專利名稱：磷酸酶靶向毒素的測定的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測通常由藻類微生物(Microalgae)，如藍細菌(cyanobacteria)和腰鞭毛藻類(dinoflagellate)產生的磷酸酶-靶向毒素的試驗方法。
腰鞭毛藻通常是單細胞、光合作用、二鞭毛的藻類。某些海洋腰鞭毛藻類(如雙甲藻亞種(Prorocentrum sp.)和溝鞭藻亞種(Dinophysis sp.))產生磷酸酶靶向的毒素，如岡田酸和溝鞭藻毒素，如果被人攝入，會導致胃腸道疾病。因此如果這些藻類污染食用蛤貝的居住地時，會引起問題。
藍細菌(常常稱作藍綠藻)，也是光合作用的生物，主要是水生的，生活在沿海水域、外海和大洋、河流、湖泊和地下水中，但也可是陸生的，見于落葉層和土壤中。
藍細菌的許多種類，特別是微囊藍細菌亞屬(Microcystis sp.)、藍束絲藍細菌亞屬(Aphanizomenon sp.)、魚腥藍細菌亞屬(Anabena sp.)、節球藍細菌亞屬(Nodularia sp.)和顫藍細菌亞屬(Oscillatoria sp.)產生毒素，如果被人或其它哺乳動物、鳥類、甚至魚類攝取，會引起疾病。這些毒素的攝取通過兩種主要途徑，飲用污染的水或食用污染的海鮮。
藍細菌和腰鞭毛藻類產生兩類特別的毒素。神經毒素(如類毒素和貝類毒素)導致受害者癱瘓，因此該癥狀常常稱為癱瘓性貝類中毒。這些神經毒素引起的中毒極少，但證明是致命的。
另一種類型的毒素通過與體細胞中的蛋白磷酸酶結合并影響它們對蛋白質底物脫膦酸的能力而滅活該酶。這些毒素相對常見，一些(如腰鞭毛藻類毒素岡田酸和溝鞭藻毒素)可引起惡心、嘔吐和腹瀉，因此癥狀常稱為腹瀉性貝類中毒。一些蛋白質磷酸酶靶向毒素是腫瘤促進劑，和這些毒素接觸會致癌。其它毒素，如藍細菌毒素微藻素和節球藻素是肝毒性的，能引起肝臟損傷。磷酸酶靶向毒素中最多見的是微藻素、節球藻素和岡田酸。
腰鞭毛藻毒素中毒的最常見來源是貝類和魚肝，而藍細菌毒素中毒的最常見原因是污染的飲用水和/或海濱浴場水。然而，貝類和水中都可同時藏匿藍細菌毒素和腰鞭毛藻毒素。藻類毒素中毒的最常見來源是貽貝(mussel)，因為它們食用產毒藻類后聚集毒素。其它貝類，如牡蠣、蛤和扇貝也可受感染。
另外，民用供水，特別是如果來自地下水，可被藍細菌污染，因而提供了毒素攝入的直接途徑。
對于食用藻類和藍細菌，作為高蛋白保健食品和輔助食品給予了某種關注。關于監測收集的藻類或藍細菌中是否有產毒菌株的污染還沒有官方標準，由于在魚腥藍細菌和藍束絲藍細菌屬中發現了許多產毒菌株，而特別擔心這些藍細菌屬的營銷。
除了與藻類毒素接觸引起的短期不適、醫藥開支、貝類產業的商業成本、工作時間縮短等以外，已發現上述磷酸酶靶向毒素微藻素和節球藻素是腫瘤促進劑，據信在臨床或亞臨床水平反復接觸這些毒素，尤其是結合大量飲酒或吸煙，會(尤其是肝臟)導致癌癥。
目前，檢測和定量測定藻類和藍細菌的磷酸酶靶向毒素存在許多不同方法。一種標準方法涉及磨碎貽貝或其它磷酸酶靶向毒素的可能來源物，并用磨碎的貽貝組織的提取物注射小鼠。然后根據小鼠存活率確定磷酸酶靶向毒素污染的存在和水平(Stabell等，(1992)，食品化學毒物學30(2)139-44)。很清楚，這是一種費時、粗糙和昂貴的評估食品安全性和質量控制的方法。
另一種方法涉及測定外源加入的磷酸酶酶活性的減弱，從而檢測貝類中磷酸酶靶向毒素的存在。這也涉及磨碎貽貝或其它貝類組織，釋放干擾加入的磷酸酶的內源磷酸酶，損害試驗的靈敏度和準確性(Sim和Mudge(1994)于藍細菌毒素的檢測方法，Codd，Jefferies，Keevil和Potter編，皇家化學協會)。
因此，對能定量或定性測定水、貝類和/或可食用藻類或藍細菌產品中磷酸酶靶向毒素的存在，尤其是藻類和藍細菌的磷酸酶靶向毒素存在的快速、靈敏和便宜的試驗和方法有很大的需要。特別是，需要一種足夠簡單，能由相對不熟練或非技術人員(如魚販或水公共衛生人員)執行的，而且不需要實驗設備或專門設施進行該檢測的試驗法。
因此，根據第一個方面，本發明提供了一種試驗法，來檢測抑制蛋白磷酸酶的磷酸酶靶向毒素，包括使具有固定化配體的固相載體接觸(i)懷疑受毒素污染的樣品和
(ii)非固定化配體，其中所述固定化配體能與至少一種所述毒素、所述非固定化配體或所述毒素和所述非固定化配體的復合物結合，所述非固定化配體能與至少一種所述固定化配體、所述毒素或所述毒素和所述固定化配體的復合物結合，所述毒素、所述非固定化配體或所述毒素和所述非固定化配體結合所述固定化配體的比例依賴于所述樣品的毒素含量，而且其中所述固定化配體當不與所述毒素復合時、當與所述毒素和所述非固定化配體的復合物復合時，或與所述非固定化配體復合時，能產生可直接或間接檢測信號，或所述非固定化配體當未復合時或復合時能產生可直接或間接檢測的信號，從非結合組分中分離出結合組分；和直接或間接檢測水溶液中與固定化配體結合的(結合組分)或非復合的(非結合組分)非固定化配體；其中可以分別、依次或同時將(i)和(ii)施加于固相載體，如果分別或依次加入，可不論先后進行。
因此在一個實施例中，毒素檢測可能涉及檢測不能直接或間接與固定化配體結合的非固定化配體。當非固定化配體與毒素競爭結合固定化配體時，高水平的未結合配體表明了高毒素濃度。當非固定化配體能和結合于固定化配體的毒素復合時，高水平的未結合配體表明低水平的毒素濃度。
在另一個實施例中，毒素檢測涉及檢測直接或間接與固定化配體結合的非固定化配體。當毒素和非固定化配體競爭結合固定化配體時，高水平的結合配體表明低水平的毒素濃度。當非固定化配體能和結合于固定化配體的毒素復合時，高水平的結合配體表明高水平的毒素濃度。
然而，本發明的方法優選包括一種檢測磷酸酶靶向毒素，特別是藻類和藍細菌毒素的競爭性結合試驗，其中存在于樣品中的毒素分子與非固定化配體競爭數量有限的固定化配體的結合位點，而且所述樣品中存在的毒素的測定與非固定化配體與固定化配體的結合位點結合或不結合的程度相關。
本文所用的術語“檢測”、“測定”或“評估”包括定量測定(指獲得樣品中存在的磷酸酶靶向毒素的量或濃度的絕對值)，和半定量測定和質量評估或測定。可測定存在的毒素水平或量的指數、比率、百分數或摩爾指標，或獲得樣品中存在或不存在這種毒素的簡單指示。在本發明的一個優選方面，獲得了對毒素存在進行簡單的存在或不存在或半定量的測定。關于這點，毒素“不存在”可能指毒素濃度低于試驗的檢測極限，或在認為安全或可耐受的水平以下。
本發明試驗方法中所用的樣品可以是任何懷疑接觸了產磷酸酶靶向毒素的微生物，或接觸了磷酸酶靶向毒素的樣品，例如海水、淡水、地下水、取自湖、井、溪、水庫的水、家用供水設施的水，或可以是從貝類提取的水分，例如用吸管吸取或抽提的水或浸過貝類的水，或可以是食品、食物添加劑、營養補充劑、從藻類或藍細菌生產的其它藥物或類似產品。當貝類含有淡水時(如牡蠣中)，該試驗可以將一種吸水物質(固相載體)蘸入該水中。或者，可在打碎或打開貝殼后，簡單的將一種吸水物質按在貝類的濕肉上。
在本發明的一個優選方面，調查的樣品是貝類的表面或游離水分。
所有種類的貝類，例如扇貝、對蝦、蛤貝和牡蠣對本發明的試驗方法敏感，但在一個優選方面中，貝類是蛤貝。在另一個優選方面，調查的樣品是從這些貝類生活的棲息地取得的水，而在另一個優選方面，樣品是取自家用供水設施的水。
用于分析的樣品可以基本上未處理的形式使用，但可在分析前任選的用已知方法過濾或加水、緩沖液或其它水性介質稀釋，并可在分析前通過冷藏或冷凍儲藏或保存。
可在本發明的方法中使用毒素結合配體，作為固定化或非固定化配體，例如抗體，它可以是多克隆或單克隆的，或抗體片段，如F(ab)、F(ab’)2或F(v)片段。這些抗體或抗體片段可以是單價的或二價的，并可通過雜交瘤技術產生，或合成，作為重組DNA技術或化學合成的產物。可采用例如單鏈抗體或其它抗體衍生物或模擬物。抗體或抗體片段可針對磷酸酶靶向毒素的任何表位、組分或結構，如果合適的話。另外，可使用對毒素(如小有機分子或肽(如寡肽或多肽))具有親和力，能和毒素特異性結合的化合物，例如選自配位化學，或噬菌體展示文庫或DNA或RNA的特異性結合序列的特異性結合劑。
然而本發明的優選毒素結合配體是蛋白磷酸酶，甚至更優選的是在試驗方法中使用結合性配體蛋白磷酸酶2A(pp2A)。
類似的，本發明方法中所用的第二種配體可以是任何與第一種配體競爭性或非競爭性結合毒素的配體。另外，第二種配體可以是任何與毒素競爭結合第一配體的配體。第一種配體優選是毒素結合性配體，更優選是蛋白磷酸酶。這兩種配體之一必須固定化，而另一種必須是非固定化的，而且配體之一必須是可直接或間接檢測的。在一個優選例中，非固定化配體應符合能競爭性抑制毒素與固定化配體結合，并可直接或間接產生可檢測信號的功能要求，例如，它可以是能用任何已知形式的直接或間接信號形成分子標記的分子。這些配體也可采取抗體形式，可以是多克隆或單克隆、或F(ab)、F(ab’)2或F(b)片段等抗體片段。這些抗體或抗體片段可以是單價或多價的，還可以由雜交瘤技術產生或用重組DNA技術或化學合成經合成而來。例如，可使用單鏈抗體或其它抗體衍生物、或模擬物和小型有機分子、選自組合或噬菌體顯示文庫的肽、寡肽和多肽。抗體或抗體片段可針對磷酸酶靶向毒素分子或與磷酸酶靶向分子適當結合的配體的任何表位、組分或結構。另外，可使用對毒素或對結合毒素的配體(如)具有親和力，例如能與毒素或與結合毒素的配體特異性結合的化合物，例如選自配位化學或噬菌體展示文庫的的特異性結合劑，或DNA或RNA的特異性結合序列。
配體之一通常將攜帶的報道基團可以是一直接可檢測基團，如金屬溶膠(如金溶膠)、發色團或熒光團(如花青、酞菁、部花青、三苯基甲基、equinance(馬菁)等的結合位點，見應用化學論題，紅外吸收發色團、M.Matsuoka編，Plenum Press，New York，NY，1990，應用化學論題，染料的化學和應用，Waring等，Plenum Press，New York，NY，1990，和熒光探針和研究化學手冊，Haugland，Molecular Probes，Inc.1996，和放射性標記、酶、磁性顆粒，濁度誘導劑等的結合位點，或它可已攜帶這樣的可直接檢測的基團。當報道基團是由固定化配體攜帶時，它通常是可直接檢測基團的結合位點，當配體復合時，結合位點被活化或更通常失活。
優選報道基團由非固定化配體攜帶。
在本發明的優選例中，非固定化配體是標記的酶、或發色團或熒光團標記的肽(如選自節球藻素、微藻素LC或微藻素YR或可另選的岡田酸的肝毒素)。
雖然用放射性標記是可能的，但由于試驗主要由外行用戶就地使用，最好采用能提供肉眼可見信號的報道基團，如發色團、熒光團、磷光基團、濁度誘導劑、氣體放出誘導劑等。
當信號形成基團是一種能與配體之一上的結合位點結合的材料時，在分離結合和未結合組分后，它將方便的和結合或未結合的組分恰當接觸。
一般當信號來自結合組分時，最好用水等沖洗底物，以在配體被檢測或產生并檢測前沖走未結合的組分。
本發明可用于任何產生磷酸酶靶向毒素的藻類和藍細菌物種。但特別適用于藍細菌的產毒株，如銅綠微囊藍細菌(Microcystis aeroginosa)、魚腥藍細菌、節球藍細菌(Nodularia spuragena)和水華魚腥藍細菌(Anabena flus-aque)或藻類。因此例如，微囊藍細菌亞屬產生毒素微藻素LR和微藻素YR，節球藍細菌產生毒素節球藻素，雙甲藻亞屬產生毒素岡田酸。
本發明方法測定的毒素也可能是藻類或藍細菌產生的磷酸酶靶向毒素，但在優選方面中肽毒素是肝毒素(其中微藻素和節球藻素最常見)或岡田酸。
因此，就其最普遍的意義而言，本發明的方法涉及將懷疑含有磷酸酶靶向毒素污染的樣品與毒素結合配體和報道分子同時、依次或以不同順序分別接觸，該報道分子能和所述毒素競爭配體結合位點，在和調查的樣品接觸前，該報道分子可任選的和該結合配體結合，并測定和固相載體結合或游離于溶液中的報道分子。
評估報道物之前將結合組分和未結合組分用任何合適方法，如沉淀、離心、過濾、層析方法、毛細管作用或簡單抽提分開。固相可以是量桿的形式或任何已知形式的固相基質，如聚合物或磁性珠(如Dynabead(購自Dynal AS))。在本發明的優選例中，固定毒素結合配體的固相載體是Dynabead形式。
根據本發明的具體實施例，可用結合或未結合組分評估報道分子，但優選用結合組分評估。
可用任何已知方法，例如將配體和任何熟知的固相載體或基質結合或偶聯，來固定化配體。固相載體和基質是目前廣泛使用或提議用于分離或固定化的那些，例如，固相載體可以采取顆粒、片層、凝膠、濾紙、膜、纖維或毛細管或微量滴定條、試管或孔板等，常規用玻璃、二氧化硅、乳膠、聚合材料或磁珠制造。將配體和固相載體結合的技術在本領域中是熟知的，在文獻中被廣為描述。在本發明的優選例中，磷酸酶靶向毒素結合配體固定化的固相載體是Dynabeads形式的。
本發明的試驗方法的優點在于它無需復雜實驗設備即可進行，而且可由相對不熟練或不熟練的人員進行。因此，該實驗方法適用于家庭、商店和野外，而且它可快速和方便的進行，而無需繁重勞動或危險的化學品。
在本發明試驗方法中的獨特優點是靈敏度非常高，當分析其中毒素水平非常低的樣品，例如在測試飲用水或評估磷酸酶靶向毒素可能的污染時，這是非常重要的。通常該試驗能檢測皮摩爾濃度，如低至10pM的毒素。該試驗常規用于檢測范圍在15-560pM之內的毒素。
本發明試驗方法相對于現有技術的另一個優點是，該試驗不受可能存在于分析樣品中(特別是如果樣品取自貝類)的內源磷酸酶的影響。
在本發明的一個實施例中，一種蛋白磷酸酶被固定在固相載體上，固定化的磷酸酶和調查的樣品接觸，樣品中存在的任何磷酸酶靶向毒素則與固定化磷酸酶結合。加入和毒素競爭磷酸酶結合位點的報道分子源。報道分子在一定程度上將毒素分子從結合位點上置換下來，視毒素分子和報道分子的相對濃度而定。報道分子結合的程度能確定調查的樣品中存在的毒素。優選的報道物/標記包括放射性標記、發色團(包括熒光團)和酶(產生發色或熒光產物)。還考慮閃爍臨近標記和產生可測量光散射變化的標記。
在另一個實施例中，固相載體固定化的報道-封阻磷酸酶分子和調查的樣品接觸，樣品中存在的磷酸酶靶向毒素和磷酸酶結合的報道分子競爭，將它們從固相載體上置換下來，進入水溶液中，其程度和樣品中存在的毒素成比例。接著評估依舊與固相載體結合的報道分子量，能確定調查的樣品中存在的毒素。
從另一個方面看，本發明提供了一種檢測藍細菌或藻類磷酸酶靶向毒素的試劑盒，根據本發明，所述試劑盒包括一種固相載體，其上固定有一種配體；一種非固定化配體，優選在水溶液中或和固定化配體形成復合物；所述固定化和非固定化配體都不含可直接或間接檢測的分子，一種報道分子能與所述固定化和非固定化配體之一結合，并產生可檢測信號，優選所述可檢測分子或信號不需實驗設備而可直接讀出。
在一個優選例中，本發明的試劑盒包含一種固相載體，其上固定有磷酸酶靶向毒素結合配體；一種能競爭性抑制磷酸酶靶向毒素和所述毒素結合配體的結合，而且無需實驗設備即可產生可檢測信號的報道分子；能競爭性抑制藍細菌毒素和所述蛋白磷酸酶的結合的金溶膠標記的肽肝毒素分子。
本發明試劑盒的另一個特別優選的實施例包含磁性可置換性聚合物微球，在其上固定有一種蛋白磷酸酶；能競爭性抑制藻類毒素和所述蛋白磷酸酶結合的金溶膠標記的岡田酸分子。
在另一個優選方面，試劑盒的使用涉及將一種多孔纖維素底物(上面固定有毒素結合配體，并用競爭性結合發色團(或熒光團等)標記的配體浸潤)蘸取水或貝類液的樣品，溫育飽和的底物一段預定時間(從樣品或預定體積的樣品取出)，通過用無毒素的水沖洗底物，或使底物在預定體積的無毒素的水中浸泡一段時間，來除去未結合的標記配體，并觀察底物或浸泡用水的顏色。最好底物固定在載體上，優選用標準顏色標記的載體，能比較底物或浸泡用水的顏色，以確定毒素濃度或指示毒素濃度是否高于或低于一個或多個閾值。
本發明現在將用下列非限制性實施例闡明材料微藻素YR、微藻素LR、岡田酸、節球藻素、花萼海綿誘癌素A和互變霉素購自Calbiochem(San Diego，CA)。從Amersham(Little Chalfont，UK)獲得了無載體的Na125I和[γ-32P]ATP。白蛋白(RIA級)、乙酸銨、氯亞明T、二甲基亞砜(DMSO)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、EDTA、EGTA、甘油、Hepes、組蛋白II-AS、偏亞硫氫酸鈉和胰蛋白酶抑制劑(大豆)購自Sigma(St Louis，MO)。乙腈和三氟乙酸(TFA)購自Rathburn(Walkerburn，Scotland)。特別純化的蛋白磷酸酶2A購自UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)或根據Resink等(歐洲生物化學雜志，133455-461(1993))純化。
微藻素YR的碘化如Ciechanover等所述(PNAS 771365-1368(1980))，使用氯亞明T，用ImCi無載體的Na125I(37MBq)碘化微藻素YR(10微克)。碘化反應后，用Sep-PakPlus柱(Waters，Milford，MA)按照Runnegar等的方法(Toxicon 24506-509(1986))將[125I]微藻素YR與碘分離。將[125I]微藻素YR加到3×250mm Inertsil ODS-2 HPLC柱(購自Chrompack(Raritan，NJ))上，用乙腈梯度洗脫。
競爭性結合試驗在含0.5ml的50mM Hepes(pH7.2)、1mM EDTA、0.3mM EGTA、1mM DTE、5mM MnCl2、0.5mg/mlBSA和0.2mg/ml胰蛋白酶抑制劑的緩沖液中進行競爭性結合試驗。在試驗中加入0-100nM的以100％DMSO稀釋的藻類毒素，最終濃度為10％DMSO。加入35pM的[125I]微藻素YR(1ci/13ng)。最后加入蛋白磷酸酶2A(30pm)，該反應混合物在冰上培育過夜。用SephadexG-50細膠(購自Pharmacia(Uppsala，Sweden))在Bio-Rad(Hercules，CA)的0.7×15cm柱中進行凝膠過濾，將游離的[125I]微藻素YR與結合于蛋白磷酸酶2A的[125I]微藻素YR分開。在4℃進行的分離中使用了含1mM EDTA和0.3mM EGTA的50mM Hepes緩沖液。收集與蛋白磷酸酶2A結合的含[125I]微藻素YR的組分，用閃爍計數定量放射性。在過量加入微藻素LR(1μM)的對照反應中檢測非特異性結合的[125I]微藻素YR。
實施例1蛋白磷酸酶2A與磁珠偶聯(直接與磁珠或通過磷酸酶的生物素化)。然后將固定化蛋白磷酸酶與樣品和放射性標記的毒素(如[125I]微藻素YR)混合。通過磁力使反應混合物與固定化蛋白磷酸酶相分離。用閃爍計數檢測與蛋白磷酸酶(磁珠)結合的放射性。和蛋白磷酸酶結合的放射性標記量以樣品中磷酸酶結合毒素的函數下降。
實施例2蛋白磷酸酶2A與磁珠偶聯(直接與磁珠或通過磷酸酶的生物素化)。然后將固定化蛋白磷酸酶與樣品和與著色珠偶聯的毒素混合。通過磁力使反應混合物與固定化蛋白磷酸酶相分離。目測或用低倍顯微鏡(如Nikon TMS)檢測與蛋白磷酸酶(磁珠)結合的著色珠。和蛋白磷酸酶(磁珠)結合的著色珠數量以樣品中磷酸酶結合毒素的函數下降。
實施例3蛋白磷酸酶2A與磁珠偶聯(直接與磁珠或通過磷酸酶的生物素化)。然后將固定化蛋白磷酸酶與樣品和固定在攜帶有固定化酶的珠上的毒素混合。該酶在與發色或發熒光底物一起適當培育，能產生可檢測的產物(著色或熒光)。通過磁力將反應混合物與固定化蛋白磷酸酶相分離。用分光光度計或熒光光度計分別測量和蛋白磷酸酶(磁珠)結合的顏色或熒光。和蛋白磷酸酶(磁珠)結合的顏色/熒光量以樣品中磷酸酶結合毒素的函數下降。
實施例4閃爍接近試驗
生物素化蛋白磷酸酶并將其固定在用鏈霉親和素和閃爍材料(如FlashPlatePlus鏈霉親和素SMP103，補充了NEN)預包被的孔內。在孔內加入樣品和[125I]微藻素YR。用閃爍計數檢測和固定化蛋白磷酸酶結合的[125I]微藻素YR量。
實施例5在各種毒素存在下[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A結合的抑制測試的化合物1IC502(pM)節球藻素15微藻素LR17微藻素YR75岡田酸 100花萼海綿誘癌素A 251互變霉素5621將測試的化合物和[125I]微藻素YR、蛋白磷酸酶2A一起如上所述培育。
2IC50值代表獲得[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A結合50％抑制所需的濃度。這些值根據圖3確定。數據代表至少3個獨立實驗的平均值。
實施例6和蛋白磷酸酶試驗比較，外源化合物對競爭性結合試驗的影響測試的化合物1％活性2競爭性結合試驗 蛋白磷酸酶試驗2mM ATP 103.34±0.2 9.8±3.40.5mM ATP 101.6±1.7 29.8±5.60.05mM NaPPi101.4±4.1 14.2±1.250mM NaF101.5±1.9 7.7±1.45mM NaF 102.0±3.3 62.6±0.41mg/ml酪蛋白98.64±4.5 3.44±0.20.02mg/ml酪蛋白 98.9±6.1 33.3±4.95mg/ml組蛋白2A 91.9±1.8 1.4±0.10.002mg/ml組蛋白95.2±4.7 63.6±4.00.5M NaCl 41.2±0.7 44.4±1.6海水 34.8±0.4 ND10％海水 87.3±0.4 ND10％DMSO 72.8±2.3 97.9±3.310％MeOH 73.9±0.5 87.4±4.110％乙腈 90.4±5.4 88.2±2.70.4％Triton X-100 122.3±1.060.2±5.70.4％Nonidet P-40 106.0±2.061.1±1.30.4％CHAPS 90.9±9.9 138.0±34.41在冰上預先保溫蛋白磷酸酶2A和溶于50mM肝素(pH7.2)的化合物或單獨和緩沖液(對照)30分鐘。用磷酸組蛋白的去磷酸化如所述測量磷酸酶活性。％活性是相對于對照反應。
2競爭性結合試驗中的活性代表相對于單用緩沖液，競爭性結合試驗中的活性代表在溶于緩沖液的外源化合物存在下，蛋白磷酸酶2A和[125I]微藻素YR結合的能力。數據代表至少三個獨立實驗的平均值±SEM。
實施例7節球藻素和微藻素LR結合試驗的靈敏度[125I]微藻素YR結合的抑制(％)1毒素(M) milliQ水 飲用水海水 海水1/102節球藻素1E-10 88.37±0.31 88.75±0.16 72.18±0.8267.24±0.665E-11 36.37±2.28 36.12±1.04 48.47±0.7952.98±1.98微藻素-LR 1E-10 84.91±0.42 86.97±1.12 73.31±1.2046.41±5.975E-11 13.87±3.16 12.85±0.88 49.34±3.8238.61±1.491將節球藻素和微藻素LR以所示濃度溶于MilliQ水、飲用水或海水中。如上所述測試了300微升等份的這些溶液與[125I]微藻素YR競爭與蛋白磷酸酶2A的結合的能力。
2以milliQ水稀釋的1/10的海水。
數據表示成平均值±SEM。
實施例9用HPLC分析和蛋白磷酸酶結合試驗測定貝類抽提物中岡田酸當量抽提物1HPLC分析的OA當量2結合試驗的OA當量2(μg/g肝胰腺)(nM) (nM)100 85200 45300 70442480 210051.2 748 75560.8 496 8051從挪威沿海收集的蛤貝肝胰腺制備抽提物。
2用HPLC分析抽提物的岡田酸當量。
3抽提物以100％DMSO稀釋，如上所述用競爭試驗測試它們和[125I]微藻素YR競爭與蛋白磷酸酶2A結合的能力。將數據與溶于100％DMSO的岡田酸標準曲線比較，確定岡田酸等價物的濃度。
實施例9附圖
附1是檢測蛋白磷酸酶結合毒素的競爭性結合試驗的示意圖。
將蛋白磷酸酶2A和[125I]微藻素YR以及另一種針對蛋白磷酸酶2A的毒素一起培育。毒素和[125I]微藻素YR競爭與磷酸酶結合。加入大量毒素導致[125I]微藻素YR和磷酸酶的結合減少，反之亦然。達到結合平衡后，用凝膠過濾層析從游離[125I]微藻素YR中分離出與蛋白磷酸酶2A結合的[125I]微藻素YR。收集含有與磷酸酶結合的[125I]微藻素YR組分，用閃爍計數確定放射量。
附2顯示了遞增量的不同藻類毒素對[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A結合的作用。
在35pM[125I]微藻素YR(1Ci/13ng)和圖中所示0-100nM不同的藻類毒素存在下，培育蛋白磷酸酶2A(30pM)。用凝膠過濾層析分離與蛋白磷酸酶2A結合的[125I]微藻素YR，并用閃爍計數確定放射性。每條曲線代表至少3個獨立實驗的平均值。
附3顯示了競爭性結合試驗中微藻素LR結合的IC50。
用未結合[125I]微藻素YR(Co-Cx)和結合的[125I]微藻素YR(Cx)之比對微藻素LR濃度作圖，表示[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A的結合。Co代表顯示不存在微藻素YR時，結合的[125I]微藻素YR的量，而Cx代表在各種微藻素LR濃度存在下，結合的[125I]微藻素YR量。
附4表示在過量微藻素LR存在下，和蛋白磷酸酶2A結合的[125I]微藻素YR的穩定性。
在[125I]微藻素YR(100pM)存在下，培育蛋白磷酸酶2A(1nM)1小時。在時間0時，在反應混合物中加入微藻素LR(2μM)。如所述，用凝膠過濾和閃爍計數測定指定時間點和蛋白磷酸酶2A結合的[125I]微藻素YR量。曲線代表了4個獨立實驗的平均值。
權利要求
1.一種用于測定抑制蛋白磷酸酶的磷酸酶靶向毒素的試驗方法，其特征在于，該方法包括使一種上面固定有固定化配體的固相載體接觸(i)懷疑被毒素污染的樣品和(ii)非固定化配體，其中所述固定化配體能與所述毒素、所述非固定化配體或所述毒素和所述非固定化配體的復合物中的至少一種結合，而所述非固定化配體能和所述固定化配體、所述毒素或所述毒素和所述固定化配體的復合物中的至少一種結合，與所述毒素、所述非固定化配體或所述毒素和所述非固定化配體結合的所述固定化配體的比例取決于所述樣品的毒素含量，和其中當未復合時、當所述毒素復合時、當所述毒素和所述非固定化配體的復合物復合時、或當所述非固定化配體復合時，所述固定化配體能產生可直接或間接檢測的信號；或當未復合時或復合時，所述非固定化配體能產生可直接或間接檢測的信號。將未結合組分與結合組分相分離；和直接或間接測定與固定化配體結合的非固定化配體，即結合組分，或水溶液中未復合的非固定化配體，即非結合組分；其中可以分別、依次或同時將(i)和(ii)施加于固相載體，而且如果分別或依次進行，可不論先后進行。
2.如權利要求1所述的試驗方法，其特征在于，所述磷酸酶靶向毒素是由藻類或藍細菌產生的。
3.如權利要求1或2所述的試驗方法，其特征在于，要測定的毒素是肝毒素或岡田酸。
4.如權利要求1-3任一項所述的試驗方法，其特征在于，存在于樣品中的毒素分子與非固定化配體競爭數量有限的固定化配體的結合位點，而且存在于所述樣品中的毒素是根據非固定化配體與固定化配體的結合位點結合或不結合的相對程度測定的。
5.如權利要求1-4任一項所述的試驗方法，其特征在于，該方法測定磷酸酶靶向毒素的存在與否。
6.如權利要求1-5任一項所述的試驗方法，其特征在于，調查的樣品是貝類的表面或游離水、從這些貝類生活的棲息地獲得的水或家用供水設施的水。
7.如權利要求1-6任一項所述的試驗方法，其特征在于，固定化和/或非固定化配體是抗體或抗體片段。
8.如權利要求1-7任一項所述的試驗方法，其特征在于，毒素結合配體是一種蛋白磷酸酶。
9.如權利要求8所述的試驗方法，其特征在于，所述蛋白磷酸酶是結合配體蛋白磷酸酶2A。
10.如權利要求1-9任一項所述的試驗方法，其特征在于，固定化或非固定化的配體攜帶一報道分子。
11.如權利要求10所述的試驗方法，其特征在于，所述非固定化配體攜帶一種報道分子。
12.如權利要求11所述的試驗方法，其特征在于，非固定化配體是標記的肽肝毒素或標記的岡田酸。
13.如權利要求12所述的試驗方法，其特征在于，肝毒素選自節球藻素、微藻素LC或微藻素YR。
14.如權利要求1-13任一項所述的方法，其特征在于，固相載體是一種蘸棒或固相基質。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述固相基質是聚合物珠或磁性珠。
16.一種根據本發明檢測磷酸酶靶向毒素的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含一種固定有一種配體的固相載體；一種非固定化配體，優選在水溶液中或與固定化配體復合的；所述固定化和非固定化配體都不含可直接或間接檢測的分子，一種報道分子能夠和所述固定化和非固定化配體之一結合，并產生可檢測信號，優選所述可檢測分子或信號不需實驗設備可直接讀出。
17.如權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述磷酸酶靶向毒素由藻類或藍細菌產生。
18.如權利要求16和17所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含一種其上固定有磷酸酶靶向毒素結合配體的固相載體；一種能競爭性抑制磷酸酶靶向毒素和所述毒素結合配體的結合，而且無需實驗設備即可產生可檢測信號的報道分子。
19.如權利要求16-18任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含其上固定有一種蛋白磷酸酶的磁性可置換的聚合物微球；能競爭性抑制藍細菌毒素和所述蛋白磷酸酶結合的金溶膠標記的肽肝毒素分子。
20.如權利要求16-18任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含固定有一種蛋白磷酸酶的可磁性置換的聚合物微球；能競爭性抑制藍細菌毒素和所述蛋白磷酸酶結合的金溶膠標記的岡田酸分子。
21.權利要求16-20任一項所述的試劑盒用于測定磷酸酶靶向毒素的用途。
全文摘要
本發明提供了一種試驗方法,測定抑制蛋白磷酸酶的磷酸酶靶向毒素,包括使其上固定有固定化配體的固相載體接觸:(i)懷疑被毒素污染的樣品,和(ii)非固定化配體,其中所述固定化配體當未復合時、當與所述毒素復合時、當與所述毒素和所述非固定化配體的復合物復合時、或與所述非固定化配體復合時,能產生可直接或間接檢測的信號,或所述非固定化配體能在未復合時或復合時,產生可直接或間接檢測的信號,將結合組分與非結合組分分開;并直接或間接檢測與固定化配體(結合組分)結合的非固定化配體、或水溶液中的未復合的配體(非結合組分)。
文檔編號G01N33/553GK1338051SQ99814568
公開日2002年2月27日 申請日期1999年11月11日 優先權日1998年11月11日
發明者S·O·多史凱蘭德, M·H·塞爾, K·E·弗拉德馬克 申請人:巴依奧桑斯實驗室聯合股份有限公司