專利名稱：人源化的特異于人4－1bb的抗體和含有它的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及特異地結合4-1BB受體蛋白，優選人的4-1BB受體蛋白的人源化抗體。這種人源化的抗體可被用作診斷試劑或被用于配制給病人施用的藥物組合物。
發明的背景免疫系統變化的多樣性，并且由于B細胞和T細胞隨機地特異表達各種成份，該成份特異的與許多包括自身在內的組分結合。因此，體內必須建立自身-免疫耐受機制以區別自體和非自體的決定簇以避免自身反應。但所有的機制都有被破壞的危險。自我-識別機制也不例外，已經證明許多疾病是由于自身免疫產生大量的自身抗體和自身反應T細胞而引起的。
至少有30多種疾病是自身免疫引起的或與自身免疫有關。此類疾病有類風濕性關節炎，尋常天皰瘡，腎小球腎炎，惡性貧血，甲狀腺炎和系統性紅斑狼瘡。在韓國，每一百人中就有一人患類風濕性關節炎。
目前主要的治療手段是組織移植以替換患病的器官。在大多數病例中，移植成功的最大障礙是對移植組織的免疫反應適應。當移植的組織含有有核細胞時，T細胞立即與經常引起移植器官排斥的高度多態性主要組織相容性基因復合體分子(MHC)反應。供體和受體MHC類型的配型會增加移植的成功率。只有當供體和受體有親緣關系，才可能有相當好的配型。但在這種情況下，其它遺傳位點的差異也會引起排異反應。
對于自身免疫病和移植排異，人們可以利用或控制免疫系統，抑制不希望的免疫反應。目前臨床上常用幾種不同的免疫抑制劑，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、環磷酰胺、強的松、環胞A、FK506(tacrolimus)，抗淋巴細胞球蛋白(ALG)和抗胸腺球蛋白(ATG)。最近，已經利用抗體高度的特異性用于治療，以抑制特異免疫反應。該類抗體的靶分子可以分成兩組，第一組包括在淋巴細胞表面表達的分子，如CD3，CD4，IL-2R，CDw52和ICAM-1。另一組主要是細胞因子，如TNF-α，和IL-6。其中一些抗體是有效的，已作為藥物出售。
然而，目前使用的免疫抑制劑都有一個共同的問題，即與免疫反應無關的細胞或正常細胞都會受到這些藥物的影響。會引起不可避免的嚴重的副作用。因此，需要一種對活化的免疫細胞是特異的，具有最好的免疫抑制活性而沒有有害副作用的免疫抑制劑。
雖然鼠類的單克隆抗體已被廣泛用作診斷試劑，但已經證實只有極少數情況下可以用它們進行治療。以下三種原因可能限制其應用；第一，多次證明鼠類的單克隆抗體對于人類一般會引起人抗這些分子的免疫反應。人抗小鼠抗體(HAMA)反應針對兩個不同的區域。抗可變區反應稱作抗-個體基因型反應，該反應能阻斷抗原與鼠類抗體結合的活性。抗恒定區的反應為抗-同型反應，該反應阻斷抗體的效應子功能。HAMA反應不僅阻斷了作為新藥物的抗體功能，而且也與鼠類抗體形成免疫復合物，結果引起一些副作用，并降低了抗體的半衰期。第二，在體內，即使沒有形成免疫復合物，鼠類抗體的半衰期也比人的抗體半衰期短。第三，鼠類抗體Fc區產生的效應子功能比人的抗體弱或沒有。上述所有因素都會降低鼠類單克隆抗體的療效，而且在人類免疫治療中普遍存在的問題也是由于異源性的單克隆抗體引起的。
為了避免鼠類單克隆抗體固有的不需要的特性，我們利用基因工程的手段將鼠類抗體余人抗體區域重組，開發了“人源化的抗體”。采用這種替換策略是由于免疫系統對自身抗原會產生免疫耐受性，很難對人的抗原如細胞表面分子產生人的抗體。這種人源化的抗體含有互補性決定區(CDR)區域，只有極少數幾個氨基酸是鼠類的，而其余的全部是人的抗體的結構。
發明概述4-1BB是活化的T細胞表面表達的一類附帶分子(Kwon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861963(1989)；Pollok等，J.Immunol.151771(1993))，是與腫瘤壞死因子受體(TNFR)相關的一種膜蛋白(Malett等，Immunol.Today 12220(1991))。4-1BB分子量為55KD，是一個均一的二聚體。此外，4-1BB與細胞內蛋白激酶p561ck結合。已顯示4-1BB蛋白介導細胞外向細胞內的信號傳導途徑。(Kim等，J.Immunol.1511255(1993))。
人的4-1BB基因已經從人外周血活化的T-細胞mRNA制備的cDNA文庫中分離出來(Goodwin等，Eur.J.Immunol.232631(1993))。人的4-1BB氨基酸序列與小鼠4-1BB 60％同源(Kwon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA861963(1989))，表明這些序列是高度保守的。氨基酸序列分析表明，4-1BB與CD40，CD27，TNFR-I，TNFR-II，Fas和CD30一起屬于神經生長因子超家族(Alderson等，Eur.J.Immunol.242219(1994))。當單克隆抗體與小鼠T-細胞表面表達的4-1BB結合時，抗-CD3 T-細胞活性增加許多倍(Pollok等，J.Immunal.150771(1993))。
4-1BB與幾種抗原遞呈細胞所表達的高親和性配體結合，例如巨噬細胞和活化的B細胞(Pollok等，J.Immunol.150771(1993))；Schwarz等，Blood 851043(1995))。4-1BB與其配體的相互作用產生共刺激信號而引起T細胞的活化和生長(Goodwin等，Eur.J.Immunol.232631(1993)；Alderson等，Eur.J.Immunol.242219(1994)；Hurtado等，J.Immuno.1553360(1995)；Pollok等，Eur.J.Immunol.25488(1995)；DeBenedette等，J.Exp.Med.181985(1995)。這些觀察提示4-1BB在調節由T細胞介導的免疫反應中起著很重要的作用(Ignacio等，Nature Med.3682(1997))。
發明者已經用雜交瘤的方法產生了小鼠單克隆抗體，該抗體是特異地與活化的T細胞表面表達的人的4-1BB(h4-1BB)結合(韓國公開專利號no.96-37064)。為了尋找只對活化的T淋巴細胞特異而沒有任何副作用的免疫抑制劑，本發明者利用只抗活化的T細胞表達的4-1BB的小鼠單克隆抗體構建了人源化的單克隆抗體(韓國公開專利號no.96-37064)。這種人源化的單克隆抗體與4-1BB有很高的親和性。將這種人源化的抗4-1BB單克隆抗體用于非-人類的靈長類治療沒有產生抗-抗體反應，相反卻產生了很強的免疫抑制活性。
本發明的一個目的是提供一種人源化的單克隆抗體，該抗體特異與4-1BB結合，特別是與人的4-1BB(h4-1BB)有很高的親和性。本發明的人源化抗體與人的4-1BB具有很高的親和性，而且其序列與人的抗體十分相似。由于與本發明抗體特異結合的4-1BB受體蛋白好像參與免疫系統的激活，因此該產品可以有效地用于治療自身免疫病或作為一種免疫抑制劑抑制移植排異反應。由于本發明的抗體十分類似于人的抗體，因此可以作為藥物用于治療而沒有相反的副作用，如人抗小鼠抗體反應。
本發明的另一個目的是提供一種藥物組合物，它含有人源化的抗h4-1BB單克隆抗體。該藥物組合物用于治療自身免疫病或作為一種免疫抑制劑、防止移植排異是十分有效的。如類風濕性關節炎可能是由于4-1BB受體的異常活性造成的，這種組合物治療類風濕性關節炎就特別有效。
本發明的另一目的是提供一種診斷試劑，用于診斷由于4-1BB受體蛋白過高或過低活性而引起的免疫機能障礙。
附圖簡要說明
圖1，人源化抗人4-1BB抗體，Hz4B4-1，Hz4B4-2重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區的氨基酸序列比較。這些序列與小鼠單克隆抗體4B4-1-1，人的抗體VHM17750和人的抗體VL X82934的氨基酸序列進行了比較。
圖2，PCR方法合成編碼人源化抗體Hz4B4-1的VH和VL基因時所用的引物定位以及人源化的定位。
圖3，表達質粒pRc-Hz4B4-k-gs的構建及其限制性酶切圖譜。
圖4，表達質粒pCI-Hz4B4-H的構建及其限制性酶切圖譜。
圖5，PCR方法合成編碼人源化抗體Hz4B4-2的VH和VL基因時所用的引物定位以及人源化的定位。
圖6a-6i經卵白蛋白免疫和用人源化抗體Hz4B4-1治療時，狒狒體內OVA-特異IgG含量的變化。
圖7a-7d，圖7a和7b表明正常人和類風濕關節炎病人外周血中與4B4單克隆抗體反應的細胞與CD4+和CD8+T細胞的比例，圖7c和7d表示正常人和類風濕關節炎病人外周血和滑膜液中與4B4單克隆抗體反應的細胞與CD4+和CD8+T細胞的比例。
發明的詳細說明本發明體現在兩種從小鼠單克隆抗體4B4-1-1制得的人源化單克隆抗體，這種小鼠單克隆抗體與人的4-1BB特異結合(韓國公開專利號no.96-37064)。這些人源化單克隆抗體被用于人體實驗。
第一種人源化的抗體Hz4B4-1的制備是將小鼠單克隆抗體4B4-1-1可變區的抗原結合區，互補性決定區(CDR)移植。為了增加人源化抗體與抗原結合的親和性，將類似于小鼠抗體框架結構區(FR)的幾個氨基酸殘基進行置換，使該抗體與原小鼠單克隆抗體有幾乎完全相同的抗原結合親和性。人源化的抗體Hz4B4-1是由輕鏈可變區，氨基酸序列是SEQID NO1和重鏈可變區，氨基酸序列是SEQ ID NO2所組成。
為了使Hz4B4-1與人的抗體更相似，將小鼠框架結構區(FR)和互補性決定區(CDR)(參見，pp.24-28 of Hood等，“Immunology”，second ed.c.1984，by Benjamin/Cumming Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA，esp.圖.2-6和2-10和PP.288-296 of Paul，“Fundamental Immunology”，third ed.c.1993 by Raven Press，Ltd.，New York，NY.，esp.表2)的另外幾個氨基酸也用人抗體的相應幾個位點進行了替換，從而構建了人源化的抗體Hz4B4-2。Hz4B4-2與抗原結合的親和性比Hz4B4-1高5倍，比原小鼠單克隆抗體高7倍。人源化抗體Hz4B4-2輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ IDNO3所示，重鏈可變區氨基酸序列是SEQ ID NO4。
含有編碼本發明的人源化抗體Hz4B4-1輕鏈的基因的表達質粒pRc-Hz4B4-Mok-gs和編碼重鏈基因的表達質粒pCI-Hz4B4-MoH的細菌已經于1998年10月27保存在韓國科學和技術研究所，生命科學研究所基因庫，編號分別為KCTC 0537BP和KCTC 0536BP。
生產Hz4B4-1抗體的細胞系MH200-3和生產Hz4B4-2抗體的SB500-23細胞系，也于1998年10月27保存在韓國科學和技術研究所，生命科學研究所基因庫，編號分別為KCTC 0540BP和KCTC0541BP。
本發明的人源化抗體對人的4-1BB具有很高的親和性，而且其序列與人的抗體十分相似。因此該人源化的抗體可以用于治療自身免疫病，和作為有效的免疫抑制劑而不會產生任何副作用。
為了這一目的，本發明的人源化抗體可被用作治療自身免疫性疾病的藥物組合物中的活性成分，也可被用作免疫抑制劑。這種藥物組合物可被配制成口服或非口服劑型，以便藥物立即或緩慢釋放。該組合物可含有通常用于制藥的非活性成分，如稀釋劑，填充劑，崩解劑，甜化劑，潤滑劑，調味劑。給藥的最好方式是靜脈注射，或者是大丸劑注射(bolusinjection)或點滴，或者膠囊釋放。典型的用于靜脈內注射的劑型使用生理鹽水作為稀釋劑。
本發明的抗體的Fab或Fab’部分也可以用作治療的活性組分。這些抗體片段的制備方法是本領域公知的技術。
病人服用的劑量與所用的特定的抗體，體重，年齡，性別，健康程度，飲食，給藥時間，藥物的劑型，給藥的途徑和所治療的疾病有關。常規的劑量是0.1mg/kg/天-100mg/kg/天，最常用的劑量是1mg/kg/天-50mg/kg/天。
本發明的組合物也可包括使用說明書，用以描述可使用這種抗體作為治療劑的臨床指癥，所用的劑量，服用方式和/或治療病人時的禁忌。
本發明的抗體也可以用于診斷檢驗。本發明的診斷檢測的一個優選的形式是定量樣品中在其表面表達h4-1BB的細胞。計數攜帶特定的表面標記的細胞的方法是本領域公知的技術。例如可使用熒光標記活化細胞分類。另一種診斷檢驗的形式是對標本中h4-1BB蛋白進行定量分析。還有許多這類檢驗，例如，固定抗原或“三明治”式的酶聯免疫吸附試驗。
本發明通過下面的實施例加以說明，這些實施例是為了說明本發明而不是為了限定本發明的。
實施例1人源化抗體Hz4B4-1的設計為了構建人源化的抗體，將小鼠單克隆抗體4B4-1-1(韓國公開申請號no.96-37064)的輕鏈和重鏈可變區的氨基酸序列與基因數據庫中人的序列進行比較。選擇出與小鼠4B4-1-1抗體重鏈序列十分相似的人重鏈可變區序列M17750(Dersimonian，H.等，J.Immunol.，139，2496(1987))以及與小鼠4B4-1-1抗體輕鏈非常相似的人的輕鏈可變區序列X82934(Esposito，G.等，Arch.Vitrol.，142，601(1997))。為了將小鼠單克隆抗體4B4-1-1人源化，將小鼠抗體的CDR區轉移到人的抗體上。同時將人源化的輕鏈FR區的10個關鍵氨基酸殘基和人源化的重鏈FR區的11個關鍵氨基酸殘基用小鼠4B4-1-1抗體相應的氨基酸所替換。
如上所述設計的人源化抗體Hz4B4k-1輕鏈可變區和人源化重鏈可變區Hz4B4h-1分別具有被稱作SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列。這些序列與小鼠單克隆抗體4B4-1-1輕鏈可變區序列(SEQ ID NO38)和重鏈可變區序列(SEQ ID NO39)進行比較，然后再與人的抗體輕鏈可變區序列X82934(SEQ ID NO40)和重鏈可變區序列M17750(SEQID NO41)進行比較。排列如圖1所示。
實施例2編碼人源化抗體Hz4B4-1基因和表達質粒的構建制備的引物包括了期望替換的區域中的堿基序列。這些引物是KXA(SEQ ID NO5)，KXB(SEQ ID NO6)，KXC(SEQ ID NO7)，KXD(SEQ IDNO8)，KXE(SEQ ID NO9)，KXF(SEQ ID NO10)，KXG(SEQ ID NO11)，KXH(SEQ ID NO12)，AMH(SEQ ID NO13)，BMH(SEQ ID NO14)，CMH(SEQ ID NO15)，DMH(SEQ ID NO16)，EMH(SEQ ID NO17)，FMH(SEQ ID NO18)，GMH(SEQ ID NO19)，HMH(SEQ ID NO20)。
上述引物中，引物KXA(SEQ ID NO5)至KXH(SEQ ID NO12)被用于構建編碼人源化κ-輕鏈可變區的基因。引物AMH(SCQ ID NO13)至HMH(SEQ ID NO20)被用于構建編碼人源化重鏈可變區的基因。圖2由引物的定位表明在人源化抗體Hz4B4-1中的人源化區域，包括編碼VL(SEQ ID NO42)和VH(SEQ ID NO43)的基因。為了便于比較，圖2列出了小鼠單克隆抗體4B4-1-1輕鏈可變區(SEQ ID NO44)和重鏈可變區(DEQ ID NO45)的基因序列。
上述引物被用于以編碼小鼠單克隆抗體4-1BB(韓國公開專利號no.96-37064)輕鏈和重鏈可變區的DNA為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)。產物通過常規PCR重組方法連接，形成完整的VL和VHcDNA。
人源化的VL的PCR產物用HindIII酶切，Klenow酶平端化，然后再用BglII酶切。將編碼VL的PCR產物插入到pBluescriptTM質粒中，該PCR產物合成時，引物為HKD(SEQ ID NO22)和Ryu-93(SEQ ID NO48)，模板為含有質粒pAcS2-CK(Jin等，Virus Research，38269-277(1995))的人VL(HCk)。如此構建的質粒pBS-Ck用SpeI酶切，Klenow酶平端化，然后再用BglII酶切，從而構建了含有人源化VL的pBS-Vk-Ck質粒。
為將人源化的VL插入到表達載體，將含有EPO基因的HindIII-SalI片段從質粒pcDNA-EPO-dE1-gs(韓國專利申請no.97-76923)中切出，然后用從質粒pBS-Vk-Ck中得到的含有NotI-SalI片段的人源化VL cDNA替換。由此得到的質粒被稱為pRc-Hz4B4-k-gs。表達質粒pRc-Hz4B4-k-gs的構建及其酶切圖譜的詳細說明如圖3所示。
為了構建重鏈，將用類似的方法制得的VH的PCR產物用NotI和NheI酶切。然后將編碼VH的PCR產物cDNA插入到pBluescriptTM質粒中，該PCR的模板DNA為含有人抗體VH基因的質粒pAcS2-CH(Jin等，Virus Research，38269-277(1995)，引物為HHCD(SEQ ID NO21)和Ryu-101(SEQ ID NO49)，從而構建了pBS-Cr1質粒。將pBS-Cr1質粒用NotI和NheI酶切后，又構建了pBS-Vh-Cr1質粒。為了將編碼人源化重鏈基因插入到表達載體中，pBS-Vh-Cr1質粒用NotI酶切，用Klenow酶平端化，再用SalI酶切，然后插入到質粒pCI-neo的XhoI-SalI位點，得到pCI-Hz4B4-H質粒。圖4詳細說明了pCI-Hz4B4-H質粒的構建及其限制性酶切圖譜。
從每種質粒得到的編碼人源化輕鏈和重鏈基因的堿基序列通過DNA序列分析進行了證實。在表達質粒中人源化輕鏈和重鏈基因是與人巨細胞病毒(HCMV)啟動子連接的。
實施例3人源化抗體Hz4B4-1的表達及細胞的篩選在含10％透折的牛血清(FBS)的GDMEM培養基中5％CO2，37℃條件下培養的CHO-K1細胞(ATCC CCL61)，接種到直徑為6cm的培養皿中，得到5×105細胞。GDMEM培養基含DMEM(Gibco)，4.5g/L葡萄糖，15mg/L酚紅，1mM丙酮酸鈉，1.75g/L碳酸氫鈉，500μm天門冬酰胺，30μm腺苷，30μm鳥苷，30μm胞苷，30μm尿苷，10μm胸腺嘧啶核苷和非必需氨基酸(GIBCO)。從實施例2制備的2.5μg的pRc-Hz4B4-k-gs質粒和2.5μg的pCI-Hz4B4-H質粒合并，用0.3mlOPTI-MEM ITM(GIBCO)稀釋，同時用0.3ml的OPTI-MEM ITM稀釋15μl的LipofectamineTM(GIBCO)，然后混合，放置15分鐘。
預先培養好的細胞用OPTI-MEM ITM洗3次。然后將上步制備的質粒-LipofectamineTM混合物均勻地加到細胞中。細胞在5％CO2，37℃下培養6小時。然后將培養基換成3ml含10％透析的牛血清的GDMEM培養基，繼續培養48小時。在培養基中，在37℃加入3ml 0.25％胰酶(GIBCO)，反應3分鐘，離心(1,000×g，5分鐘)。將得到的細胞接種到96孔板，每孔2×103細胞。48小時后，將5μM甲硫氨酸硫代酰胺(methionine sulfoxamine，MSX)加到含10％透析的牛血清的GDMEM中，將細胞在5％CO2，37℃進行培養。每隔4天換一次培養基，連續培養2周。
檢測每個存活細胞克隆產生抗體的能力。進行使用偶聯到辣根過氧化物酶上(HRP)的羊抗人IgG(Sigma)(Park等，Hybridoma，15，435-441，1996)的ELISA三明治檢測，得到產生抗體的克隆。在這些克隆中，有5個克隆(A6B，A9A，B1E 212A，A7B)產生很高的抗體。將這5個克隆在含10％透析的牛血清的GDMEM中培養。向每個培養物種加入100、200、350、500和1000μM的MSX，然后檢測細胞生長最好而且產生抗體量最高的克隆并將其分離出來。產生抗體的量最高的3個克隆示于表1。表1克隆 MSX(μM)的濃度 產生抗體的量(μg/106細胞/天)A6B-200-2 200 11.3MH200-2 200 12.2MH200-3 200 16.2實施例4人源化抗體Hz4B4-1的分離和純化從實施例3中得到的MH200-3克隆的細胞在T175培養瓶中，于無血清培養基(CHO-S-SFM II，GIBCO)5％CO2，37℃下培養。收集這種條件培養的培養液，經過蛋白G-Sepharose親和柱(Pharmacia)，用0.1M的甘氨酸(pH2.7)將結合到柱上的抗體洗脫下來，用1M Tris(PH9.0)中和，然后用PBS緩沖液(pH7.0)透析。純化的抗體經10％ SDS-PAGE電泳分析，可以觀察到55KD(重鏈)和約25KD(輕鏈)的二條帶，表明人源化的抗體已被純化。
實施例5，人源化抗體Hz4B4-1與抗原結合的親和性測定了小鼠單克隆抗體4B4-1-1和人源化抗體與抗原結合親和性并用BIAcoreTM檢測(Pharmacia)進行了比較。用10mM醋酸緩沖液稀釋兔抗小鼠IgG(Sigma)和羊抗人IgG(Fc-特異的)，然后偶聯到Dextran CM-5sensor chip(Pharimacia)。加1M乙醇胺終止反應。用HEPES緩沖液(HBS)將小鼠單克隆抗體，4B4-1-1和人源化的抗體，Hz4B4-1稀釋至濃度為50μg/ml。偶聯的抗體以100頻率單位結合(R-U)，25μg/ml的4-1BB抗原以10μl/分的流速加入，使其結合5分鐘。然后以同樣的流速用HBS緩沖液洗脫5分鐘，使其解離。用BIA計算軟件測定結合速率，解離速率和相應的速率常數。Kon、Koff和kd值測定結果如表2所示。表2人源化抗體Hz4B4-1與抗原結合的親和性
上述結果表明，人源化抗體Hz4B4-1與抗原結合和解離的速度比小鼠的抗體高，抗原結合親和性(kd)比小鼠抗體高約1.5倍。實施例6，人源化抗體Hz4B4-2的設計為了獲得比Hz4B4-1更人源化的抗體，將輕鏈CDR1的1個氨基酸殘基和小鼠FR的8個氨基酸殘基用相應的人的氨基酸殘基進行替換。同時，將人源化的重鏈CDR2的4個氨基酸，小鼠FR的8個氨基酸殘基用相應的人抗體的氨基酸殘基進行替換。如上所述，新構建的人源化輕鏈Hz4B4k-2和重鏈Hz4B4h-2的氨基酸序列分別是SEQ ID NOS3和4。圖1排列出所有這些序列小鼠單克隆抗體4B4-1-1 VL(SEQ ID NO38)和VH(SEQ ID NO39)，人抗體VL X82934(SEQ ID NO40)和VH M17750(SEQ ID NO41)，和人源化抗體序列Hz4B4-1(SEQ ID NOS1和2)。實施例7編碼人源體抗體Hz4B4-2基因及其表達質粒的構建合成的引物包括了設計需要替換的堿基序列，這些引物是MOKA(SEQ ID NO23)，MOKB(SEQ ID NO24)，MOKC(SEQ ID NO25)，MOKD(SEQ ID NO26)，MOKE(SEQ ID NO27)，MOKF(SEQ ID NO28)，MOKG(SEQ ID NO29)，MOKH(SEQ ID NO30)，MOHA(SEQ ID NO31)，MOHB(SEQ ID NO32)，MOHC(SEQ ID NO33)，MOHD(SEQ ID NO34)，MOHE(SEQ ID NO35)，MOHF(SEQ ID NO36)，MOHG(SEQ ID NO37)。
上述引物中，從MOKA(SEQ ID NO23)至MOKH(SEQ ID NO30)是用于構建編碼人源化κ-輕鏈可變區基因的引物。從MOHA(SEQ IDNO31)至MOHG(SEQ ID NO37)是用于構建編碼人源化重鏈可變區基因的引物。此外，HMH(SEQ ID NO20)也是用于構建編碼人源化重鏈可變區基因的引物。圖5表明Hz4B4-1的人源化區域和Hz4B4-1的VL基因(SEQ ID NO42)和VH基因(SEQ ID NO43)。
上述引物中的MOK*系列是以Hz4B4-1抗體的輕鏈基因為模板，合成編碼人源化抗體Hz4B4k-2輕鏈基因。上述引物中的MOH*系列是以Hz4B4-1抗體的重鏈基因為模板，合成VH基因，然后用常規重組PCR方法使抗體進一步人源化。合成了編碼VL(Hz4B4k-2，SEQ ID NO46)和VH(Hz4B4h-2，SEQ ID NO47)基因。將上述得到的Hz4B4k-2 DNA用XbaI和Bgl II酶切后，插入到Hz4B4-1輕鏈表達載體pRC-Hz4B4-k-gs的XbaI/Bgl II位點。構建了表達Hz4B4-2輕鏈的質粒pRc-Hz4B4MoK-gs。
對于重鏈來說，將Hz4B4h-2 DNA用XhoI和NheI酶切，然后插入到重鏈表達載體pCI-Hz4B4-H的XhoI/ NheI位點。從而構建了表達人源化抗體Hz4B4-2重鏈的質粒pCI-Hz4B4-MoH。
通過DNA序列分析證實了來自每種質粒的編碼人源化輕鏈和重鏈的基因的堿基序列。實施例8人源化抗體Hz4B4-2的表達及細胞篩選如實施例3所述，CHO-K1細胞用pRc-Hz4B4-Mok-gs和pCI-Hz4B4-MoH質粒轉染。將轉化的細胞在含25μM甲硫氨酸硫代酰胺(methionine sulphoximine)的GDMEM培養基中于37℃ 5％ CO2培養2周。分離有抗性的克隆，然后用三明治ELISA法檢測產生的抗體。在這些克隆中，大量產生SB的克隆在含10％透析牛血清的GDMEM培養基中培養，加入100、200、350、500和1000μM的MSX。將生長最好和在500μM MSX時產生最大量抗體的克隆分離出來。這些克隆產生的抗體大約是3μg/106細胞/天。實施例9人源化抗體Hz4B4-2的分離和純化如實施例4所述，將上述SB500的細胞培養在無血清的培養基中。然后收集這種條件培養的培養液經過蛋白G-Sepharose親和柱(Pharmacia)。純化后的抗體經10％SDS-PAGE電泳鑒定，可以看到約55KD(重鏈)和約25KD(輕鏈)的二條蛋白帶，表明這些人源化的抗體已被純化。實施例10人源化抗體Hz4B4-2的抗原結合親和性測定純化的人源化抗體Hz4B4-2的抗原結合親和性是按實施例5所用的BIAcoreTM方法(Pharmacia)進行的。結果如表3所示。表3人源化抗體Hz4B4-2與抗原結合的親和性
如表3所示，Hz4B4-1抗原結合親和性(Kd)比小鼠單克隆抗體4B4-1-1高1.5倍。人源化抗體Hz4B4-2比小鼠單克隆抗體的抗原結合親和性高7.3倍。本發明的人源化的抗體Hz4B4-1和Hz4B4-2具有我們所希望的與人的抗體相同的親和性。實施例11實驗結果——人源化抗體的免疫反應和免疫抑制效應A.狒狒的免疫反應和人源化抗體Hz4B4-1的施用使用了Southwest Foundation for Biomedical Research(San Artonio，Texas)的7-8歲雄性和雌性狒狒(P.anubis)，體重12-15kg。將狒狒分成3組，每組2只雄性，1只雌性，在標準的飼養動物條件下飼養。每只動物肌肉注射氫氧化鋁佐劑(Sigma)配制的1mg OVA進行免疫。設開始OVA-免疫時為0周，6周后，用OVA(1mg，PBS配制)進行第二次免疫。人源化抗體(或PBS，對照組)的第一次注射與第一次OVA免疫同時進行(0周)，隨后分別在1，2，3，6，7，8，9周給予注射人源化抗體或PBS。第1組的3只狒狒(對照組)靜脈注射10ml PBS。而第2和第3組用人源化的抗體Hz4B4-1進行治療，該抗體是從實施例4中獲得，分別以1或4mg/kg體重給予治療。在-1.5周，0周和每隔一周收集血清標本直至第10周。
B.宿主體液免疫反應的評價通過ELISA測定抗-OVA和IgM水平。用濃度為500ng/孔的OVA包被ImmunomaxisorpTM板(Nunc InterMed，Rockilde，Denmark)。板用1％牛血清白蛋白封閉后，將從步驟1收集的血清標本進行一系列的2倍稀釋，從1/32稀釋開始，向每孔中加入0.1ml。室溫孵育4小時后，用堿性磷酸酶(AP)偶聯的兔抗猴IgG(Sigma)或AP偶聯的羊抗人IgM(Sigma)檢測結合的IgG和IgM。每孔加0.1ml偶聯劑，在上述溫度下孵育，然后用自動微量板測定儀在A405波長下測定光吸收(MolecularDevices Corp.，Menlo Park，California)。IgG和IgM滴度測定是以最高稀釋度時在A405的光吸收，應分別是本底的3倍或5倍。
用ELISA法定量測定血清中總的IgG或Hz4B4-1的含量。稀釋的血清樣品如上所述加到包被了羊抗人IgG(150ng/孔)或GST-4-1BB(100ng/孔)的板上，在上述所用的溫度下孵育4小時。溫浴后，每孔加入AP-偶聯的羊抗人IgG(Sigma)，用P-硝基苯磷酸鹽顯色，在自動微量測定儀在A405波長下測定光吸收。結果如表4和圖6a-6i所示。每個樣品的總IgG或Hz4B4-1的含量是分別參考人的IgG或純化的Hz4B4-1制備的標準曲線計算的。
表4
對照組中血清的抗OVA IgG水平顯著地增加。在第7周時滴度最高，第2次OVA免疫一周后，A1、A2和A3狒狒抗體滴度比0周時滴度分別高64-，16-和32倍(表4和圖6a、6b、6c)。相比之下，在Hz4B4-1治療的狒狒中，OVA-特異抗體反應被明顯抑制。在第2組中，Hz4B4-1治療的劑量為1mg/kg，3只狒狒中有2只(B1和B3)也表現出抑制作用。在第7周時，滴度是0周時的2倍(表1，圖6d、6e和6f)。但在B2狒狒中沒有檢測到這種抑制，而在第7周時，其滴度比0周時高128倍。在第3組中，Hz4B4-1治療濃度為4mg/kg，在所有的3只狒狒中都有這種抑制作用。C1、C2和C3狒狒中滴度分別增加4，1和2倍(表1和圖6g，6h和6I)。
在所有的動物中，抗OVA IgM滴度都沒有明顯增加，無論它們是否經Hz4B4-1處理，表明用Hz4B4-1處理都沒有影響可檢測水平的IgM的產生。綜上所述，這些數據表示，一種對OVA(一種T-細胞依賴的抗原)的體液無反應狀態，由于Hz4B4-1的治療而被誘導出來。這一點也可以通過測定血清中Hz4B4-1的濃度來進一步證實。在所有的狒狒中，第一周時，血清中Hz4B4-1的濃度是最高的。但在B2狒狒(其沒有表現出OVA——特異的IgG抑制反應)中，其血清中Hz4B4-1的濃度比用相同劑量治療的B1和B3明顯降低(表1)。
比較了每只狒狒在0周和7周時總IgG含量。如表1所示，總的IgG變化很小，而不論是否用Hz4B4-1治療。此外，用Hz4B4-1治療過程中，流式細胞儀分析每份血清標本中B和T細胞的數量和比例也沒有明顯的改變。綜上所述，這些數據表明經Hz4B4-1治療所引起的這種免疫系統無反應是抗原-特異性的，而不是由于全部的免疫抑制。C.4-1BB陽性T細胞分析為了評價4-1BB分子在臨床上的重要性，用4B4單克隆抗體通過FACS分析法分析了類風濕性關節炎病人(RA)的T淋巴細胞上這些分子的表達。PBMC是從正常志愿者或類風濕病人肝素抗凝的靜脈血中制備的，而滑膜液細胞是從類風濕病人滑膜液中得到的。5×105PBMC或關節滑膜液細胞與5μl藻紅蛋白(PE)標記的抗人CD4或者PE標記的抗人CD8的小鼠單克隆抗體(Immune Source，Los Altos，California)在一種含有DMEM(1％BSA和0.005％ NaNH3)的染色緩沖液中，于4℃在避光條件下孵育30分鐘。溫浴之后，用染液緩沖液洗細胞，然后與5μl FITC-標記的4B4單克隆抗體在染色緩沖液中于4℃孵育30分鐘。通過流式細胞儀分析表達4-1BB的T淋巴細胞的百分率。通過FACStar PlusTM細胞計數儀(Becton Dicknson & Co.Mountain View，California)分析T淋巴細胞上4-1BB分子的表達。
比較了41例類風濕關節炎病人與13例正常志愿者的外周血(PBMC)T淋巴細胞中這些分子的表達。結果如圖7a和7b所示。正常志愿者的CD4或CD8 T淋巴細胞與4B4單克隆抗體的反應很低或不能觀察到CD4+，＜0.5％；CD8+，＜1.2％。而相比之下，一些類風濕關節炎病人T淋巴細胞CD4+，或CD8+表現對4B4單克隆抗體的反應明顯增強。在CD4+T細胞的情況下，41例病人有18例反應速率超過1％，峰值達7.5％。在CD8+T細胞中，38例病人中有17例的反應速率超過了2％，最大值是15％。
類風濕性關節炎特征為滑膜炎。受影響的滑膜組織的是淋巴細胞和血漿的浸潤。這種疾病是由對一些誘發關節炎的因子響應的T淋巴細胞誘發的，T淋巴細胞在類風濕性關節炎病人的發病機制中起了重要的作用，表明T淋巴細胞在類風濕性關節炎病人滑膜液中是處于活化狀態(G.S.Firestein，p.851 in“Etiology and Pathogenesis of Rheumatoid Arthrisis”，5thed.，W.N.Kelley等eds.，c.1997 by W.B.Saunders，Philadelphia，PA)。因此，將13例類風濕性關節炎病人滑膜液的T淋巴細胞中4-1BB分子的表達與相同的病人的外周血T淋巴細胞中4-1BB分子的表達進行比較，結果如圖7c和7d所示。滑膜液中的CD4+和CD8+T淋巴細胞與4B4單克隆抗體比外周血中的反應性更強；13例類風濕性關節炎病人中8～9例的CD4+或CD8+的亞類超過了正常的2倍。圖7c和7d中，在兩個圓點之間的每一條線代表從相同的病人得到了相應的PBMC和SFC。這些發現提示4-1BB的表達可能與類風濕性關節炎的發病過程有關。
本發明人沒有局限于任何一種理論，推測Hz4B4-1的這種免疫抑制效應可能有兩種互不排斥的機制。首先，該抗體可能干擾了在T細胞活化中起重要作用的4-1BB/4-1BBL的相互作用。第二，抗體可能通過補體-依賴的細胞毒性和抗體-依賴的細胞毒性消除表達4-1BB的T細胞。在許多由T細胞介導的自身免疫病的病例中，自身抗原的確定較難，或是由于變化太大而無法控制這些抗自身抗原的免疫反應。由此看來，在患自身免疫病的病人中，功能的阻斷和/或活化的T細胞的消除(在患有自體免疫疾病的患者中，其中的大部分可能是自體抗原特異性的)，將有可能成為減輕疾病的一種途徑。本發明者已經發現，類風濕性關節炎病人PBMC和滑膜液的大部分T細胞表達4-1BB，提示4-1BB可能是對類風濕性關節炎的抗體介導的治療中理想的靶標，因為，僅僅活化的T細胞，可能大部分的病理性T細胞，才表達4-1BB。在這方面，與其它共刺激分子如CD40L相比，4-1BB較長的表達時間(超過72小時)，可能是另一個用抗體靶擊4-1BB的有利因素。除了類風濕性關節炎，也可以用Hz4B4-1治療其它T細胞介導的自身免疫病和移植排斥。
本發明說明書包括后附的序列表，其中有49個核酸或氨基酸序列。本文中引用的專利文獻和科學文獻全部引入本文作為參考。
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序列表<110>株式會社LG化學<120>人源化的特異于人4-1BB的抗體和含有它的藥物組合物<130>PC91146/LKY<150>KR 1998-49177<151>1999-05-11<160>49<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>107<212>蛋白質<213>人工序列<220><223>人源化抗體Hz4B4-1的輕鏈的可變區<400>1Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly Hi s Ser Phe Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>119<212>蛋白質<213>人工序列<220><223>人源化抗體Hz4B4-1的重鏈的可變區<400>2Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn 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31<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HHCD<400>21atatgctagc accaagggcc catcggtc 28<210>22<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物HDK<400>22atatagatct gtggctgcac catctgtc 28<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKA<400>23ccgctctaga actagagctt c 21<210>24<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKB<400>24cagagaaagg gttggtggag actgggtcat c 31<210>25<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKC<400>25accaaccctt tctctgtctc caggagaaag a 31<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKD<400>26cgctaatgga ctggctggcc ctgca 25<210>27<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKE<400>27agccagtcca ttagcgacta cttac 25<210>28<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKF<400>28tggtgagagt gaaatcggtc cctgatccac tgccactgaa cctagcgggg atccc55<210>29<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKG<400>29gatttcactc tcaccatcag cagtctggaa cctgaagatt ttgctgtgta ttac 54<210>30<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOKH<400>30aggcagatct tttgatttcc accttggtgc ctccaccg 38<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物MOHA<400>31gccgactagt 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Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>41<211>119<212>蛋白質<213>人工序列<220><223>人抗體(M17750)的重鏈可變區<400>41Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Glu Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>42<211>415<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼人源化抗體Hz4B4-1的輕鏈可變區的基因<400>42actagagctt catcagacag gcaggggaag caagatggat tcacaggccc aggttcttat 60gttactgctg ctatgggtat ctggtacctg tggggacatt gtgatgaccc agtctccagc120cacccagtct gtgtctccag gagaaagagt caccctttcc tgcagggcca gccagactat180tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa acctggccag tctccaaggc ttctcatcaa240atatgcttcc caatccatct ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg gatcagggtc300agatttcact ctcaccatca gcagtgtgga acctgaagat tttggagtgt attactgtca360agatggtcac agctttcctc cgacgttcgg tggaggcacc aagctagaaa tcaaa 415<210>43<211>423<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼人源化抗體Hz4B4-1的重鏈可變區的基因<400>43gccgccacca tgggatggag ctatatcatc ctctttttgg tagcaacagc tacagatgtc 60cactcccagg tccaactggt gcagtctggg gctgaagtgg tgaagcctgg ggcttcagtg120aagctgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgaag180caggcccctg gacaagtcct tgagtggatt ggagagatta atcctggcaa cggtcatact240aactacaatg agaagttcaa gagcaaggcc acactgactg tagacaaatc cgcgagcaca300gcctacatgg agctcagcag cctgagatct gaggacacgg cggtctatta ctgtgcaaga360tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct420tca 423<210>44<211>415<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼小鼠單克隆抗體4B4-1-1的輕鏈可變區的基因<400>44actagagctt catcagacag gcaggggaag caagatggat tcacaggccc aggttcttat 60gttactgctg ctatgggtat ctggtacctg tggggacatt gtgatgaccc agtctcaagc120cacccagtct gtgactccag gagatagagt ctctctttcc tgcagggcca gccagactat180tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa atcacatgag tctccaaggc ttctcatcaa240atatgcttcc caatccatct ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg gatcagggtc300agatttcact ctcagtatca acagtgtgga acctgaagat gttggagtgt attactgtca360agatggtcac agctttcctc cgacgttcgg tggaggcacc aagctagaaa tcaaa 415<210>45<211>423<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼小鼠單克隆抗體4B4-1-1的重鏈可變區的基因<400>45gccgccacca tgggatggag ctatatcatc ctctttttgg tagcaacagc tacagatgtc 60cactcccagg tccaactgca gcagcctggg gctgaactgg tgaagcctgg ggcttcagtg120aagctgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgaag180cagaggcctg gacaagtcct tgagtggatt ggagagatta atcctggcaa cggtcatact240aactacaatg agaagttcaa gagcaaggcc acactgactg tagacaaatc ctccagcaca300gcctacatgc aactcagcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga360tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct420gca 423<210>46<211>415<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼人源化抗體Hz4B4-2的輕鏈可變區的基因<400>46actagagctt catcagacag gcaggggaag caagatggat tcacaggccc aggttcttat 60gttactgctg ctatgggtat ctggtacctg tggggacatt gtgatgaccc agtctccacc120aaccctttct ctgtctccag gagaaagagt caccctttcc tgcagggcca gccagtccat180tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa acctggccag tctccaaggc ttctcatcaa240atatgcttcc caatccatct ctgggatccc cgctaggttc agtggcagtg gatcagggac300cgatttcact ctcaccatca gcagtctgga acctgaagat tttgctgtgt attactgtca360agatggtcac agctttcctc cgacgttcgg tggaggcacc aaggtggaaa tcaaa 415<210>47<211>423<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼人源化抗體Hz4B4-2的重鏈可變區的基因<400>47gccgccacca tgggatggag ctatatcatc ctctttttgg tagcaacagc tacagatgtc 60cactcccagg tccaactggt gcagtctggg gctgaagtga agaagcctgg ggcttcagtg120aaggtgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgcgc180caggcccctg gacaacgcct tgagtggatg ggagagatta atcctggcaa cggtcatact240aactactccc agaagttcca gggacgcgtg acaatcactg tagacaaatc cgcgagcaca300gcctacatgg agctcagcag cctgagatct gaggacacgg cggtctatta ctgtgcaaga360tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct420tca 423<210>48<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Ryu-93<400>48gaagtcgacc taacactctc ccctgtt 27<210>49<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物Ryu-101<400>49cggtcgactc atttacccgg agacag 2權利要求
1.一種含有至少一種人源化抗體的組合物，其中，所述的至少一種人源化抗體含有a)一種抗體輕鏈，該抗體輕鏈含有一種人單克隆抗體的輕鏈，該人的單克隆抗體的輕鏈的抗原結合區域的互補性決定區被特異地與h4-1BB蛋白結合的小鼠單克隆抗體輕鏈抗原結合區的互補性決定區替換；和b)一種抗體重鏈，該抗體重鏈含有一種人單克隆看體的重鏈，該人的單克隆抗體的重鏈的抗原結合區的互補性決定區被特異地與h4-1BB蛋白結合的小鼠單克隆抗體重鏈抗原結合區的互補性決定區替換。
2.權利要求1的組合物，其中，所述的人單克隆抗體輕鏈的全部抗原結合區被所述的小鼠單克隆抗體輕鏈的全部抗原結合區替換。
3.權利要求1的組合物，其中，連接所述的人單克隆抗體輕鏈互補性決定區的部分抗原結合區被所述的小鼠單克隆抗體輕鏈的抗原結合區的相應部分替換。
4.權利要求1的組合物，其中，所述的人單克隆抗體重鏈的全部抗原結合區被所述的小鼠單克隆抗體重鏈的全部抗原結合區替換。
5.權利要求1的組合物，其中，連接所述的人單克隆抗體重鏈互補性結合區的部分抗原結合區被所述的小鼠單克隆抗體重鏈的抗原結合區的相應部分替換。
6.權利要求2的組合物，其中，所述的人單克隆抗體重鏈的全部抗原結合區被所述的小鼠單克隆抗體重鏈的全部抗原結合區替換。
7.權利要求1的組合物，其中，輕鏈構架部分多達10個氨基酸被特異地與h4-1BB蛋白結合的小鼠單克隆抗體的相應氨基酸替換。
8.權利要求1的組合物，其中，重鏈構架部分的多達11個氨基酸被特異地與h4-1BB蛋白結合的小鼠單克隆抗體的相應氨基酸替換。
9.權利要求7的組合物，其中，重鏈構架部分的多達11個氨基酸被特異地與h4-1BB蛋白結合的小鼠單克隆抗體的相應氨基酸替換。
10.權利要求1的組合物，其中，所述的至少一種針對h4-1BB的人源化抗體的Kd小于或等于8.7×10-11M。
11.權利要求1的組合物，它含有至少2種所述的人源化抗體。
12.權利要求1的組合物，其中，所述的至少1種人源化抗體是由保藏號為KCTC 0540BP或KCTC 0541BP的細胞系產生的。
13.權利要求11的組合物，其中，所述的至少2種人源化抗體是由保藏號為KCTC 0540BP和KCTC 0541BP的細胞系產生的。
14.一種人源化抗體，它含有a)一種輕鏈可變區，它含有具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽；b)一種重量可變區，它含有具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；c)一種輕鏈恒定區，它與人抗體的輕鏈恒定區相同；和d)一種重鏈恒定區，它與人抗體的重鏈恒定區相同。
15.權利要求14的人源化抗體，其中，所述的人源化抗體是由保藏號為KCTC 0540BP的細胞系表達的。
16.一種人源化抗體，它含有a)一種輕鏈可變區，它含有具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽；b)一種重量可變區，它含有具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽；c)一種輕鏈恒定區，它與人抗體的輕鏈恒定區相同；和d)一種重鏈恒定區，它與人抗體的重鏈恒定區相同。
17.權利要求14或16的人源化抗體，其中，該重鏈是γ1，γ2，γ3，或γ4鏈。
18.權利要求14或16的人源化抗體，其中，該輕鏈是κ或λ輕鏈。
19.權利要求16的人源化抗體，其中，所述的人源化抗體是由保藏號為KCTC 0541 BP的細胞系表達的。
20.一種質粒，它含有一種多核苷酸，該多核苷酸編碼一種人源化抗體的輕鏈可變區，其中，所述的質粒是存在于保藏號為KCTC 0537BP的細胞中的pRc-Hz4B4-k-gs或pRc-Hz4B4-Mok-gs。
21.一種質粒，它含有一種多核苷酸，該多核苷酸編碼一種人源化抗體的重鏈可變區，其中，該質粒是存在于保藏號為KCTC 0536 BP的細胞中的pCI-Hz4B4-H或pCI-Hz4B4-MoH。
22.一種用權利要求20的質粒轉化的宿主細胞。
23.一種用權利要求21的質粒轉化的宿主細胞。
24.一種保藏號為KCTC 0540 BP或KCTC 0541 BP的細胞系的細胞。
25.一種用于抑制人體免疫反應的方法，包括，對該人體施用抑制T細胞活性有效量的權利要求1和10-13中任何一項所述的組合物，或者施用含有權利要求14-19中任何一項所述的抗體的組合物。
26.一種用于篩查病人進行自身免疫反應的方法，包括將來自所述病人的一個樣品與特異地結合H4-1BB蛋白質的抗體相接觸，并確定由所述的抗體特異地結合的CD4+和CD8+細胞的數量，其中，＞1％的所述的CD4+或＞2％的所述的CD8+細胞是被標記的，表示具有自身免疫反應。
27.權利要求25的方法，其中，所述的抗體是權利要求12-15中任何一項所述的抗體。
28.一種用于免疫抑制的組合物，含有(i)權利要求1和10-13中的任何一項所述的組合物，或(ii)權利要求14-19中任何一項所述的抗體和一種藥物可接受的載體。
29.權利要求28的組合物，還包括描述向顯示自身免疫疾病癥狀的病人施用所述的組合物的說明書。
30.權利要求29的組合物，其中，所述的自身免疫疾病是類風濕性關節炎。
31.一種用于抑制病人免疫反應的方法，包括向所述的病人施用抑制所說的免疫反應有效量的權利要求28的組合物。
32.權利要求31的方法，其中，所述的免疫反應是移植排異。
全文摘要
本發明涉及特異地結合蛋白質4－1BB的人源化抗體。這種抗體可通過將針對人4－1BB的小鼠單克隆抗體的互補性決定區移植到人抗體的剩余部分上,并通過進一步的氨基酸替換來制備。此外,可制備含有這種人源化抗體的藥物組合物并用于治療自身免疫疾病來抑制免疫反應。本發明的人源化抗體對人4－1BB具有很高的親和性,并與人抗體具有序列相似性。本發明的藥物組合物可用于治療自身免疫疾病并充當人體內的免疫抑制劑而不產生任何副作用。
文檔編號G01N33/15GK1357009SQ99813393
公開日2002年7月3日 申請日期1999年11月17日 優先權日1998年11月17日
發明者洪孝貞, 樸圣燮, 姜榮峻, 姜昌律, 尹圣寬 申請人:株式會社Lg化學