過濾后，在水浴鍋內進行衍生化處理，然后利用毛細管電泳儀分離樣品中葡萄糖和果糖，并 用UV檢測器定性檢測，最后采用外標法對葡萄糖和果糖進行定量。
2. 根據權利要求1所述的快速檢測鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，所 述的濾膜，其孔徑為0.45 ym。
3. 根據權利要求1所述的快速檢測鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，在 水浴鍋內進行衍生化處理的方法為：將濾液和衍生試劑按照體積比1:1?5:1混合，密封后 在60?80°C水浴鍋內水浴0. 5?化。
4. 根據權利要求3所述的快速檢測鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，所 述的衍生試劑配方為；143. 2mg a -蒙胺、35mg NaBH3CN、450 y 1無水甲醇和41 y 1冰己酸混 合，按此配方等比例放大或者縮小。
5. 根據權利要求1所述的快速檢測鶴掌揪屬植物花蜜中單糖的方法，其特征在于，毛 細管電泳的反應體系是，W pH9. 5、75mm〇Vl的化284〇7 'lO&O水溶液為背景緩沖液，0. 5psi 進樣8s，UV = 214nm，20kv的電壓下電泳20min。
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測鵝掌楸屬植物花蜜中單糖的方法，屬于化學分析領域。與利用高效液相色譜檢測植物花蜜成分的傳統方法相比，本方法具有快速、高效、進樣量少、低成本的特點。本發明利用α-萘胺衍生法，以pH9.5、Na2B4O7·10H2O水溶液為背景緩沖液，在20kv電壓，0.5psi進樣8s的條件下，20min即可分離花蜜中葡萄糖、果糖；采用外標法測定葡萄糖、果糖的含量。
【IPC分類】G01N27-447
【公開號】CN104535638
【申請號】CN201510017319
【發明人】李火根, 呂劍南, 石瑞
【申請人】南京林業大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月13日