核酸擴增和測序方法

專利名稱：核酸擴增和測序方法
技術領域：
本發明涉及核酸擴增和測序領域。更具體地說，本發明涉及核酸擴增和測序方法，以及用于核酸大規模高產率擴增和測序的裝置和試劑盒。
核酸測序分析在生物、生物技術和醫藥的許多領域中已成為奠基石。測定核酸序列的能力隨著開始嘗試測定人和其它高等生物大基因組序列以及例如單個核苷酸多態性的測定和篩選以及基因表達的監測而變得日益重要。核酸測序提供的遺傳信息可應用于許多領域，如藥物靶標的發現和確認、疾病的診斷和危險性評分，以及生物鑒定和特性分析。
這些運用的第一步是確定感興趣核酸的確切化學成分，更確切地說是測定組成核酸的四種堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的存在序列。但這些運用需要大規模核酸測序，從而極其需要高產率的核酸測序方法。
本領域中已有了核酸測序方法。兩種最常用的方法是依賴于堿基特異性化學性質的Maxam和Gilbert提出的化學切割技術，和目前更常用的Sanger測序技術，它依賴于酶促鏈終止原理且現已用作核酸測序的常規方法。
在Sanger測序中，每種待測序的核酸在反應中被復制，參與反應的有DNA聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和二脫氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)。DNA聚合酶可將dNTPs和ddNTPs摻入到生長的DNA鏈中。但一旦摻入ddNTP，生長的DNA鏈的3’端將缺少羥基，從而不再是鏈延伸的底物，而終止核酸鏈。所以，在含一種類型ddNTP的具體反應中，產生一種不同長度核酸組成的混合物，全都是以相同的ddNTP結束。通常是用這四種類型ddNTP的每一種ddNTP進行分離反應的，產生的核酸片段的長度分布用變性凝膠電泳(按核酸片段的大小分辨核酸)分析，或最近更常用質譜分析。通常標記反應混合物中一種或多種脫氧核苷三磷酸，從而能檢測不同長度的片段。
上述方法的缺點是待測序的每個核酸都要在生化反應中分別進行加工。凝膠電泳繁重、費力，即使采用毛細管電泳速度也慢，且不適合于大規模高產率測序。另外，隨后的測序也是繁重的。質譜分析仍舊處在原型水平，需要非常昂貴的裝置，而且每個樣品必須單獨分析。
增加生產率的一個方法將是同時分析多個樣品。已使用了采用核酸探針進行DNA雜交的方法，可在生化和電泳過程中進行多個分析，但代價是冗長的附加操作。
最近可采用的方法是基于DNA芯片和DNA雜交的方法(Thomas和BurkeExp.Opin Ther.Patents 8:503-508(1998))。這些方法有缺點，因為每種應用必須先設計和制造DNA芯片其操作冗長，且只有當芯片需求量很大時才能降低單個芯片的價格。還有，這些芯片不可重復使用，每個芯片只適用于一個核酸樣品，如每次只能診斷一個患者。最后，可用這種芯片分析的序列長度限制在小于100,000個堿基，而且這對一些運用如DNA基因分型和基因表達概況分析受到限制。
在核酸測序分析的大多數已知方法中，為了得到分析所需的足夠量核酸，擴增感興趣核酸是先決步驟。
本領域熟知并發表了好幾種核酸擴增方法。例如，擴增磺酸可將感興趣的核酸插入到一表達載體構建物中，然后將這些載體引入適合的生物宿主細胞中，采用已建立的方法培養生物宿主來擴增載體DNA，包括感興趣核酸。
可用本領域熟知的和發表的方法從宿主細胞分離出用這些方法擴增的核酸。但這些方法的缺點是費時、勞動強度高和難以自動化。
1985年(Saiki等人，Science 230,1350-1354)公開了用聚合酶鏈式反應擴增DNA的技術，目前它已是本領域熟知公開的方法。可用兩個短的核苷酸序列(通常稱為引物)，它們對待擴增的DNA序列的已知側翼序列是特異性的，來擴增感興趣靶核酸片段。引物與變性后的雙鏈DNA片段的相反鏈雜交并定向，從而在兩引物之間的區域由DNA聚合酶進行DNA合成，聚合酶將核苷酸依次加入而延伸引物序列。這種延伸反應產生了兩個雙鏈靶區域，每個區域都可再次變性而進行第二輪雜交和延伸。第三輪產生的兩個雙鏈分子，精確地包含了雙鏈形式的靶區域。重復熱變性、引物擴增和延伸的循環，迅速指數式積累了DNA的特異性靶片段。通常，這種方法是在溶液中進行的，通過本領域熟知的方法(如凝膠電泳)從溶液中純化出擴增的靶核酸片段。
最近，公開了用一移植到表面的引物與溶液中游離的引物相結合的方法。這些方法使得可以同時進行擴增并將PCR產物附著到表面上(Oroskar,A.A.等人，Clinical Chemistry 42:1547(1996))。
WO96/04404和(Mosaci Technologies,Inc等人)公開了檢測可能含靶核酸的樣品中靶核酸的方法。這種方法包括只在測試的樣品中存在靶核酸時，才誘發靶核酸的PCR擴增。在靶序列擴增中，使兩種引物附著于固相支持物，從而使擴增的靶核酸序列也附著于該固相支持物。該文獻所公開的擴增技術有時也稱為″橋式擴增″技術。在該方法中，對常規PCR而言兩種引物是特異性設計的，它們可側接于待擴增的具體靶DNA序列。所以，如果樣品中存在該具體的靶核酸，此靶核酸可與引物雜交，并用PCR擴增。PCR擴增的第一步，是靶核酸與附著于支持物的第一特異性引物(″引物″1)雜交。然后通過延伸引物1序列，形成與靶核酸互補的第一擴增產物。在使支持物變性的條件下，釋放此靶核酸，其可與附著于支持物的引物1的其他序列進行進一步的雜交反應。隨后附著在支持物上的第一擴增產物可與附著在支持物上的第二特異性引物(″引物″2)雜交，通過引物2序列的延伸可形成含與第一擴增產物互補的核酸序列的第二擴增產物，它也附著于支持物。所以，靶核酸、第一和第二擴增產物能參與多個雜交和擴增反應，僅受初期存在的靶核酸和初期存在的引物1和引物2序列的數量的限制，結果是附著于表面靶序列產生大量的拷貝。
由于在該反應過程中，只有存在靶核酸時才形成擴增產物，監測支持物上一種或多種擴增產物存在與否就可表明特異性靶序列的存在與否。
可用Mosaic方法，通過對每種不同靶核酸序列特異性的第一和第二引物在固相支持物上不同區域進行不同設置的陳列安排，可同時擴增幾種不同靶核酸序列，來實現多重擴增的量。
Mosaic方法的缺點是，第一和第二引物序列必須對每種待擴增的核酸是特異性的，所以它只可用于擴增已知序列。另外，它的產率受以下因素的限制特異性引物的不同設置的數目，和隨后擴增的靶核酸分子數目(可在給定的固相支持物的不同區域排成陳列)，和在特定區域設置核酸陳列所需的時間。而且，Mosaic方法還需要兩種不同引物通過5′端均勻附著于支持物的不同區域(在那兒形成擴增產物)。這不能用已有的DNA芯片制造技術來實現，而必須用樣品分配的一些方法進行。所以，用這種方法實現的密度也與其它常規陳列安排技術具有相同的限制性。另一限制是監測支持物各不同區域是否存在擴增的靶核酸的速度。
通常在膜(如尼龍或硝酸纖維素膜)上進行DNA樣品的陳列安排。用適合的機器人(如Q-botTM,Genetix Ltd,Dorset BH23 3TG UK)意味著可能得到高達10個樣品/mm2的密度。在這些方法中，用物理化學方法(如，UV輻射)將DNA共價連接于膜，DNA大分子(如大于100個核苷酸長度)以及較小的DNA分子(如寡核苷酸引物)的陳列安排是可能的。
用其它已知的方法可得到寡核苷酸的較高密度陳列。例如，基于預先排布好陳列的載玻片方法，其上用噴墨技術(Blanchard,A.P.和L.Hood,Microbial andComparative Genomics,1:225(1996))獲得反應區域的陳列，或反應性聚丙烯酰胺凝膠陳列(Yershov,G.等人，Proceeding of the National Academy of Science,USA,93:4913-4918(1996))，理論上可以得到至多100個樣品/mm2的陳列排布。
也可用DNA芯片實現較高樣品密度(Fodor,S.P.A.等人，Science 251:767(1991))。最近，分子生物技術中用了帶625個寡核苷酸探針/mm2的芯片(Lockhart,D.J.等人，Nature Biotechnology 14:1675(1996))。公開了可實現高達250000個樣品/cm2(2500/mm2)密度的探針(Chee,M.等人，Science 274:610(1996))。然而，至今在約2.5cm2的單個芯片上可安排至多132000個不同寡核苷酸的陳列。重要的是，這些芯片是將寡核苷酸的3′OH端連接于固體表面的方式制造的。這意味著以這種方式連接于芯片的寡核苷酸不能用作PCR擴增反應中的引物。
重要的是，當PCR產物連接于發生PCR擴增的容器時，產生的PCR產物陳列的密度受限于可用的容器。至今可用的容器僅為96孔微量滴定板形式。這使得只能得到約0.02個PCR產物樣品/mm2表面。
例如，用可購得的NucleolinkTM(Nunc A/S,Roskilde,Denmark)，可能實現同時擴增和密度為0.02個樣品/mm2孔表面的樣品陳列(其上已移植有寡核苷酸引物)。但技術問題是用這種方法不能實現樣品密度的顯著增加。
所以，可見為了增加生產率，本領域需要一種新的核酸擴增方法，它可以同時進行核酸樣品的擴增和陳列排布，且密度較高，另外，還可以較快的速率監測樣品(較佳的是平行的)。
另外，顯然本領域需要一種新方法來進行大量樣品的加工和平行測序，即需要一種測序方法，使這種過程明顯多路化。測序過程的明顯多路化將使產率比本領域已知的測序方法實現的產率高。如果新方法能費用合理、勞動強度較低(與常規測序方法相比)來實現這種高產率測序，則這種新方法甚至更為理想。
本發明描述了一種固相核酸擴增新方法，其能同時設置大量不同的核酸序列陳列并擴增，且密度高。本發明還描述了快速(如果需要以平行方式)監測大量擴增的不同核酸序列的方法。本發明描述的方法還可在短時間內同時測定大量不同的核酸序列。這些方法特別適用于(但不限于)全基因組的測序，或需要同時測定許多個體(如500)的許多基因(如500)等情況，或同時為大量基因(如上百萬)的多態性評分，或同時監測大量基因(如100,000)的表達。
所以本發明提供擴增至少一種核酸的方法，包括以下步驟(1)形成至少一種含待擴增核酸的核酸模板，其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外該核酸在5′端帶有將其附著于固相支持物的裝置；
(2)將所述的核酸模板與一種或多種集落引物X混合，此集落引物X能與寡核苷酸序列Z雜交，其5’端攜帶有將集落引物附著于固相支持物的裝置，存在固相支持物時，可使核酸模板和集落引物二者的5′端可結合于固相支持物；(3)在結合的模板上進行一種或多種核酸的擴增反應，從而產生核酸集落。
在本發明的另一實例中，在該方法的步驟(2)中將兩種不同的集落引物X與核酸模板混合。較佳的是，集落引物X的序列是使寡核苷酸序列Z能與集落引物X中的一種雜交，且寡核苷酸序列Y與集落引物中的一個是相同的。
在本發明的另一實例中，寡核苷酸序列Z與寡核苷酸序列Y互補，稱為Y′，且集落引物X與寡核苷酸序列Y的序列相同。
在本發明的另一實例中，集落引物X可含有簡并引物序列和含待擴增核酸的核酸模板，但在5′和3′分別不含寡核苷酸序列Y或Z。
在本發明的另一方面，所述的方法包括另一步驟，即進行至少一步對步驟(3)生成的一種或多種核酸集落的序列測定。
所以本發明還提供測定至少一種核酸序列的方法，包括以下步驟(1)形成至少一種含待測定核酸的核酸模板，其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外該核酸在5′端帶有將其附著于固相支持物的裝置；(2)將所述的核酸模板與一種或多種集落引物X混合，此集落引物X能與寡核苷酸序列Z雜交，其5′端攜帶有將集落引物附著于固相支持物的裝置，存在固相支持物時，可使核酸模板和集落引物二者的5′端可結合于固相支持物；(3)在結合的模板上進行一種或多種核酸的擴增反應，從而產生核酸集落；和(4)進行至少一步對至少一種生成的核酸集落的序列測定。
本發明的另一實例中，核酸模板和集落引物二者的5’端攜帶將該核酸序列共價附著于固相支持物的裝置。較佳的是，這種用于共價附著的裝置是化學修飾的官能團，如磷酸基團、羧酸或醛分子、硫醇、羥基、二甲氧基三苯甲基(DMT)或氨基，較佳的是氨基。
可用本發明方法擴增的核酸包括DNA，如基因組DNA、cDNA、重組DNA或任何形式合成的或修飾的DNA、RNA、mRNA或任何形式合成的或修飾的RNA。所述的核酸長度可各異，且可以是較大核酸分子的片段或較小部分。較佳的是，待擴增的核酸長度至少為50個堿基對，更佳的是長度為150-4000個堿基對。待擴增的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是單鏈或雙鏈形式。可從任何來源衍生待擴增的核酸。
本文所用的“核酸模板”指含有以單鏈形式待擴增或測序的核酸的實體。如下所述，待擴增或測序的核酸也可以雙鏈形式提供。所以，本發明的“核酸模板”可以是單鏈或雙鏈核酸。本發明方法中可用的核酸模板可以是各種長度。較佳的是，它們的長度至少為50個堿基對，更佳的是長度為150-4000個堿基對。組成核酸模板的核苷酸可以是天然形成的或非天然形成的核苷酸。本發明的核酸模板不僅含有待擴增的核酸，還可含有短寡核苷酸序列的5′和3′端。在5’端含的寡核苷酸序列本文稱為Y。寡核苷酸序列Y是已知的序列，且長度可以各異。用于本發明方法的寡核苷酸序序列Y優選的長度至少為5個核苷酸，較佳的長度介于5-100個核苷酸之間，更佳的長度是約20個核苷酸。在寡核苷酸序列Y中可存在天然或非天然形成的核苷酸。如上所述，寡核苷酸Y優選的序列是與集落引物X相同的序列。本發明核酸模板在3′端含有的寡核苷酸序列稱為Z寡核苷酸序列，Z是已知的序列，且長度可各異。用于本發明方法中所用的寡核苷酸序列Z的長度優選為至少5個核苷酸，較佳的長度介于5-100個核苷酸之間，更佳的長度是約20個核苷酸。在寡核苷酸序列Z中可存在天然或非天然形成的核苷酸。將核苷酸序列Z設計成能與集落引物X中的一個雜交，較佳地被設計成與寡核苷酸序列Y互補(本文稱為Y′)。分別在核酸模板5′和3′含有的寡核苷酸序列Y和Z無需位于模板的最末端。例如，雖然較佳地寡核苷酸序列Y和Z分別位于或鄰近于核酸模板的5′和3′端(或末端)(如在5′和3′末端的有0-100個核苷酸內)，它們也可離核酸模板5′或3′末端更遠(如大于100個核苷酸)。所以，寡核苷酸序列Y和Z可以位于核酸模板的任何位置，只要序列Y和Z各居一邊，即側接于待擴增的核酸序列。
本文所用的“核酸模板”指含有以雙鏈形式待擴增或測序核酸的實體。當核酸模板是雙鏈形式時，在雙鏈的一條鏈的5′和3′端分別含有寡核苷酸序列Y和Z。由于DNA的堿基配對原則，另一鏈是互補于含有寡核苷酸序列Y和Z的鏈，從而在5′端含有寡核苷酸序列Z′，在3′端含有寡核苷酸序列Y′。
本文所用的“集落引物”指含有能與互補序列雜交并引發特異性聚合酶反應的寡核苷酸序列的實體。選擇含集落引物的序列，使其對互補序列具有最大雜交活性，對其它序列的非特異性雜交活性非常低。用作集落引物的序列可以包括任何序列，但較佳地包括5’-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG或5’-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC。集落引物的長度可以是5-100個堿基，但較佳的長度是15-25個堿基。引物中可存在天然或非天然形成的核苷酸。本發明方法中可用一種或兩種不同的集落引物產生核酸集落。用于本發明的集落引物還可包括簡并引物序列。
本文所用的“簡并引物序列”指能與任何獨立于所述核酸片段序列的核酸片段雜交的短寡核苷酸序列。所以雖然不排斥用簡并引物與含寡核苷酸序列X或Y的模板雜交，這些簡并引物并不需要核酸模板中存在待雜交于模板的寡核苷酸序列Y或Z。顯然，在用于本發明的擴增方法中，簡并引物必須與模板中的核酸序列雜交(在待擴增的核酸序列兩邊中的一個位置或側接)。
本文所用的“固相支持物”指核酸可共價附著的任何固體表面，如乳膠珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝膠、金表面、玻璃表面和硅片。優選的固相支持物是玻璃表面。
本文所用的“將核酸附著于固相支持物的裝置”指任何化學或非化學附著方法，包括化學修飾的官能團。“附著”指將核酸固定在固相支持物上，通過共價附著，或通過不可逆的被動吸附，或通過分子間的親和力(如生物素酰化的分子固定于涂有親和素的表面)。這種附著的強度必須足以在DNA變性條件下，不會因用水或緩沖水溶液洗滌而除去。
本文所用的“化學修飾的官能團”指基團，如磷酸基團、羧酸或醛部分、硫醇或氨基。
本文所用的“核酸集落”指含核酸鏈多個拷貝的不連續區域。在同一集落中也可能存在核酸鏈互補鏈的多個拷貝。組成集落的核酸鏈的多個拷貝通常被固定在固相支持物上，可以是單鏈或雙鏈形式。產生的本發明的核酸集落可大小各異，密度取決于所用的條件。集落優選的大小為0.2μm到6μm，較佳的是0.3μm到4μm。用于本發明方法的核酸集落的密度通常為10,000/mm2到100,000/mm2。據信可實現較高的密度，如100,000/mm2到1,000,000/mm2和1,000,000/mm2到10,000,000/mm2。
可用本發明方法產生核酸集落。所以本發明的另一方面內容是提供一種或多種核酸集落。可從本發明的單個固定的核酸模板產生本發明的核酸集落。用本發明的方法也可同時產生許多這樣的核酸集落，每個集落可含有不同的固定核酸鏈。
所以，本發明的另一方面內容是提供多種含待擴增核酸的核酸模板，所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外該核酸在5′端還攜帶將其附著于固相支持物的裝置。較佳地，將這種多重核酸模板與多重集落引物X混合(集落引物能與寡核苷酸序列Z雜交，且在5′端攜帶將集落引物附著于固相支持物的裝置)。較佳地，所述的多重核酸模板和集落引物共價連接于固相支持物。
在本發明的另一實例中，將多重兩種不同集落引物X與多重核酸模板混合。較佳地，集落引物X的序列是使寡核苷酸序列Z能與集落引物X中的一種雜交，而寡核苷酸序列Y與另一種集落引物X具有相同的序列。
在本發明的另一實例中，寡核苷酸序列Z與寡核苷酸序列Y互補(Y′)，且多重集落引物X具有與寡核苷酸序列Y相同的序列。
在另一實例中，多重集落引物X可含有簡并引物序列，多重核酸模板可含有待擴增的核酸，但在5′和3′端分別不含有寡核苷酸序列Y或Z。
可用本領域標準或常規技術制備本發明的核酸模板。通常這些技術是以基因工程技術為基礎的。
可用本領域熟知和發表的方法得到待擴增的核酸。例如，可以用本領域熟知或發表的方法(如限制性內切酶消化或機械方法)得到核酸樣品，如總DNA、基因組DNA、cDNA、總RNA、mRNA等，并從其中產生片段。
通常，首先得到雙鏈形式待擴增的核酸。當以單鏈形式提供核酸時(如mRNA)，先用本領域熟知或發表的方法(如用寡-dT引物和逆轉錄酶和DNA聚合酶)將它制成雙鏈形式。一旦得到適當長度雙鏈形式的待擴增核酸，將相應于寡核苷酸序列Y和Z的寡核苷酸序列與各末端相連，即與該核酸序列的5′和3′端相連形成核酸模板。這可用本領域熟知和發表的方法進行，如用連接反應，或在側接于適當寡核苷酸序列的某位置上，將待擴增的核酸插入到生物載體。另外，如果待擴增的核酸序列至少一部分已知，可用適當的PCR引物(含有對待擴增核酸特異性的序列)用PCR產生在5′和3′分別含寡核苷酸序列Y和Z的核酸模板。將該核酸模板附著于固相支持物之前，可用本領域熟知和發表的方法(如加熱至約94℃，然后在冰上迅速冷卻到0℃)。將它制成單鏈形式。
核酸5′端所含的寡核苷酸序列可以是任何序列，任意長度，本文以序列Y表示。可用本領域熟知和發表的方法選擇適合長度和序列的寡核苷酸。例如，附著于待擴增核酸兩端的寡核苷酸通常是長度為5-100個核苷酸之間的相對較短的核苷酸序列。核酸3′端所含的寡核苷酸序列可以是任何序列，任意長度，本文以序列Z表示。可用本領域熟知和發表的方法選擇適合長度和序列的寡核苷酸。例如，在待擴增核酸兩端所含的寡核苷酸通常是長度為5-100個核苷酸之間的相對較短的核苷酸序列。
寡核苷酸序列Z的序列是能與一種集落引物X雜交的序列。較佳地，寡核苷酸序列Y的序列具有與一種集落引物X相同的序列。更佳的是，寡核苷酸序列Z與寡核苷酸序列Y互補(Y′)，集落引物X具有與寡核苷酸序列Y相同的序列。
可用本領域標準或常規技術制備本發明的寡核苷酸序列Y和Z，或也可購得。
當產生本發明的核酸模板時，也可用本領域熟知和發表的方法插入其它所需的序列。所述的其它序列包括，如限制性內切位點或某些核酸標記物，從而可以鑒定出某給定核酸模板序列的擴增產物。其它所需的序列包括折回DNA序列(當變成單鏈時，形成發夾環或其它二級結構)、指導蛋白質/DNA相互作用的“調控”DNA序列，如啟動子DNA序列(由核酸聚合酶識別)或操縱子DNA序列(由DNA結合蛋白識別)。
如果存在多重待擴增核酸序列，可在相同或不同反應中進行寡核苷酸Y和Z的附著。
一旦制備好核酸模板，可在用于本發明方法前擴增。這些擴增可用本領域熟知和發表的方法進行，例如將模板核酸插入到表達載體中，并在適當的生物宿主中擴增，或用PCR擴增。然而這種擴增步驟不是必須的，因為本發明方法能在由核酸模板單個拷貝產生的核酸集落中產生該核酸模板的多個拷貝。
較佳地，修飾上述制備的核酸模板的5′端以攜帶使該核酸模板能共價附著于固相支持物的裝置。這種裝置可以是，如化學修飾的官能團，如磷酸基團、羧酸或醛部分、硫醇或氨基。最佳的是用硫醇、磷酸或氨基基團對該核酸作5’修飾。
可用本領域的標準或常規方法制備本發明的集落引物。通常，本發明的集落引物是用本領域熟知或發表的方法產生的合成寡核苷酸，或者可購置。
按本發明的方法，可用一種或二種不同的集落引物X來擴增任何核酸序列。這有別于且優于本領域已知的許多擴增方法，如WO 96/04404中公開的，其中對于待擴增的每種特定核酸序列都要設計不同的特異性引物。
較佳地，修飾本發明集落引物X的5′端以攜帶使該集落引物能共價附著于固相支持物的裝置。較佳地，共價附著的裝置是上述化學修飾的官能團。如果需要，可將集落引物設計成含有其它所需序列的，如限制性內切酶位點或其它類型切割位點，如核酶切割位點。其它理想的序列包括折回DNA序列(當變成單鏈時，形成發夾環或其它二級結構)、指導蛋白質/DNA相互作用的“調控”DNA序列，如啟動子DNA序列(由核酸聚合酶識別)或操縱子DNA序列(由DNA結合蛋白識別)。
通過5′端將集落引物X固定于支持物，使它的3′端遠離支持物，從而一旦發生與核酸模板3’端所含互補寡核苷酸序列的雜交，可得到集落引物用于聚合酶進行鏈延伸。
一旦合成本發明的核酸模板和集落引物，就將它們以適當的比例混合在一起，從而當它們附著于固相支持物時，可得到適當密度的附著核酸模板和集落引物。較佳地，混合物中集落引物的比例高于核酸模板的比例。較佳地，集落引物與核酸模板的比例如下，當集落引物和核酸模板固定于固相支持物時，形成集落引物“苔”，在整個固相支持物或其一確定區域上以適當的均勻密度分布著多重集落引物，在集落引物苔中獨立地間隔固定著一種或多種核酸模板。
可以單鏈形式提供核酸模板。但它們也可以完全或部分雙鏈形式提供，一個5′端或兩個5′端都被修飾，從而能附著于支持物。在這種情況中，當完成附著過程后，可用本領域熟知的方法(如在洗去釋放的鏈之前，加熱到94℃)來分離鏈。可以理解當雙鏈分子的兩條鏈都與表面反應并都附著時，其結果與一條鏈附著并進行一步擴增時的結果相同。換而言之，當雙鏈模板核酸的兩條鏈均附著時，兩條鏈必然彼此靠近地附著，這與僅附著一條鏈和進行一步擴增的結果沒有差異。所以，可用單鏈或雙鏈模板核酸來提供附著于表面和適合于集落生成的模板核酸。
通過改變固定在支持物上的集落引物和核酸模板的濃度，可以控制單個集落引物和單個核酸模板之間的距離(并因而控制集落引物和核酸模板的密度)。集落引物的優選密度是至少1fmol/mm2，較佳的是10fmol/mm2，更佳的是在30-60fmol/mm2之間。用于本發明方法的核酸模板的密度通常為10,000/mm2到100,000/mm2。據信可實現較高的密度，如100,00/mm2到1,000,000/mm2和1,000,000/mm2到10,000,000/mm2。
控制附著的核酸模板和集落引物的密度，從而可控制支持物表面上核酸集落的最終密度。這是因為以下事實按本發明的方法，一個核酸集落是由一個核酸模板附著而產生的，只要在固相支持物的適當部位上存在本發明的集落引物(見以下更詳盡的描述)。也可通過控制附著的集落引物的密度來控制單個集落中核酸分子的密度。
一旦以適當的密度將本發明的集落引物和核酸模板固定在固相支持物上，可通過在共價連接的模板核酸上進行適當輪數的擴增，產生本發明的核酸集落，從而每個集落含有初始固定的核酸模板和其互補序列的多個拷貝。一輪擴增包括以下步驟雜交、延伸和變性，這些步驟通常用本領域熟知的PCR試劑和條件進行。
通常擴增反應包括將固相支持物、附著的核酸模板和集落引物置于誘導引物雜交的條件下，如將它們置于65℃左右的溫度。在這些條件下，核酸模板3′端的寡核苷酸序列Z將與固定的集落引物X雜交，在存在支持引物延伸的條件和試劑下，如72℃左右的溫度，存在核酸聚合酶，如依賴于DNA的DNA聚合酶或逆轉錄酶分子(即依賴于RNA的DNA聚合酶)、或存在RNA聚合酶，加上存在一些核苷三磷酸分子或其他核苷酸前體分子(如修飾的核苷三磷酸分子)，加入互補于模板核酸序列的核苷酸，集落引物就會延伸。
可用于本發明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(克列諾片段，T4 DNA聚合酶)、各種耐熱細菌的熱穩定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu、Tfl DNA聚合酶)以及它們遺傳修飾的衍生物(TaqGold,VENTexo,Pfu exo)。也可聯用RNA聚合酶和逆轉錄酶來產生DNA集落的擴增。較佳地，用于集落引物延伸的核酸聚合酶在PCR反應條件(即反復循環加熱和冷卻)下是穩定的，且在所用的變性溫度(通常約為94℃)下也是穩定的。優選的DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶。
較佳地，所用的核苷三磷酸分子是脫氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或核糖核苷三磷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。
雜交和延伸步驟后，將支持物與固定的核酸置于變性條件下，將存在兩種固定的核酸，第一種為初始固定的核酸模板，第二種是它的互補核酸，系從一種固定的集落引物X延伸而得。然后初始固定的核酸模板和形成的固定的延伸集落引物都能引發進一步的擴增，支持進一步雜交、延伸和變性的循環。這種擴增的進一步循環將產生含模板核酸和其互補序列的多個固定拷貝的核酸集落。
模板核酸的初始固定意味著模板核酸只能與在全長模板核酸內隔開一定距離的集落引物雜交。所以，形成的核酸集落的邊界被限于相當于初始核酸模板被固定區域的局部區域內。顯然，一旦通過下幾輪的擴增(即下幾輪的雜交、延伸和變性)合成了模板分子和其互補物的更多拷貝，則生成的核酸集落的邊界線能進一步延伸，雖然形成的集落邊界線仍被限于相當于初期核酸模板被固定的區域的局部區域內。


圖1顯示了按本發明實例產生核酸集落方法的示意圖。圖1(a)顯示本發明的集落引物X(此處所示的帶有序列ATT)，和本發明的核酸模板，在5′端含有寡核苷酸序列Y(此處所示的為ATT)，在3′端含有寡核苷酸序列Z(此處所示的為AAT)，它能與集落引物序列X雜交。在示意圖中，顯示的集落引物X和寡核苷酸序列Y和Z長度僅三個核苷酸。然而實際上可理解通常采用更長的序列。集落引物和核酸模板二者的5′端都攜帶有使核酸附著子固相支持物的裝置。圖1中以黑色方框表示此裝置。這種附著裝置可產生共價或非共價附著。
為簡單起便，圖1(a)中僅顯示了一種集落引物X和一種模板核酸。然而實際上存在多重集落引物X和多重核酸模板。多重集落引物X可由兩種不同的集落引物X組成。但為了簡化示意圖，圖1中僅顯示了一種類型的集落引物X，其序列為ATT。多重核酸模板可包含寡核苷酸Y和Z之間中心部分的不同核酸序列，但5′和3′端分別含有相同的寡核苷酸序列Y和Z。在圖1中只簡單顯示了一種類型的核酸模板，其中心部分的序列顯示為CGG。
存在固相支持物時，核酸模板和集落引物二者的5′端都結合于支持物。圖1(b)中對此進行了描述。將支持物、附著的核酸模板和集落引物置于誘導引物雜交的條件下。圖1(c)顯示了雜交于集落引物的核酸模板。依靠核酸模板3′端的寡核苷酸序列Z能與集落引物雜交的事實，而能進行這種雜交。在示意圖中，顯示的寡核苷酸序列Z互補于集落引物，雖然在實際運用中不需要精確互補的序列，只要核酸模板和集落引物在所處的條件下能發生雜交。
圖1(d)顯示了引物延伸期。在適當溫度條件下，存在DNA聚合酶和大量核苷酸前體(如dATP、dTTP、dCTP和dGTP)時，DNA聚合酶將集落引物從其3′端延伸，以核酸模板為模板。當引物延伸完成時，見圖1(e)，可以看到產生了第二條固定的核酸鏈，它互補于初始的核酸模板。在分離兩條核酸鏈(如用加熱)時，將存在兩條固定的核酸，第一條為初始固定的核酸模板，第二條是它的互補核酸，系從固定的集落引物X延伸而得，見圖1(f)。
兩條初始固定的核酸模板和所形成的固定的延伸集落引物二者都能與其它存在的集落引物(在圖1(g)中以集落引物2和3表示)雜交，在另一輪引物延伸(圖1(h)和鏈分離(圖1(i))后，有四條固定的單鏈。其中有兩條含有相應于初始核酸模板的序列，兩條含有與其互補的序列。
可進行圖1所示進一步的擴增，得到含多個拷貝的固定的模板核酸和其互補序列的核酸集落。
可以看出本發明的方法能從單條固定的核酸模板產生一個核酸集落，且通過改變核酸模板經歷的擴增輪數，可控制這些集落的大小。所以在固相支持物表面形成的核酸集落的數量取決于初始固定在支持物上的核酸模板的數量，只要在每個固定的核酸模板部位內有足夠量的固定的集落引物。出于這種原因，較佳的固定集落引物和核酸模板的固相支持物，包含有適當密度的固定的集落引物苔，和在引物苔中間隔固定的核酸模板。
被稱為核酸集落的“自動模式”優于先前本領域的許多方法，在于因為可通過調節初始固定的核酸模板的密度，而控制密度從而獲得較高密度的核酸集落。這種方法不受以下情況的特異性限制，如在支持物的特定局部區域上特異性引物的陳列排布，和將含有核酸模板的具體樣品點樣到引物的同一局部區域所引發集落形成。用先前本領域的方法可設置陳列的集落數量(如WO96/04404(Mosaic Technologies,Inc.)中所公開的方法)，受限于在初始步驟中可設置陳列的特異性引物區的密度/間距。
由于能控制核酸模板的初始密度因而控制核酸模板所產生的核酸集落的密度，加上能控制形成的核酸集落的大小和單個集落中核酸模板的密度，就可能達到最佳狀況，即在足夠大尺寸且含有足夠多數量的擴增序列(使得能在核酸集落上進行隨后的分析或監測)的固相支持物上可能產生高密度的單個核酸集落。
一旦產生核酸集落，就可進行其它步驟，如集落的目測或測序(見下文)。例如若需要篩選產生的克隆是否存在或缺少某特定核酸片段的整體或部分，可能要求目測集落。在這種情況下，可通過設計一核酸探針(其能與感興趣核酸片段特異性雜交)，來檢測含該特定核酸片段的集落。
較佳地，將這種核酸探針以可探測的標記如熒光基團、含生物素標記(可通過與例如熒光基團標記的鏈霉親和素一起培育)、放射性同位素標記(可用本領域熟知和記載的方法將它摻入核酸探針，并通過與閃液一起培育檢測放射性來測定)、或染料或其它染色試劑來標記。
另外，這些核酸探針也可以是無標記的，并設計用核酸聚合酶摻入大量標記的核苷酸的引物。然后可進行摻入標記的核酸集落的檢測。
然后制備用于雜交的本發明的核酸集落。這種制備包括處理集落，使所有或部分組成集落的核酸模板以單鏈形式存在。這可通過，如加熱變性集落中的雙鏈DNA來實現。另外，可用對模板核酸中雙鏈形式序列特異性的限制性內切核酸酶處理集落。這樣內切核酸酶可以是對寡核苷酸序列Y或Z中所含的序列或模板核酸中存在的其它序列特異性的。消化后，加熱集落，使雙鏈DNA分子分開，洗滌集落除去未固定的鏈，從而在集落中留下附著的單鏈DNA。
制備好用于雜交的集落后，在適宜于探針與其特異性DNA序列雜交的條件下，將標記的或無標記的探針加入到集落中。可用已知的方法，由本領域熟練技術人員確定這些條件，且這些條件取決于例如探針的序列。
然后通過加熱變性除去探針，如果需要可與對第二種核酸特異性的探針雜交并檢測。如果需要這些步驟可重復多次。
然后可用裝置(包括適當的檢測儀器)檢測雜交于核酸集落的標記探針。熒光標記優選的檢測系統是電荷耦合儀(CCD)照相機，它可任選地與放大裝置(如顯微鏡)連接。用這種技術可同時平行監測許多集落。例如，用帶CCD照相機的顯微鏡以10x或20x物鏡，可觀察到在1mm2到4mm2之間表面上的集落，這相應于平行監測10000至200000之間的集落。而且可以預計隨著鏡片的改進和較大芯片的采用，此數目還將增加。
監測生成的集落的另一方法是掃描覆蓋有集落的表面。例如，可以用那些系統，其能同時隨著多至100000000個集落的陳列，并用CCD照相機拍攝整個表面進行監測。用這種方法，可以在短時間內監測多至100000000個集落。
本發明核酸集落的監測中可用其它裝置，來檢測和較佳地定量測定表面上的熒光。例如，可用熒光成像器或共聚焦顯微鏡。
如果標記是放射性的，要求用放射性檢測系統。
在本發明的方法中，其中進行了至少一步對至少一種產生的核酸集落測序的步驟，所述的測序可用任何合適的固相測序技術進行。例如，一種可用于本發明的測序方法包括，將合適的引物(有時本文稱為“測序引物”)與待測序的核酸模板雜交，延伸引物，檢測用于延伸引物的核苷酸。較佳地，在將下一核苷酸加入到生長的核酸鏈之前，檢測用于延伸引物的核酸，從而在原位核酸測序中使得能堿基對堿基。
在引物延伸反應中加入一種或多種標記的核苷酸，可便利于摻入的核苷酸的檢測。可用任何適合的可檢測標記，如熒光、放射性標記等。優選用熒光標記。對每種不同類型的核苷酸可用相同或不同的標記。但用熒光標記，且對每種不同類型的核苷酸用相同的標記時，摻入各核苷酸能累積性增加特定波長測得的信號。如果用不同的標記，則可在不同的適當波長測得這些信號。如果需要，也可用標記的和無標記的核苷酸混合物。
為了使適合的測序引物與待測序的核酸模板雜交，該核酸模板通常應為單鏈形式。如果組成核酸集落的核酸模板以雙鏈形式存在，可用本領域熟知的方法(如變性、切割等)處理它們以提供單鏈核酸模板。
與核酸模板雜交并用于引物延伸的測序引物較佳地是短寡核苷酸，如長度為15-25個核苷酸。設計引物的序列使它們能與待測序的核酸模板的一部分雜交(宜在嚴謹條件下)。用于測序的引物序列可與用于產生本發明核酸集落的集落引物的序列相同或相似。可以溶液或固定的形式提供測序引物。
一旦將核酸模板和測序引物置于適當的條件下，將測序引物與待測序核酸模板退火(用本領域熟知的方法監測)，即進行引物延伸，如用核酸聚合酶和大量核苷酸，其中至少一些是以標記形式提供的，且條件適合于引物延伸(如果提供適當的核酸聚合酶)。可用的核酸聚合酶和核苷酸的例子如上所述。
較佳地，在每次引物延伸步驟后，包括一洗滌步驟，以除去未摻入的核苷酸(其可能干擾后續的步驟)。一旦進行了引物延伸步驟，就監測核酸集落，以確定標記的核苷酸是否摻入到延伸的引物中。可重復引物延伸步驟，以確定下一個和后續核苷酸摻入到延伸引物中。
測序可采用任何能檢測和宜定量測定適當標記(如熒光或放射性標記)的裝置。如果標記是熒光，可任選采用連接有放大裝置(如上所述)的CCD照相機。事實上，用于本發明測序的裝置可與上述監測擴增的核酸集落的裝置相同。
較佳地，將檢測系統與分析系統聯合使用，來測定引物延伸各步后摻入各集落的核苷酸的數量和性質。這種分析可緊接在各引物延伸步驟后進行，或隨后用記錄的數據來測定某給定集落中核酸模板的序列。
如果待測定的序列是未知的，通常以選定的順序使用給予某給定集落的核苷酸，然后在整個分析中重復該順序，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP。如果待測定的序列是已知的并要再測序，例如分析該序列與已知的序列是否有小的差異，可在各步中以適當的按已知序列選擇的順序加入核苷酸，更迅速進行序列測定。在引物延伸的特定階段發現某些核苷酸摻入的缺失，表明檢測到與給定的序列的不同。
所以，可用本發明的方法來測定組成特定核酸集落的被擴增核酸模板的全或部分序列。
在本發明的另一實例中，通過測定一個以上核酸集落中存在的被擴增的核酸模板的全或部分序列，來確定一種以上核酸的全或部分序列。較佳地，可同時測定多個序列。
用本發明方法進行核酸測序的優點為，它是非常可靠的，因為在本發明各核酸集落中提供了大量待測序的各種核酸。如果需要，可進一步改進可靠性，即通過提供含待測序同一核酸模板的多個核酸集落，然后測定多個集落每一個的序列并作比較。
較佳地，集落引物和核酸模板與固相支持物的附著，在核酸擴增反應支持物所處的溫度中是耐熱的，如溫度高達約100℃，如94℃左右。較佳地這種附著是天然共價的。
在本發明的另一實例中，通過交聯劑介導集落引物和核酸模板與固相支持物的共價結合，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、琥珀酰酐、苯基二異硫氰酸鹽或馬來酸酐、或異雙官能團交聯劑，如間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N-琥珀酰亞胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-馬來酰亞胺丁酰氧-琥珀酰亞胺酯(GMBS)、琥珀酰亞胺-4-[對-馬來酰亞胺苯基]丁酸鹽(SMPB)和相應的硫代化合物(水溶性的)。用于本發明的優選交聯劑是s-SIAB、s-MBS和EDC。
在本發明的另一實例中，固相支持物具有衍生(derivatised)化的表面。在另一實例中，固相支持物的衍生表面隨后用雙官能團交聯劑修飾，以得到功能化的表面，較佳地帶有反應性交聯基團。
本文所用的“衍生化表面”指被化學反應基團(如氨基、硫代或丙烯酸基團)修飾的表面。
本文所用的“功能化的表面”指已被特異性官能團(如馬來酸或丁二酸官能部分)修飾的衍生表面。
本發明的方法中，為了能用于一些運用，集落引物和核酸模板與固相支持物的連接必須滿足若干要求。理想的附著應不受核酸擴增過程中所用的重復加熱/冷卻循環和暴露于高溫的影響。另外，應使支持物上附著的集落引物的密度至少為1fmol/mm2，較佳地為至少10foml/mm2，更佳的是在30-60foml/mm2之間。理想的支持物應具有均勻平坦的表面，低熒光背景，而且耐熱(不變形)。某些塑料和合成的硝基纖維素膜類型固相支持物(被動吸附DNA)不適用。最后，固相支持物應是一次性使用的，因而成本應不高。
出于這些原因，雖然固相支持物可以是核酸能附著的任何固相表面，如乳膠珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝膠、金表面、玻璃表面和硅片，優選的固相支持物是玻璃表面，且其上核酸的附著是共價附著。
可用本領域已知和發表的方法，進行集落引物和核酸模板與固相支持物的共價結合。例如將寡核苷酸經環氧硅烷-氨基共價連接鍵附著在固相支持物(如多孔玻璃珠)上，已廣泛用于固相原位寡核苷酸合成(通過3′端附著)，也適合于寡核苷酸的5′端附著。用羧酸或醛基修飾的5′端寡核苷酸可共價附著于肼-衍生的乳膠珠上(Kremsky等人，1987)。
其它將寡核苷酸附著于固相表面的方法采用交聯劑，如琥珀酰酐、苯基二異硫氰酸鹽(Guo等人，1994)，或馬來酸酐(Yang等人，1998)。其它廣泛使用的交聯劑是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。Gilham等人(1968)首先描述了EDC的化學性質，它通過5′末端的磷酸基團將DNA模板附著于紙(纖維素)上。利用EDC的化學性質，可使用其它支持物，如乳膠珠(Wolf等人，1987,Lund等人，1988)、聚苯乙烯微孔(Rasmussen等人，1991)、孔隙大小控制的玻璃(Ghosh等人，1987)和葡聚糖分子(Gingeras等人，1987)。Chu等人(1983)已描述了碳二亞胺介導試劑與5’氨基修飾的寡核苷酸的縮合，Egan等人(1982)描述了5’末端磷酸基團的修飾。
用碳二亞胺通過5′末端使寡核苷酸附著的產率可達到60％，但通過寡核苷酸內核苷酸的非特異性附著是一主要缺點。Rasmussen等人(1991)采用仲氨基團衍生的表面使通過5′端的特異性附著提高到85％。
最近，許多文獻報道了異雙功能交聯劑的優點。異或同雙功能交聯劑已被廣泛用于制備肽載體偶聯分子(肽-蛋白質)以提高在動物中的免疫原性(Peeters等人，1989)。已報道這些移植試劑大都能在水溶液中形成穩定的共價鍵。已用這些交聯劑將DNA結合到固相表面上(僅在分子的一個點上)。
Chrisey等人(1996)研究了用6種不同的異雙功能交聯劑使DNA固相附著的效果和穩定性。在該實例中，僅在由硫醇基團修飾的DNA低聚物的5′端發生附著。O′Donnell-Maloney等人(1996)也描述了這種類型的附著，用于MALDI-TOF測序分析中DNA靶附著，Hamamatsu Photonics P.K.company(EP-A-665293)則描述了用于固相表面上核酸堿基序列的測定。
極少有研究涉及寡核苷酸吸附于固相支持物的熱穩定性。Chrisey等人(1996)報道了琥珀酰亞胺-4-[對-馬來酰亞胺苯基]丁酸鹽(SMPB)交聯劑，在熱處理過程中從玻璃表面釋放出約60％分子。但沒有描述其它試劑的熱穩定性。
為了通過固相擴增反應產生核酸集落(如本申請所述)，需將集落引物和核酸模板在它們的5′端特異性附著到固相表面(較佳地是玻璃)。簡單地說，可用氨基-烷氧基硅烷通過硅烷化衍生出具有反應性氨基的玻璃表面。合適的硅烷試劑包括氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷和4-氨基丁基三乙氧基硅烷。也可用其它反應基團衍生玻璃表面，如用環氧硅烷、丙烯酸硅烷和丙烯酰胺硅烷等丙烯酸基或環氧基。衍生步驟后，用交聯劑(如上所述)將在5′端具有化學修飾官能團(如磷酸、硫醇或氨基基團)的核酸分子(集落引物或核酸模板)共價附著于衍生的表面。
另外，衍生步驟后可將雙功能交聯劑附著于表面氨基，從而提供修飾的功能化表面。具有5′-磷酸、硫醇或氨基基團的核酸分子(集落引物或核酸模板)與功能化表面作用，形成核酸和玻璃之間的共價鍵連接。
可用于將DNA/寡核苷酸共價連接移植到固相支持物上的可能交聯劑和移植試劑包括琥珀酰酐、(1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N-琥珀酰亞胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-馬來酰亞胺丁酰氧-琥珀酰亞胺酯(GMBS)、琥珀酰亞胺-4-[對-馬來酰亞胺苯基]丁酸鹽(SMPB)和相應的硫代化合物(水溶性的)。對本發明而言優選的交聯劑是s-SIAB、s-MBS和EDC。s-MBS是馬來酰亞胺-琥珀酰亞胺異雙功能交聯劑，s-SIAB是碘乙酰基-琥珀酰亞胺異雙功能交聯劑。兩者分別能與SH基團和伯氨基形成共價鍵。EDC是碳二亞胺試劑，其介導磷酸和氨基基團的共價連接。
通常用磷酸基團或伯氨基(對EDC移植試劑)或硫醇基團(對s-SIAB或s-MBS交聯劑)在5′端修飾集落引物和核酸模板。
所以，本發明的另一方面內容是提供一種固相支持物，其上附著有多個上述集落引物X和至少一種上述核酸模板，其中所述的核酸模板在5′端含有上述的寡核苷酸序列Y，其3′端含有上述的寡核苷酸序列Z。較佳地，多個核酸模板附著于上述的固相支持物(優選的是玻璃)。較佳地，核酸模板和集落引物與固相支持物的附著是共價的。通過用上述方法在固定的核酸模板上進行一輪或幾輪核酸擴增后，形成本發明的核酸集落。本發明的另一方面是含一個或多個本發明核酸集落的支持物。本發明的還有一方面提供了在核酸擴增和測序方法中使用的本發明固相支持物。這些核酸擴增或測序方法中包括了本發明的方法。
本發明的另一方面提供在核酸擴增或測序方法中如上所述制備的衍生的或功能化的支持物的用途。這些核酸擴增或測序方法包括了本發明的方法。
本發明的另一方面內容是提供實施本發明方法的裝置或制造含本發明核酸集落的固相支持物的裝置。這些裝置可包括，例如本發明的多個核酸模板和集落引物(它們較佳地共價結合于以上所列出的固相支持物)、以及核酸聚合酶、上述多個核苷酸前體(其中一部分是有標記的)、和控制溫度的裝置。另外，這些裝置可能還包括，例如含一種或多種本發明核酸集落的支持物。較佳地，這些裝置還包括檢測裝置，用于檢測和區分按本發明方法在固相支持物上排布的單個核酸集落的信號。例如，這種檢測裝置可包括操作性連接于放大裝置(如上述的顯微鏡)的電荷耦合儀。
較佳地，本發明的裝置是以自動化形式提供的。
本申請提供了對當前和新興需求的解決方案即科學家和生物技術產業在基因組學、藥物基因組學(pharmacogenomics)、藥物開發、食品特性分析和基因分型領域中正在致力解決的需求。所以本發明的方法，在例如核酸測序和重測序、診斷和篩選、基因表達的監測、遺傳多樣性分布圖、全基因組多態性的發現和評分，基因組玻片的制造(在顯微鏡載玻片上某患者的全基因組)和全基因組的測序中具有潛在用途。
所以可用本發明進行核酸的測序和重測序，如將選定數量的基因特異性擴增成集落，用于全DNA測序。基因重測序使得能對所研究基因的所有已知的或新的遺傳多態性進行鑒定。也可用于活生物的醫學診斷和基因鑒定。
在將本發明運用于診斷和篩選時，可將全基因組或基因組組分擴增成集落，用于已知單個核苷酸多態性(SNP)的DNA測序。SNP鑒定已用于醫學遺傳研究，來鑒定與疾病相關的遺傳危險因素。SNP基因分型也可診斷性運用于藥物基因組學中，來鑒定和用特異性藥物治療患者。
對于本發明在遺傳多樣性分布研究中的運用，可通過將樣品DNA擴增成集落，然后對各獨立遺傳實體的特異性“標記”作DNA測序，來鑒定生物或細胞或組織群體。在這種方法中，樣品的遺傳多樣性可通過各獨立實體標記的計數來確定。
對于本發明在基因表達監測中的運用，將研究的組織或生物表達的mRNA轉化成cDNA分子，再擴增成集落用于DNA測序。編碼某給定mRNA的集落的頻率與初始組織中存在的mRNA分子的頻率成正比。基因表達監測運用在生物醫學研究中。
可用本發明的方法制備全基因組的玻片，其上存在的活生物的全基因組的DNA集落數量足以包括該基因組的所有序列。這種基因組玻片是活生物的遺傳身份卡。這種遺傳身份卡可用于醫學研究和具有產業價值的活生物的遺傳鑒定。
本發明也可用于進行全基因組的測序，其中將活生物的全基因組擴增為許多集落用于大規模的DNA測序。全基因組測序使得可以，例如1)對活生物的遺傳品系進行精確的鑒定；2)發現基因組中編碼的新基因和3)發現新的遺傳多態性。
本發明的運用并不限于分析單個生物/患者的核酸樣品。例如，可將核酸標記摻入核酸模板中并擴增，可將不同的核酸標記用于各生物/患者。所以，當測定擴增的核酸序列時，也可測定標記的序列和所鑒定樣品的起源。
所以，本發明的另一方面內容是提供本發明方法的用途，或本發明核酸集落，或本發明多個核酸模板，或本發明固相支持物的用途，用于提供測序和重測序、基因表達監測、遺傳多樣性分布圖、診斷、篩選、全基因組測序、全基因組多態性的發現和評分、和制備全基因組玻片(即在一支持物上某個體的全基因組)的核酸分子，或其它包括核酸擴增或其測序的用途。
本發明的另一方面是提供一種試劑盒，用于測序、重測序、基因表達監測、遺傳多樣性分布圖、診斷、篩選、全基因組測序、全基因組多態性的發現和評分、或其它包括核酸擴增和測序的用途。這種試劑盒包含有結合于固相支持物(以上列出的)的本發明的多個核酸模板和集落引物。
本發明將在以下非限制性實施例和附圖中作更詳盡的描述圖1顯示了本發明實例產生核酸集落的方法示意圖。
圖2是模板制備和隨后附著于固相表面的示意圖。圖2a顯示了模板A、B和B′(含有集落引物序列)的制備。用PCR引物TP1和TP2從基因組DNA中產生3.2Kb的模板。分別用PCR引物TPA1/TPA2或TPB1/TPB2產生模板A(854bp)和B(927bp)。用磷酸或硫醇基團在TPA1和TPB1寡核苷酸的5′端進行修飾，用于隨后的化學附著(★)。注意得到的模板含有相應于集落引物CP1和/或CP2的序列。該基因的11個外顯子以“E1到E11”表示。圖2b顯示了集落引物和模板與玻璃表面的化學附著。例舉了ATS(氨基丙基三乙氧基硅烷)的衍生。
圖3由集落引物生成的DNA集落。它顯示了每個20X視野觀察到的集落數是結合于孔的模板濃度的函數。可測得的模板最低濃度為10-13M。
圖4兩種不同模板產生的集落之間的區別。圖4a顯示了由兩種模板陰性對照產生的集落的圖像。圖4b顯示了在同一孔的相同位置用兩種不同顏色顯影的兩種模板形成的集落和陰性對照。圖4c顯示了顯微鏡視野的分段中兩種集落類型的配位。圖4c證明了不同模板生成的集落互不一致。
圖5附著在玻璃上的模板或寡核苷酸的反應圖解。步驟A是表面的衍生用酸溶液處理載玻片，以提高表面上游離的羥基。將預處理的載玻片浸入氨基硅烷溶液中。ATS(氨基丙基三乙氧基硅烷)B1或B2是用交聯劑功能化的玻璃表面，然后附著寡核苷酸。通過酰胺鍵，氨基與交聯劑相互作用步驟B1；s-MBS(硫代間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)。步驟B2:s-SIAB(硫代N-琥珀酰亞胺基[4-碘乙酰]氨基苯甲酸)通過在馬來酰亞胺的硫醇和雙鍵之間形成的共價鍵，寡核苷酸(5′端硫醇修飾的寡核苷酸)附著于表面。磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1M NaH2PO4,pH:6.5,0.15M NaCl)。B3用EDC和咪唑附著寡核苷酸。存在EDC時，將修飾的寡核苷酸的5’端磷酸與咪唑反應，產生5′-磷-咪唑衍生物(未顯示)。氨基磷酸酯的衍生物與衍生的玻璃表面氨基結合。EDC:1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽。
圖6顯示作為結合于孔的模板濃度的函數，觀察到的每個20X視野集落的數量。通過偶聯劑(EDC)中介DNA模板以不同濃度結合于氨基衍生的玻璃表面(A)s-MBS功能化的玻璃表面(B)。用限制性內切酶處理雙鏈DNA集落，將回收的單鏈與互補的寡核苷酸(cy5熒光標記)雜交。
圖7顯示了在玻璃上產生的DNA集落原位測序的實例。圖7A顯示了在未與引物p181培育的樣品上用Cy5TM-dCTP培育后的結果。只能觀察到5個模糊的點，表明沒有發生明顯的干擾作用(如Cy5TM-dCTP凝集沉淀，吸附或簡單的非特異性摻入集落中的DNA或表面上的DNA)。圖7B顯示了在與引物p181培育的樣品上用Cy5TM-dUTP培育后的結果。沒有觀察到熒光斑點，表明當用于摻入的核苷酸與雜交的引物產生的模板序列不相應時，不產生可檢測量的熒光堿基的摻入。圖7C顯示了在與引物p181培育的樣品上用Cy5TM-dCTP培育后的結果。可以觀察到許多熒光斑點，表明當用于摻入的核苷酸與雜交的引物產生的模板序列相對應時，確實可產生可檢測量的熒光堿基的摻入。
圖8顯示了PCR循環之前和之后，附著于Nucleolink的寡核苷酸與探針的雜交。此圖顯示了R58與CP2(5′-(磷酸)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的雜交，空心環，與CP8(5′-(氨基-1,6亞己基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的雜交，實心三角形，與CP9(5′(羥基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的雜交，菱形，與CP10(5′(二甲氧基三苯甲基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的雜交，實心環，及與CP11(5′(生物素)-TTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)的雜交，空心三角形。
實施例實施例1制備適用于產生DNA集落的DNA模板已從DNA模板和集落引物產生了DNA集落。本文所用的術語“集落引物序列”指相應于集落引物序列的序列，有時也稱為“寡核苷酸序列Y”或“寡核苷酸序列Z′”。
根據選擇的寡核苷酸引物來選擇集落引物的性能，選擇的寡核苷酸引物應在存在耐熱DNA聚合酶時表現出極小的非特異性核苷酸摻入。選出集落引物CPα(5′-pCACCAACCCAAACCAACCCAAACC)和CPβ(5′-pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)，因為存在穩定的DNA聚合酶(AmpliTaq,PerkinElmer,Foster City,CA)時，在標準緩沖液中和熱循環條件下(94℃30秒，65℃1分鐘，72℃2分鐘，50輪)它們的放射標記的α32p-dCTP摻入低。
將3.2Kb DNA片段作為模型系統來證明用集落引物和DNA模板產生集落的可行性。選擇的模板含有前述糖基化終產物受體的人基因(HUMOXRAGE,GenBank Acc.No.D28769)。表1中列出了RAGE-特異性引物。用PCR擴增在標準緩沖液和熱循環條件(94℃30秒，65℃1分鐘，72℃5分鐘，40輪)下，從0.1μg人基因組DNA和1μM引物TP1和TP2，以及1單位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，產生了3.2Kb模板。將此3.2Kb的DNA片段用作模板進行第二次PCR，產生兩個較短的模板用于產生集落(模板A和B)。用于產生較短模板的引物含有對模板和集落引物CP1和CP2的序列特異性的序列，來擴增固相表面上的DNA。通常，用磷酸或硫醇基因在5′端修飾用于產生DNA模板的PCR引物。所以，PCR擴增后，產生的DNA片段在連接于感興趣RAGE DNA片段的一個末端或兩個末端上含有集落引物序列(見圖2a)。
在標準緩沖液和熱循環條件(94℃30秒，65℃1分鐘，72℃1分鐘，30輪)下，用0.1ng 3.2Kb模板和1μM引物TPA1和TPA2，以及1單位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，產生模板A(在兩個末端含集落引物序列、CPβ的雙鏈模板)。然后將產物在Qiagen Qia-快速柱(QiagenGmbH,Hilden,Germany)上純化。
在標準緩沖液和熱循環條件(94℃30秒，65℃1分鐘，72℃1分鐘，30輪)下，用0.1ng 3.2Kb模板和1μM引物TPB1和TPB2，以及1單位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，產生模板B(含相應于CPβ的集落引物序列的雙鏈模板)。然后將產物在Qiagen Qia-快速柱(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)上純化。
在標準緩沖液和熱循環條件(94℃30秒，65℃1分鐘，72℃1分鐘，30輪)下，用0.1ng 3.2Kb模板和1μM引物TPB3和TPB4，以及1單位DNA聚合酶(AmpliTaq,Perkin Elmer,Foster City,CA)，產生模板B′(在兩個末端之一含相應于CPα和CPβ的集落引物序列的雙鏈模板)。然后將產物在Qiagen Qia-快速柱(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)上純化。
表1中列出了所有用于DNA模板制備和生成DNA集落的特異性寡核苷酸以及化學修飾。
圖2b中列出了將集落引物和模板化學附著于玻璃表面的常規流程，其中顯示了用ATS來衍生作為非限制性實例。
表1用于制備模板和產生集落的寡核苷酸目錄
HUMOXRAGE基因登錄號D28769的座標(R)表示“反向”(F)表示“正向”。
實施例1a制備側接簡并引物的隨機DNA模板將3.2Kb DNA片段作為模型系統來證明從隨機引物PCR擴增生成集落的可行性。這種策略也可用于長度約為100Kb的DNA片段的測序(將片段與全基因組結合)。用PCR約為從人基因組DNA生成3.2Kb的DNA片段PCR引物為；TP1 5′-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG和TP2 5′-pCCTGTGACAAGACGACTGAA(如實施例1所述)。用組合的限制性內切酶將3.2Kb的片段切割成較小的片段(EcoR1和HhaⅠ產生約800bp的4個片段)。然后將切開的或未切開的片段DNA與簡并引物，p252(5′-P TTTTTTTTTTISISISISISIS，其中I代表肌苷(與A、T和C配對)，S代表G或C)混合，并共價偶聯于Nucleolink孔(Nunc,Denmark)。然后將管作隨機固相PCR擴增，與標記的DNA探針雜交來觀察(如實施例2a所述)。
實施例2將DNA模板和集落引物共價結合于固相支持物(塑料)上并與集落引物形成集落將模板和集落引物共價結合于固相支持物(塑料)上在存在不同劑量的模板A(如實施例1所述制備)時，將5′末端磷酸化的集落引物(CP2,5′-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(Microsynth GmBH,Switzerland)附著于Nucleolink塑料微量滴定孔(Nunc,Denmark)中。用CP2設置了8個孔，一式兩份，7種模板的1/10稀釋度，以最高濃度1nM起始。
如下制備共價結合了CP2集落引物和模板的微量滴定孔。在每個Nucleolink孔中加入30μl以10mM1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemical)配制的1μM集落引物溶液和從1nM開始稀釋的不同濃度的模板。在每個孔中，將10μl用10mM1-甲基-咪唑配制的40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(pH7.0)(Sigma Chemicals)加入到集落引物和模板的溶液中。然后將孔密封，50℃培育過夜。培育后，用200μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween20)漂洗諸孔兩次，與200μl RS培育15分鐘，用200μl RS漂洗兩次，用200μlTNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)漂洗兩次。50℃干燥管，4℃儲存在密封的塑料袋中。
生成集落在每個孔中加入20μl PCR混合物；四種dNTP(0.2mM)、0.1％BSA(牛血清白蛋白)、0.1％Tween 20、8％DMSO(二甲基亞砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR緩沖液和0.025單位/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)，來引發集落生長。然后將諸孔置于熱循環儀中，94℃培育密封的孔5分鐘，并進行50次下述條件的循環94℃30秒，65℃2分鐘，72℃2分鐘，使其生長。完成這一過程后，將諸孔保持在8℃直至下一步使用。雜交前，將50μl TE(10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4)加入各孔，94℃加熱5分鐘，冰上冷卻，然后在45℃加入探針。
集落的觀察探針探針是1405個堿基對的DNA片段，含有3′端的模板序列(核苷酸位置8405到9259)。DNA探針是用PCR擴增合成的，兩個引物為p47(5′-GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA)，從堿基8405開始擴增，和TP2(在5’端生物素酰化)，從反義鏈的堿基9876開始擴增。
雜交和檢測以“easyhyb”(Boehringer-Mannheim,Germany)將探針稀釋到1nM，并在每個孔中加入20μl。將探針和集落94℃變性5分鐘，然后50℃培養6小時。50℃以含0.1％Tween的2x SSC洗去過量的探針。室溫，將DNA探針結合于TNF中的直徑0.04μ(Molcular Probes)的包被親和素的綠熒光球1小時。用TNT洗滌過量的小珠。用顯微鏡觀察集落，如實施例2a所述作影像分析。圖3顯示了作為結合于孔的模板濃度的函數所觀察到的每20X視野的集落數。可測得模板的最低濃度為10-13M。
實施例2a:DNA模板和集落引物共價附著于固相支持物(塑料)并與簡并引物形成集落模板和集落引物共價附著于固相支持物(塑料)如下用p252和模板DNA片段制備微量滴定孔在每個Nucleolink孔中加入30μl以10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemical)配制的1μM集落引物p252溶液和從0.5nM開始稀釋的不同濃度的模板。在每個孔中，將用10mM1-甲基-咪唑配制的10μl,40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(pH7.0)(Sigma Chemicals)加入到集落引物和模板的溶液中。然后將諸孔密封，50℃培育過夜。培育后，用200μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween 20)漂洗諸孔兩次，與200μl RS培育15分鐘，用200μl RS漂洗兩次，用200μlTNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)漂洗兩次。50℃干燥管，4℃儲存在密封的塑料袋中。
生成集落DNA集落生成是用改進的方案進行的以便隨機引導，在每個孔中加入20μlPCR混合物；四種dNTP(各0.2mM)、0.1％BSA、0.1％Tween 20、8％DMSO(二甲亞砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR緩沖液和0.025單位/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)。然后將諸孔置于熱循環儀中，通過94℃培育密封的孔5分鐘，并進行50次下述條件的循環94℃30秒，65℃2分鐘，72℃2分鐘，進行擴增。完成這一過程后，將諸孔保持在8℃直至進一步使用。雜交前，將50μl TE(10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4)加入各孔，94℃加熱5分鐘，冰上冷卻，然后在45℃加入探針。
集落的觀察探針兩個546個堿基對和1405個堿基對的DNA片段，含有待PCR擴增的初始模板的兩末端之一的序列。通過用5′-生物素酰化PCR引物，用生物素標記該探針的反義鏈。探針的堿基對座標是6550到7113和6734到9805。
雜交和檢測以“easyhyb”(Boehringer-Mannheim,Germany)將探針稀釋到1nM，并在每個孔中加入20μl。94℃使探針和集落變性5分鐘，然后50℃培育6小時。50℃以含0.1％Tween的2x SSC洗去過量的探針。室溫，將DNA探針結合于TNF中的直徑0.04μm(Molcular Probes,Portland OR)的包被親和素的綠熒光球1小時。用TNT洗滌過量的小珠。用連接于768(H)×512(V)像素-CCD照相機(Princeton Instruments Inc.Trenton,NJ,USA)的倒置顯微鏡(用Axiovert S100TV上的20x/0.400LD Achroplan物鏡，和電弧汞燈HBO100W/2,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)檢測熒光。對FITC和Cy5分別通過Omega Optical的濾色裝置XF22(Ex:485DF22,Dichroic:505DRLPO2 Em:530DF30)和XF47(Ex:640DF20,Dichroie:670DRLPO2 Em:682DF22)曝光20秒。用Winwiew軟件(Princeton Instruments Inc.,Trenton NJ,USA)分析數據。用內部開發的圖像分析軟件計算一式二孔中每視野的集落數。
實施例3對由各種比例的2種不同共價結合的模板和集落引物產生的不同集落的序列區別將模板和集落引物共價結合于固相支持物(塑料)上在存在不同劑量的兩模板A和B(如實施例1所述制備)時，將5′末端磷酸化的集落引物(CP2:5′-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(Microsynth GmBH,Switzerland)移植到Nueleolink塑料微量滴定孔(Nunc,Denmark)中。設置8個孔為一系列一式二孔兩種模板，各7種1/10稀釋度，以最高濃度1nM起始。模板稀釋是以相反的方向設置的，一種模板的最高濃度與另一種模板的最低濃度恰好重合。
如下制備CP2引物和兩種模板共價結合的微量滴定孔。在每個Nucleolink孔中加入301μl以10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemical)配制的1μM集落引物溶液和從1nM開始稀釋的不同濃度的兩種模板。在每個孔中，將10μl用10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)配制的40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(pH7.0)(Sigma Chemicals)加入到集落引物和模板的溶液中。然后將孔密封，50℃培育4小時。培育后，用50μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween20)漂洗諸孔3次，與50μl RS培育15分鐘，用50μl RS漂洗3次，用50μl TNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)漂洗3次。將管4℃保藏在TNT中。
生成集落在每個孔中加入20μl PCR混合物；四種dNTP(0.2mM)、0.1％BSA、0.1％Tween 20、8％DMSO(二甲基亞砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR緩沖液和0.025單位/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)，來引發集落生長。
然后將諸孔置于熱循環儀中，94℃培育密封的孔5分鐘，并進行50次以下條件的循環94℃30秒，65℃5分鐘，72℃5分鐘，使其生長。完成這一過程后，將諸孔保持在8℃直至下一步使用。雜交前，將50μl TE(10mMTris,1mM EDTA,pH7.4)加入各孔，94℃加熱5分鐘，冰上冷卻，然后在45℃加入探針。
集落的觀察探針相應于3.2Kb DNA片段的5′-和3′-端序列的兩個546個堿基對和1405個堿基對的DNA片段，用一種生物素酰化的引物(見實施例2)進行PCR擴增。94℃加熱5分鐘使這兩種探針變性，然后在1M NaCl、10mM Tris(pH7.4)中迅速冷卻，并讓它們結合于包被鏈霉親和素的標記有不同顏色的直徑0.04μm的熒光球上。將結合于小珠的探針以預熱到50℃的″easyhyb″溶液稀釋20倍。在每個含變性集落的孔中加入20μl探針。
雜交和檢測50℃進行雜交5小時。50℃以含0.1％SDS的2x SSC洗滌過量的探針。用20X物鏡的顯微鏡觀察集落，20秒曝光，如實施例2a所述作成像分析。圖4a顯示了由兩種模板和陰性對照產生的集落的圖像。圖4b顯示了用兩種不同顏色和負對照觀察到的同一孔中相同位置由兩種模板產生的集落。圖4c顯示了顯微鏡視野的分段中兩種集落類型的座標。圖4c顯示了不同模板生成的集落不恰好重合。
實施例4:DNA模板和寡核苷酸共價結合于玻璃固相表面用異-雙功能交聯劑，以氨基硅烷衍生的載玻片為固相支持物，來共價結合硫醇修飾的寡核苷酸探針。選擇的試劑具有硫醇反應活性(馬來酰亞胺)和氨基反應活性基團(琥珀酰亞胺酯)。寡核苷酸附著率和固定分子的穩定性主要取決于交聯劑對所進行的不同處理條件的穩定性。圖5顯示了DNA模板或寡核苷酸附著于玻璃的反應流程。
已評估了由交聯劑s-MBS和s-SIAB制備的載玻片的儲存穩定性和其熱穩定性。影響固定的寡核苷酸探針雜交程度的重要因素是附著的探針的密度(Beattie等人，1995；Joss等人，1997)。我們研究了改變固定期間寡核苷酸濃度和分析經雜交而附著的寡核苷酸密度的這種影響。
材料和方法將酸預處理的顯微鏡載玻片-Microscope glass slides(Knittel,MerckABS)浸泡在堿性Helmanex溶液(HelmanexⅡ0.25％,1N NaOH)中1小時。用水漂洗載玻片，在1N HCl中浸泡過夜，再用水漂洗，在硫酸溶液(H2SO4/H2O,1/1,v/v，加入少量新鮮高硫酸銨)中處理1小時。在水、乙醇中漂洗載玻片，最后用純丙酮漂洗。干燥載玻片，真空下儲存至進一步使用。
硅烷化表面-將預處理過的載玻片浸入用丙酮配制的5％ATS(氨基丙基三乙氧基硅烷，Aldrich)中。室溫進行硅烷化2小時。在丙酮中洗滌3次后，用乙醇漂洗載玻片1次，干燥，真空儲存。
交聯劑附著-將交聯劑s-MBS和s-SIAB(分別為硫代間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯、硫代N-琥珀酰亞胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸，Pierce,Rockford IL)，制備成以PBS(磷酸鹽緩沖液，0.1M NaH2PO4,pH7.2,0.15M NaCl)配的20mM溶液。將80μL交聯劑溶液加到硅烷化載玻片上，覆蓋潔凈的微型蓋玻片，20℃反應5小時。以PBS淋洗載玻片，以水簡單漂洗一下，然后以乙醇淋洗。隨后干燥載玻片，暗處真空儲存至下一步使用。
寡核苷酸附著-利用標準亞磷酰胺的化學性能，合成含有5′硫醇修飾(CP3和CP4 Eurogentec,Brussels)或磷酸基團修飾(CP1和CP2,Eurogentec,Brussels)的寡核苷酸。
制備-5′-硫醇寡核苷酸引物(CP3和CP4)成為以磷酸鹽緩沖液(NaPi:0.1M NaH2PO4pH:6.6,0.15M NaCl)配的100μM溶液，并以1μl滴加到功能化的載玻片(用交聯劑功能化)上，室溫5小時。將載玻片置于飽和濕潤的氣氛中，以避免蒸發。搖床上在NaPi緩沖液中洗滌載玻片。在熱穩定性研究中，將載玻片浸入Tris緩沖液(10mM,pH8)中100℃5分鐘，2次，4℃直接浸入5xSSC(0.75M NaCl,0.075M檸檬酸鈉pH7)5分鐘。將載玻片儲存在4℃ 5XSSC中以備后用。
室溫以含40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺(EDC,Pierce,Rockfore IL)的10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemicals)的1μM溶液，將-5′-磷酸寡核苷酸引物(CP1和CP2)加到(1μl滴加)氨基衍生的玻璃上5小時。100℃在Tris緩沖液(10mM,pH8)中洗滌載玻片2次，直接浸泡在4℃5XSSC中5分鐘。4℃將載玻片儲存在5XSSC中以備后用。
寡核苷酸和DNA模板附著在磷酸鹽緩沖液(NaPi:0.1M NaH2PO4pH:6.6,0.15m NaCl)中將5′-硫醇寡核苷酸引物(CP3和CP4)和5′-硫醇模板B′混合。DNA模板的濃度從0.001到1μM不同，引物濃度從0.1到100μM不同，但模板和引物分別以1μM和100μM為最佳濃度。然后如上所述進行使CP3和CP4在功能化玻璃表面附著的步驟。
在含40mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺(EDC,Pierce,Rockford IL)的10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemicals)溶液中，將5’-磷酸寡核苷酸引物(CP1和CP2)和5’-磷酸模板B混合。DNA模板的濃度從0.001到10nM不同，引物濃度從0.1到1μM不同，但模板和引物分別以10nM和1uM為最佳濃度。然后如上所述進行使CP1和CP2在氨基衍生的玻璃表面附著的步驟。
在熒光探針-寡核苷酸探針雜交中，由Eurogentec(Brussels)合成了5’端熒光標記有Cy5或FITC的探針。為了防止非特異性雜交，在封閉溶液(5xSSC,Tween 0.1％,BSA 0.1％)中培育載玻片1小時，置于5xSSC中在搖床上洗滌(2次，5分鐘)。在5xSSC,Tween 0.1％中將寡核苷酸探針稀釋到0.5μM，室溫加樣到玻璃表面2小時。37℃在搖床上漂洗載玻片，一次用5xSSC洗5分鐘，兩次用含1％SDS的2xSSC洗5分鐘。
用放射標記的探針-放射標記的寡核苷酸(互補于共價連接的寡核苷酸)的雜交作為雜交探針，來定量測定雜交率。用噬菌體T4多聚核苷酸激酶(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)，在寡核苷酸的5’端用[γ-32P]dATP(Amersham,UK)進行酶促標記。用Chroma Spin柱TE-10(Clontech,Palo Alto CA)除去過量的[γ-32P]dATP。然后室溫將放射標記的寡核苷酸(0.5μM以5xSSC,Tween0.1％配)加樣到衍生的載玻片上2小時。然后將載玻片置于搖床上，37℃以5xSSC漂洗5分鐘，以2xSSC SDS 0.1％漂洗2次，5分鐘。雜交后，用閃爍計數測定特異性活性。
顯微鏡觀察-用5xSSC溶液和微型蓋玻片覆蓋載玻片。用氬汞燈HBO100W/2(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)倒置顯微鏡Axiovert S100TV，其連接了裝備有CCD陳列的Kodak CCD照相機，模式為768(H)×512(V)像素；6.91×4.6mm總尺寸，像素尺寸9×9μm2(Princeton Instruments Inc.Treton,NJ,USA)，來測定熒光。用物鏡LD Achroplan 20x/0.400(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)和濾光裝置XF22(Ex:485DF22，二向色505DRLPO2 EM:530DF30)和XF47(Ex:640DF20，二向色670DRLPO2 EM:682DF22)(Omega Optical(Brattleboro VT)，分別用于FITC和Cy5熒光)，曝光時間在1和50秒之間。用Winwiew軟件(Princeton Instruments Inc.,Trenton NJ,USA)來分析數據。
結果評估附著儲存穩定性和熱穩定性我們評估了用s-MBS和s-SIAB制備的玻璃板的儲存穩定性。由于這些試劑對水解敏感，寡核苷酸附著率將取決于它們的穩定性。用新鮮制備的交聯劑s-MBS和s-SIAB功能化氨基衍生的玻璃板。交聯劑附著后，將功能化的載玻片儲存于室溫、暗處真空干燥器中10天。然后分析儲存的載玻片(t=10天)和用交聯劑新鮮制備的載玻片(t=0)。比較二化學試劑在硫醇-寡核苷酸反應后和互補熒光探針雜交后，在t=0和t=10天得到的數據。
如t=0和t=10天得到相同雜交率所證明一旦固定，10天儲存后s-SIAB-功能化的載玻片完全穩定。相反，發現偶聯s-MBS的玻璃穩定性較差，10天儲存后寡核苷酸附著率和雜交率減少30％。結論是s-SIAB功能化的載玻片在暗處真空干燥儲存至少10天，如同其先前制備的那樣，探針附著率無任何降低。
為了評估附著于玻璃的寡核苷酸的熱穩定性，將載玻片在10mM Tris-HCl(pH8)中100℃處理5分鐘，2次。洗滌后將殘留的仍固定的寡核苷酸與熒光標記的互補寡核苷酸雜交進行分析。在第一次5分鐘洗滌后，從s-SIAB載玻片釋放出約14％附著的分子，從s-MBS載玻片釋放出約17％附著的分子，但第二次洗滌后就這兩種化學物而言，都未測得進一步的釋放(表1A)。這些結果可與Chrisey等人(1996)得到的結果相比，他們測得80℃在PBS中處理10分鐘后，通過交聯劑SMPB(琥珀酰亞胺4-[對-馬來酰亞胺苯基]丁酸酯)附著于熔凝硅石載玻片上的寡核苷酸有62％以上的釋放。
表1A
表1A熱穩定性研究寡核苷酸附著于s-MBS或s-SIAB功能化的載玻片。通過與熒光標記的互補寡核苷酸雜交來分析附著的寡核苷酸。將得到的最高熒光信號標準化成100。列出了重復3次分析的平均值。
作為探針附著函數的雜交我們研究了作為附著的寡核苷酸(用s-MBS、s-SIAB交聯劑和EDC-介導的反應)表面覆蓋的函數，共價結合的寡核苷酸探針的雜交程度。用于固定的寡核苷酸的濃度為1μM(對EDC)，對交聯劑則可在1到800μM之間變化，通過與32P-標記探針的雜交來分析表面密度。用異雙功能交聯劑引物附著的最佳濃度為500μM，這與60fmol/mm2(s-MBS)和270fmol/mm2(s-SIAB)雜交分子附著的表面密度相等。用EDC/咪唑-介導的5’磷酸寡核苷酸附著于氨基硅烷化的玻璃獲得了與s-MBS類似的覆蓋密度。但得到相同附著率僅需要1μM寡核苷酸溶液，這就表示與EDC/咪唑偶聯策略相比，對于s-MBS化學試劑附著的寡核苷酸需要過量500倍(表1B)。
表1B
表1B作為探針附著函數的雜交使寡核苷酸附著于用s-MBS或s-SIAB或通過介導的活性試劑EDC功能化的載玻片。通過與放射標記的互補寡核苷酸雜交來分析附著的寡核苷酸。通過閃液來測定雜交的分子的特異活性和密度。NT沒有測試。
60fmol/cm2表面密度相應于8nm結合寡核苷酸之間的平均分子間距。按我們的結果，30foml/mm2覆蓋密度(間隔20nm)足以得到DNA集落。這種產率可用EDC介導的方法，用異雙功能交聯劑s-SIAB或1μM探針100μM固定引物獲得。我們得到的雜交密度在先前報道的其他移植方法在載玻片使得到的最高密度范圍中(Guo等人，1994,Joss等人，1997,Beattie等人，1995)。
在玻璃上生成DNA集落集落的形成取決于模板的長度、濃度和引物的濃度理論上，DNA集落的形成要求相應于DNA模板適當長度的附著于表面的引物的適當密度。對于最佳DNA集落生成而言，重要的是確定結合的引物和模板的密度范圍，以及模板和引物的化學計量比。
材料和方法制備載玻片如上所述(材料和方法)，衍生和功能化載玻片。DNA集落引物為CP1和CP2。如實施例1對模板B′所述，制備了集落模板，但用引物TPB3和TPB2。將不同濃度的修飾的集落引物和集落模板加樣到玻璃表面。
產生集落將儲存在5XSSC中的載玻片以微過濾水洗滌除去鹽。在玻璃表面用PCR混合物(四種dNTP(0.2mM),0.1％BSA,0.1％Tween 20,1XPCR緩沖液和0.05U/μl AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Foster City,CA))引發集落的生長。將PCR混合物置于一框架密封室中(MJ Research,Watertown,MA)。將載玻片置于熱循環儀(The DNA Engine,MJ Research Watertown,MA)中，如下進行熱循環步驟1在94℃1分鐘，步驟2在65℃3分鐘，步驟3在74℃6分鐘，并將此程序重復50次。完成這程序后，將載玻片置于6℃以備后用。
雙鏈DNA集落的消化通過覆蓋以1X消化緩沖液配制的限制性內切酶，用限制性內切酶切割含DNA的玻璃表面。37℃將此反應進行2次為時1小時30分鐘。將載玻片浸入100℃ tris緩沖液(10mM,pH8)中2次5分鐘，然后4℃在5XSSC中漂洗，使雙鏈DNA集落變性。將載玻片儲存在5XSSC中以備后用。
單鏈DNA集落的雜交為了防止非特異性雜交，在封閉溶液(5XSSC,0.1％Tween,0.1％BSA)中培育載玻片1小時，然后在5XSSC中漂洗載玻片(2次，5分鐘)。以SSC5X,Tween 0.1％將5’端有熒光Cy5標記的寡核苷酸(Eurogntec Brussels)稀釋到0.5μM，并加樣到玻璃表面至少2小時。37℃在搖床上漂洗載玻片，在SSC5X中漂洗5分鐘，在SSC 5X,SDS 0.1％中漂洗2次5分鐘。
如上所述觀察載玻片。
我們先前觀察到雜交程度是寡核苷酸附著密度的函數。對用結合的DNA模板作的類似研究表明，集落的形成也是附著于載玻片模板濃度的函數。根據用于寡核苷酸和模板附著的化學試劑，對雙功能交聯劑s-MBS(圖6B)而言模板的最佳濃度為1μM，對EDC碳二亞胺而言(圖6A)，最佳濃度為1nM。令人感興趣的是，對EDC化學試劑而言，較高濃度的模板不增加集落的數量，且似乎達到相應于最大集落數的平臺。
我們研究了作為加樣到表面的引物濃度和DNA模板濃度以及DNA模板長度函數的集落形成(數)。
我們也評估了各集落中模板的拷貝數。定量測定是基于用Cy5-,Cy3-作的熒光測定或添加了抗漂白劑(Prolong,Molecular Probes,Portland OR)的熒光標記的熒光團測定。通過在附著于表面的引物上作雜交試驗進行標定，作為通過放射性測定的確切相應的密度。
實施例5集落原位DNA測序首先室溫將載玻片(5mm直徑，Verrerie de Carouge,Switzerland)置于Helmanex 0.2％(在水中)、NaOH 1N浴中1小時，然后用蒸餾水漂洗，在純己烷中漂洗，用蒸餾水漂洗2次，用HCl 1M處理過夜(室溫)。然后，用蒸餾水漂洗它們2次，室溫用H2SO4(50％)+K2S2O8處理1小時。將它們在蒸餾水中漂洗，然后在乙醇中漂洗2次。用ATS衍生載玻片(如實施例4所述)。
將5’磷酸化(Microsynth GmbH,Switzerland)的集落引物CP1(5’-pTTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC)和CP2(5’-pTTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)和DNA模板B(如實施例1所述制備)5’共價附著于5mm直徑的載玻片(Verrerie de Carouge,Switzerland)使，使得終濃度分別為1μM和10nM，過程如下將兩種引物各2nmol加入到0.2nmol模板中，該模板以1ml溶液A(用50ml水配制的41μl甲基咪唑(Sigma,#M-8878)，用HCl將pH調節到7)配，然后1∶1與溶液D(用10ml溶液A配制的0.2mM EDC)混合。在載玻片的兩邊加3.5μl混合物，并室溫培育過夜。然后用5xSSC緩沖液簡單漂洗載玻片，置于100℃10mM Tris緩沖液(pH8.0)中，2次5分鐘。
室溫以5xSSC緩沖液配的1mg/ml牛血清白蛋白(BSA,BoehringerMannheim GmbH,Germany,#238040)封閉玻璃非特異性位點1小時，然后用蒸餾水漂洗。
然后將各載玻片單獨置于含170μl PCR混合物的MicroampTM反應管(Perkin Elmer)中，用Taq聚合酶(AmpliTaq,PE-Applied Biosystems Inc.,FosterCity CA)生成DNA集落，在MTC200熱循環儀(MJ Research,Watertown,MA)中進行50輪(94C/60″,60C/3′,72C/6′)。37℃，用以NEB2緩沖液(NewEngland Biolabs)配制的1.3單位的PvuⅡ(Stratagene)消化各載玻片2次，45分鐘。消化后，將管置于100℃10mM Tris緩沖液pH8.0中(2×5′)，然后室溫用過濾過的(Millex GV4,Millipore)用2xSSC緩沖液配制的1mg/ml BSA封閉30分鐘，在2xSSC 0.1％SDS緩沖液中漂洗，然后在5xSSC緩沖液中漂洗。室溫，將各載玻片與含1μM測序引物p181(CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC)的5xSSC/0.1％Tween 20緩沖液培育過夜。將無引物的對照置于5xSSC0.1％Tween 20緩沖液中。37℃將載玻片用5xSSC 0.1％SDS洗滌2次，5分鐘，然后在5xSSC中漂洗。引物p181可與模板B’雜交，p181后面的序列是CAGCT……為了便于聚焦，通過室溫與用5X SSC配制的20μl 1/2000稀釋的200nm黃/綠熒光、包被有鏈霉親和素的FluoSpheres(R)珠(Molecular Probes,Eugene,OR)培育20秒，將綠色熒光珠吸附到孔的底部。
與引物雜交后，在每個載玻片上加入2μl含0.1％BSA、6mM二硫蘇糖醇(Sigma Chemicals)、5μM Cy5TM-dCTP或5μM Cy5TM-dUTP(Amersham,UK)和1X測序酶緩沖液的溶液。Cy5TM-核苷酸的加入是以室溫加入1.3單位T7測序酶TMDNA聚合酶(Amersham,UK)2分鐘開始的。在5X SSC/0.1％SDS浴中洗滌各孔15分鐘，并用5xSSc緩沖液漂洗。
用帶Micromax 512×768 CCD照相機和Winview軟件(PrincetonInstruments,Trenton,NJ)的倒置顯微鏡(Axiovert S100TV,Carl Zeiss AG,Oberkochen,Germany)觀察樣品。對聚焦而言，用20X物鏡和XF 22濾光裝置(Omega Optical,Brattleboro,VT)，對觀察Cy5TM滲入樣品而言，用20X物鏡和XF47濾光裝置(Omega Optical)并用2×2像素重新分級(pixel binning)曝光50秒。用XF47濾光裝置和50秒曝光，黃/綠FluoSpheres(R)(約100/視野區域)沒有得到可檢測的信號(數據沒有顯示)。用該程序Winview(PrincetonInstruments)得到照像。
圖7A顯示了在未與引物p181培育的樣品上用Cy5TM-dCTP培育后的結果。只能觀察到5個模糊的斑點，表明沒有發生明顯的不合邏輯作用(如Cy5TM-dCTP凝集沉淀，吸收或簡單的非特異性摻入集落中的DNA或表面上的DNA)。圖7B顯示了在與引物p181培育的樣品上用Cy5TM-dUTP培育后的結果。沒有觀察到熒光斑點，表明當用于摻入的核苷酸與雜交的引物后面的模板序列不相應時，不產生可檢測量的熒光堿基的摻入。圖7C顯示了在與引物p181培育的樣品上用Cy5TM-dCTP培育后的結果。可以觀察到許多熒光斑點，表明當用于摻入的核苷酸與雜交的引物后面的模板序列相應時，確實可產生可檢測量的熒光堿基的摻入。總之，我們證實可將序列特異性形式熒光核苷酸滲入集落所含的DNA中，可用上述方法和裝置監測這種滲入。但這僅是一個例子。也可以理解如果需要，可將熒光堿基的滲入重復多次。由于這是以序列特異性方式進行的，所以可以推論出集落中所含的DNA部分序列。
實施例6:5’mRNA序列標記分析監測細胞或組織中基因表達的最精確方法是減少樣品收集和mRNA評分之間的步驟數目。可從商業上得到快速分離mRNA的新方法。最有效的方法包括快速分離樣品、即刻將細胞破裂到鹽酸胍溶液中，完全裂解成蛋白質并使RNAses失活。然后用寡核苷酸-dT親和層析純化裂解細胞上清液中的mRNA。最后，可用簡單的方法特異性導向5’-加帽的mRNA將其轉化入cDNA(SMART cDNA synthesis,Clontech,Palo Alto)。
這種方法可以合成僅有翻譯活性的5’-加帽mRNA的cDNA拷貝。通過將上述迅速分離mRNA的方法與本申請所述的產生DNA集落的移植模板法制備的cDNA相結合，就有了高產率鑒定大量5’mRNA序列標記的方法。本發明的優點是通過直接移植cDNA合成反應的產物、將cDNA擴增成千上萬的拷貝，然后同時原位測定cDAN的序列，而能夠來測定大量cDNA的序列。
材料和方法合成的寡核苷酸和質粒-由Eurogentec或Microsynth用5’-磷酸合成了寡核苷酸。用標準方法產生了在T3 RNA聚合酶啟動子后含小鼠鉀通道基因mSlo的3′-非翻譯和部分編碼序列的質粒。
mRNA的合成-在此質粒聚A+序列后的單個SalⅠ或SacⅠ限制性內切酶位點將mSlo質粒線化。用蛋白酶K處理切割好的質粒后，用苯酚/CH3Cl/異戊醇提取一次線性質粒DNA，并用乙醇沉淀。將DNA沉淀重溶解在H2O中，濃度為10μg/μl。按制造說明書(Ambion,Austin TX)，在體外用mRNA合成試劑盒中mMessage mMachine合成了5′-甲基鳥苷加帽的合成的mRNA。將合成的mRNA儲存于80℃。
酶-從New England Biolabs(Beverly,MA)得到限制性內切酶。
cDNA的合成-以不同摩爾比例(1∶1,1∶10,1∶100)將合成的mRNA與小鼠肝聚A+mRNA混合，并用有某些改進的“SMART PCR cDNA合成試劑盒”(Clontech,Palo Alto CA)在合成的和小鼠肝mRNA的混合物上進行cDNA的合成。在cDNA反應中，將約1μg mRNA混合物與引物CP5混合，該引物具有CPβ的序列的5’端(5′p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTTNN)。該引物可用于制造第一條鏈cDNA合成。對第二條鏈的合成，可用“SMART”技術。SMART合成的基礎是當mRNA含有5’-甲基鳥苷-加帽時，利用Moloney鼠病毒逆轉錄酶的特性在第一條cDNA鏈的3’末端添加3到5個脫氧胞嘧啶殘基(SMART user manual,Clontech,Palo AltoCA)。用在3’端含有CPβ序列和AAAGGGGG的CP6引物(5′-pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG)，來合成第二條cDNA。如說明書所述使用Moloney鼠白血病毒的SUPERSCRIPTTMⅡ RNase H-逆轉錄酶和緩沖液(LifeTechnologies,Ltd.)，并在42℃下進行反應1小時。通過PCR分析cDNA，所用的引物p251含有CPβ序列的片斷，(5’-GAGAAGGAAAGGGAAAGG)和Taq DNA聚合酶(Platinum Taq,Life Technologies,Ltd.)。
制備DNA集落-將5’p-cDNA與不同濃度的固相集落引物CP2(5’p-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)混合，并按制造商說明用化學方法結合于Nucleolink PCR管(NUNC)上。然后在MTC 200熱-循環儀(MJ Research,Watertown,MA)中用Taq聚合酶(AmpliTaq Gold,PE-Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)進行30輪(94C/30″,65C/1′,72C/1.5′)生成DNA集落。
DNA探針和雜交-用5’-生物素酰化的引物和常規的下游引物，通過PCR在模板(mSlo質粒DNA)上合成對mSlo DNA序列特異性的32生物素酰化的和32P-放射標記的DNA探針。在PCR反應中以300∶1(α〔32P〕-dCTP對dCTP)的比例，將探針摻入α〔32P〕-dCTP(Amersham,Amersham UK)，四種三磷酸脫氧核苷的終濃度為50μM。將得到的生物素酰化的和放射標記的DNA探針在Chromaspin-1000柱(Clontech,Palo Alto CA)上脫鹽。用以下溫度方案(在MTC200熱循環儀中)使DNA探針與“easyhyb”緩沖液(Boehringer-Mannheim,Germany)中的樣品雜交94℃5分鐘，隨后每30秒溫度降低0.5℃共68次(換而言之，即在34分鐘中將溫度降至60℃)，用密封的孔。然后室溫用200μl TNT洗滌樣品3次。再用含0.1mg/ml BSA(New England Biolabs,Beverly,MA)的50μl TNT培育這些孔30分鐘。然后用15μl紅色熒光包被有鏈霉親和素的40納米微型小球(Molecular Probes,Portland,OR)的溶液培育這些孔。這種微型小球的溶液是由2μl微型小球的母液制備的，該母液在50W超聲波水浴(Elgasonic,Bienne,Switzerland)中超聲處理5分鐘，以含0.1mg/mlBSA的1ml TNT溶液稀釋，用Millex GV40.22μm孔徑濾膜(Millipore,Bedford,MA)過濾。
DNA集落的觀察-用Axiovert 10倒置顯微鏡、裝備有Micromax 512×768CCD照相機(Princeton instruments,Trenton,NJ)的20X物鏡(Carl Zeiss AG,Oberkochen,Germany)、PB546/FT580/LP590濾光裝置和10秒光聚焦，來觀察著色的樣品。將文件轉化成TIFF格式，用適合的軟件(PhotoPaint,Corel Corp.Ltd,Dublin,Ireland)處理。這種處理包括倒置(inversion)和線性反差增強，以提供在激光打印機上打印出黑白適當的圖像。
結果合成的mRNA和cDNA的合成-cDNA合成后，用p251引物(在cDNA第一條鏈的兩端生成的)來檢驗PCR中的cDNA，是否為如瓊脂糖凝膠電泳分析那樣能產生正確長度的產物。將合成的mSlo mRNA稀釋入肝mRNA中，這可用mSlo-特異性條帶密度的降低和肝cDNA非特異性印跡的增加證明。
DNA集落的檢測和定量-用熒光成像CCD顯微鏡檢查或閃爍計數分析DNA集落。如圖6所示，可檢測到熒光的集落的數量為移植的模板數量的函數而遞增。這種增加可用檢測到的32P-放射標記量來反映。
有了放射標記的探針就可以約1∶100檢測mRNA拷貝。但用熒光顯微鏡CCD成像技術，可以1∶10000稀釋度檢測mRNA。
實施例7引物共價結合于固相支持物(塑料)將寡核苷酸引物附著于Nucleolink塑料微量滴定孔(Nunc,Denmark)，以確定最佳偶聯次數和化學性質。如下將寡核苷酸、CP2(5′-(磷酸)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)、CP8(5′-(氨基-1,6亞己基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)、CP9(5′(羥基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)、CP10(5′-(二甲氧基三苯甲基)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)和CP11(5′(生物素)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG)(Microsynth GmbH,Switzerland)附著于Nucleolink微量滴定孔(每種8個孔)在每個孔中加入20μl用10mM 1-甲基-咪唑配制的含0.1μM寡核苷酸、10mM 1-甲基-咪唑(pH7.0)(Sigma Chemicals)和10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(pH7.0(Sigma Chemicals)溶液。然后將這些孔密封，50℃培育不同的時間。在特定時間用200μl RS(0.4N NaOH,0.25％Tween 20)漂洗2次，用20μl TNT(100mM TrisHCl pH7.5,150mMNaCl,0.1％Tween 20)漂洗2次，終止偶聯反應。50℃干燥這些管30分鐘，4℃將它們儲存在密封的塑料袋中。
在生成PCR集落條件下結合的寡核苷酸的穩定性通過加入PCR混合物(20μl四種dNTP(0.2mM)、0.1％BSA、0.1％Tween20、8％DMSO(二甲基亞砜，Fluka,Switzerland)、1X PCR緩沖液)，來測試在集落生長條件下的穩定性。然后將這些孔置于熱循環儀中，在以下條件進行33輪重復94℃45秒，60℃4分鐘，72℃4分鐘。完成此程序后，用5xSSC、0.1％Tween 20漂洗這些孔，將它們置于8℃以備后用。雜交前，將50μl 5xSSC、0.1％Tween 20(在94℃加熱5分鐘)加入各孔，并在室溫保存。
探針寡核苷酸探針、R57(5′(磷酸)-GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG、對照探針)和R58(5′-磷酸)-CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT，互補于CP2、CP8、CP9、CP10和CP11)，用噬菌體T4多聚核苷酸激酶(New Englandbiolabs,Beverly,MA)，在它們的5’端用[γ-32P]dATP(Amersham,UK)進行酶促標記。用Chroma Spin柱TE-10(Clontech,Palo Alto CA)除去過量的32PdATP。然后將放射標記的寡核苷酸(0.5μM以5xSSC,0.1％Tween 20配)與寡核苷酸衍生的Nucleolink孔37℃雜交2小時。室溫，用5xSSC、0.1％Tween20洗滌這些孔，再用0.5xSSC、0.1％Tween 20洗滌15分鐘(37℃)。隨后用閃爍計數分析各孔的結合探針。
結果取決于寡核苷酸上5′功能基團的特性，寡核苷酸偶聯的速率和特異性有明顯差異。具有5′-氨基偶聯的寡核苷酸比5′磷酸基團功能化的寡核苷酸的速度快約2倍(見表2和圖8)。另外，由5’羥基、5′-DMT或5′-生物素功能化的對照寡核苷酸偶聯的速度都與5′磷酸功能化的寡核苷酸的速度相似，這就提出了用5′磷酸基團化學附著的5′特異性性質的問題。
表2
序列表(1)總說明(ⅰ)申請人(A)名稱應用研究系統ARS股份公司(B)地址14 John B.Gorsiraweg(C)城市庫拉索市(E)國家荷蘭屬安的列斯(F)郵政編碼(ZIP)無(ⅱ)發明名稱核酸擴增和測序方法(ⅲ)序列數量19(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,#1.30版本(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG 24(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CACCAACCCA AACCAACCCA AACC 24(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GAGGCCAGAA CAGTTCAAGG20(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CCTGTGACAA GACGACTGAA20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TTTTTTTTTT CACCAACCCA AACCAACCCA AACC34(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG34(2)SEQ IDNO:7的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TTTTTTTTTT CACCAACCCA AACCAACCCA AACC34(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG34(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸
(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGTTTTTT 30TTTTTTTTTT NN42(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGG 26(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度52個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC 30GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA 52(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGCCTGTG30ACAAGACGAC TGAA 44(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度62個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA30AGGGGCGGCC GCTGAGGCCA GTGGAAGTCAGA 62(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度60個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:TTTTTTTTTT CACCAACCCA AACCAACCCA 30AACCGAGCTC AGGCTGAGGC AGGAGAATTG 60(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGAGCTG 30AGGAGGAAGA GAGG 44(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度52個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCG 35CCTGG TTCTGGAAGA CA 52(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵字修飾的_堿基(B)位置11(C)其他信息/mod_base=i(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵字修飾的_堿基(B)位置13(C)其他信息/mod_base=i(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵字修飾的_堿基(B)位置15(C)其他信息/mod_base=i(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵字修飾的_堿基(B)位置17(C)其他信息/mod_base=i(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵字修飾的_堿基(B)位置19(C)其他信息/mod_base=i(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵字修飾的_堿基(B)位置21(C)其他信息/mod_base=i(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TTTTTTTTTT NSNSNSNSNS NS 22(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:CGACAGCCGG AAGGAAGAGG GAGC 24(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:GAGAAGGAAA GGGAAAGG 18
權利要求
1．一種擴增至少一種核酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟(1)形成至少一種含待擴增核酸的核酸模板，其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外在5′端該核酸帶有將其附著于固相支持物的裝置；(2)在存在固相支持物時，將所述的核酸模板與一種或多種集落引物X混合，集落引物X可與寡核苷酸序列Z雜交，且在其5′端還攜帶了將集落引物附著于固相支持物的裝置，從而使核酸模板和集落引物的5′端結合于固相支持物；(3)在結合模板上進行一種或多種核酸的擴增反應，從而產生核酸集落。
2．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的寡核苷酸序列Z互補于寡核苷酸序列Y，且集落引物X與寡核苷酸序列Y的序列相同。
3．如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中兩種不同的集落引物X與所述的模板混合，且集落引物X的序列是使寡核苷酸序列Z能與集落引物X中的一種雜交，寡核苷酸序列Y與一種集落引物X的序列相同。
4．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的集落引物X包含簡并引物序列，所述的核酸模板不含有寡核苷酸序列Y或Z。
5．如權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括其他步驟，即對產生的一個或多個核酸集落進行至少一個測序步驟。
6．如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的測序步驟(5)包括摻入和測定標記的寡核苷酸。
7．如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，同時測定一種以上核酸集落中存在的擴增核酸模板的全部序列或部分序列。
8．如權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括觀察產生的集落步驟。
9．如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的觀察步驟包括使用標記的或未標記的核酸探針。
10．如權利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述的將核酸模板和集落引物附著于固相支持物的裝置包括將這些核酸序列共價附著于所述的支持物的裝置。
11．如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的將核酸序列共價附著于固相支持物的裝置是化學修飾的功能基團。
12．如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的化學修飾的功能基團是磷酸基團、羧酸或醛基、硫醇、羥基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、或氨基。
13．如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的化學修飾的功能基團是氨基。
14．如權利要求1-13任一所述的方法，其特征在于，所述的固相支持物選自乳膠珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝膠、金表面、玻璃表面和硅片。
15．如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述的固相支持物是玻璃。
16．如權利要求1-15任一所述的方法，其特征在于，產生的核酸集落的密度是10,000/mm2到100,000/mm2。
17．如權利要求1-16任一所述的方法，其特征在于，所述的集落引物X附著于所述的固相支持物的密度至少是1fmol/mm2。
18．如權利要求1-17任一所述的方法，其特征在于，所述的核酸模板的密度是10,000/mm2到100,000/mm2。
19．一種含待擴增核酸的多重核酸模板，其特征在于，所述的核酸在它們的5’端含有寡核苷酸序列Y，在3′端含有寡核苷酸序列Z，另外在5’端還攜帶將該核酸附著于固相支持物的裝置。
20．如權利要求19所述的多重核酸模板，其特征在于，所述的模板與多重集落引物X混合。
21．如權利要求19或20所述的多重核酸模板，其特征在于，所述的寡核苷酸序列Z互補于寡核苷酸序列Y，集落引物X與寡核苷酸序列Y的序列相同。
22．如權利要求19或20所述的多重核酸模板，其特征在于，其中將兩種不同的集落引物X與所述的模板混合，集落引物X的序列使寡核苷酸序列Z能與一種集落引物X雜交，寡核苷酸序列Y與一種集落引物X的序列相同。
23．如權利要求19或20所述的多重核酸模板，其特征在于，所述的集落引物X包含簡并引物序列，而核酸模板不含有寡核苷酸序列Y或Z。
24．一種固相支持物，其上附著多重集落引物X和至少一種核酸模板，其特征在于，所述的核酸模板和集落引物的定義如上述任一權利要求所述。
25．如權利要求24所述的固相支持物，其特征在于，所述的多重核酸模板附著于所述的固相支持物。
26．如權利要求24或25所述的固相支持物，其特征在于，所述的固相支持物的定義如權利要求14和15所述。
27．如權利要求24-26任一所述的固相支持物，其特征在于，所述的核酸模板和集落引物與固相支持物的附著是共價的。
28．一種固相支持物，其特征在于，它含有由權利要求1-18任一所述的方法產生的一種或多種核酸集落。
29．如權利要求24-28任一所述的固相支持物的用途，其特征在于，可用于核酸擴增或測序的方法中。
30．如權利要求29所述的用途，其特征在于，所述的方法是權利要求1-18任一所述的方法。
31．如權利要求1-18所述的方法的用途，其特征在于，可用于核酸擴增或測序。
32．如權利要求1-18任一所述的方法，或由所述的方法產生的核酸集落，或如權利要求19-23任一所述的多重核酸模板，或權利要求24-28任一所述的固相支持物的用途，其特征在于，用于提供以下所需的核酸分子測序和重測序、基因表達監控、遺傳多樣性分布圖、診斷、篩選、全基因組測序、全基因組多態性的發現和評分、和制備全基因組玻片、或包括核酸擴增或測序的其他運用。
33．一種用于核酸擴增或測序的試劑盒，其特征在于，它包括如上述任一權利要求所定義的結合于固相支持物的多重核酸模板和集落引物。
34．如權利要求33所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒可用于測序和重測序、基因表達監控、遺傳多樣性分布圖、診斷、篩選、全基因組測序、全基因組多態性的發現和評分、或包括核酸擴增或測序的其他運用。
全文摘要
本發明提供擴增和測序至少一種核酸的方法,包括以下步驟:(1)形成至少一種含待擴增或待測序的核酸的核酸模板,其中所述的核酸在5′端含有寡核苷酸序列Y,在3′端含有寡核苷酸序列Z,另外在5′端核酸帶有將該核酸附著于固相支持物的裝置;(2)將所述的核酸模板與一種或多種集落引物X混合,集落引物X可與寡核苷酸序列Z雜交,且在其5′端還攜帶了將該集落引物附著于固相支持物的裝置,在存在固相支持物時,可使核酸模板和集落引物二者的5′端結合于固相支持物;(3)在結合的模板上進行一種或多種核酸的擴增反應,從而產生核酸集落,且任選地對產生的一個或多個核酸集落進行一測序步驟。本發明還提供用于這些方法的固相支持物、試劑盒和裝置。
文檔編號G01N37/00GK1325458SQ99813058
公開日2001年12月5日 申請日期1999年9月30日 優先權日1998年9月30日
發明者C·埃茲, E·卡瓦什瑪, P·邁耶, J·－J·梅爾莫德, G·蒂爾卡蒂 申請人:應用研究系統Ars股份公司