專利名稱：借助于x－射線晶體學方法篩選和設計配體的制作方法
技術領域：
X-射線晶體學方法可用于鑒別結合靶受體分子的配體，并可用于設計對靶受體具有改進生物活性的配體。
發明的背景X-射線晶體學方法(晶體學)是一門成熟的技術，它可對晶體中分子顯示的圖形以三維圖象的形式提供最好的描述。科學家已經應用晶體學方法對許多重要的生物學分子分辨了其晶體結構。借助于晶體學方法，可對多種生物分子進行研究，包括但不局限于蛋白質，DNA,RNA和病毒。科學家甚至還報導了在其受體內攜帶配體的生物分子的晶體結構(一種“配體-受體復合物”)。
給定一種靶標生物分子或配體-受體復合物的“圖象”，科學家可以找到在此可行使生物活性的空穴或受體。然后科學家可以通過實驗或計算對此受體設計出高親和性的配體(或藥物)。計算方法已經被選擇地用于篩選對小分子的結合。但是，以前這些設想僅獲得了有限的成功。幾個問題困擾著通過計算方法對配體的設計。計算方法與其說是基于對結合能量的精確測算，倒不如說是基于估算，并且，在與存在于生物分子內部復雜的相互作用相比較時，是依賴于簡單的計算。而且，計算方法還需要實驗證實，這種實驗常常會暴露出一些對真實靶標不起作用的假陽性模式。
此外，基于配體-受體復合物圖象的實驗性高親和性配體設計，僅局限于已經具有已知配體的生物分子。最后，科學家僅在最近才報導了有機溶劑和靶生物分子之間相互作用的晶體學研究。Allen等，物理，化學雜志V 100.pp2605-11(1996)。但是，這些研究僅局限于測定繪制溶劑的位點，而不是配體的位點。所需要的是，直接鑒別潛在的配體，并獲得有關在靶生物分子內配體是如何結合和改變的詳細信息。此外，還需要有可用于鑒別和/或設計某些配體的方法，這些配體對于給定的靶分子具有生物活性和/或藥物活性。
發明概述對于未知是靶生物分子配體的化合物，可以用晶體學方法篩選和鑒別它們結合此靶標的能力。該方法(此后寫作“CrysteLEADTM”)包括，獲得靶生物分子的晶體；將此靶標暴露于可能是此靶標潛在性配體的一個或多個待測樣品；以及測定是否形成了配體/生物分子復合物，可通過不同的方法使此靶標暴露于潛在性配體，包括但不局限于在一個或多個潛在性配體的溶液中浸泡結晶體，或者在有一個或多個潛在性配體存在時共結晶生物分子。
在另一實施方案中，是將所發現的來自配體/受體復合物的結構信息用于設計新配體，同已知的配體相比較，這種新配體結合更緊密，結合的特異性更強，具有更強的生物活性，或者具有更安全的分布。
在一個優選的實施方案中，應用“不同形狀”化合物的文庫；使之在此配體即使作為混合物的一部分被暴露時，也能直接鑒別其配體-受體復合物。這就避免了對來自此混合物的命中復合物(hit)進行費時間的解盤繞(deconvolution)過程。在此，可同時實現三個重要步驟。計算出電子密度函數可直接揭示結合過程，鑒別所結合的化合物，并且提供配體-受體復合物的詳細3-維結構。在一個實施方案中，一旦找到了一個命中復合物，就可能借助于常規的篩選方法篩選此命中復合物的許多類似物或衍生物，找出且有更緊密結合或更強生物活性的。另一個實施方案是利用此命中復合物和關于靶分子結構的信息，構建具有更緊密結合或更強生物活性的類似物或衍生物。在還有一個實施方案中，是將此配體-受體復合物暴露于潛在配體的補充迭代物，這樣使二個或多個命中復合物可被連接在一起，構成一個更有效的配體。
附圖簡述
圖1顯示基于結構的藥物設計，在此應先找到起始前導化合物，然后被用作攜帶附加部分的支架，裝配環繞主要位點的次級位點。
圖2顯示對于具有二個或更多相鄰主空穴的生物分子片段連接的方法。
圖3是CrysteLEADTM法的示意圖，其中晶體被浸泡于多種潛在性配體(I1-I10)的溶液中，收集X-射線衍射數據組，并轉化成電子密度圖形，用于檢查化合物的結合。
圖4顯示2-維和3-維的典型化合物的混合物。3-維圖形是代表分子“形狀”的理論2Fo-Fc電子密度圖形。
圖5是人尿激酶的一級序列。
圖6顯示在將尿激酶浸泡于含有潛在配體混合物的溶液之后，如何通過形態檢測和鑒別命中復合物。圖6A是起始Fo-Fc圖形。圖6B顯示在尿激酶的活性位點化合物如何結合。圖6C顯示沒有結合混合物的化合物時，未結合配體的活性位點。
圖7顯示對于被浸泡在含有潛在性配體混合物溶液中的尿激酶的一個命中復合物。圖7A是起始Fo-Fc圖形。圖7B顯示在尿激酶的活性位點化合物如何結合。
圖8顯示對于被浸泡在含有潛在性配體混合物溶液中的尿激酶的一個命中復合物。圖8A是起始Fo-Fc圖形。圖8B顯示在尿激酶的活性位點化合物如何結合。
圖9顯示對于被浸泡可含有潛在性配體混合物溶液中的尿激酶的另外二個命中復合物。圖9A是對于混合物中強配體的Fo-Fc圖形。圖9B是對于混合物中較弱配體的Fo-Fc圖形。只有當將強配體從混合物中除去之后才能檢測較弱的配體。
圖10顯示在通過CrysteLEADTM發現的前導化合物和最佳后隨化合物之間的比較性晶體結構。
圖11顯示被鑒別的VanX命中復合物。
圖12顯示尿激酶的一個命中復合物。
圖13顯示化合物44與ErmC’的晶體結構。
圖14顯示化合物45與ErmC’的晶體結構。
發明詳述CrysteLEADTM(晶體引導法TM)提供了一種有效的篩選方法，用于鑒別將結合于靶生物分子的化合物。這樣一些化合物可以作為設計對靶標具有改進生物學活性的配體和/或藥物的前導或支架。必須注意到，較緊密結合的配體不一定就提供更強的生物活性或者構成更好的藥物，雖然這是一般的規律。有可能結合較弱的配體由于除了緊密結合以外的同素(例如選擇性，生物有效度)而提供較強的生物活性。
為了進行基于結構的藥物設計，晶體學方法已廣泛地被用于觀測受體-配體復合物。為了觀測這種復合物，通常將已知的配體浸泡于靶分子晶體中，隨之觀察復合物的晶體學過程。有時必須使配體與靶分子共結晶，以便獲得適合的晶體。
直至現在，晶體學尚未用來篩選潛在的配體，盡管它提供了詳細的結構信息。對于通過晶體學方法篩選化合物可能存在如下多種偏見此方法太復雜或太費時間，很難獲得適合的晶體，現有的晶體尚不允許摻入一個以上化合物(更不用說是十個或更多化合物的混合物)，可能需要太多的生物分子，按常規的方法建立晶體太費時間，以及在X-射線晶體測角計上持續地更換晶體太冗長緩慢。
但是，目前現有的技術已經克服了許多這些方面的障礙。例如，曾經僅能從天然來源獲得靶分子，并且由于天然降解或糖基化有時不適合于結晶。此外，天然濃度常常太低，不能獲得結晶所必需的高度純化蛋白質的量。借助于分子生物學方法，有可能表達和純化大量的蛋白質用于結晶。必要時甚至可以重建此蛋白質，以便提供不同的或更好的晶體形狀。
進而，由于已經有了極亮的光源(同步加速器發射)和更靈敏的檢測器，使收集數據所需的時間從幾天驚人地降低至幾小時或者甚至是幾分鐘。而且，一些在目前尚不是常規的，但可能很快將成為常規的現有技術，使之有可能在大約幾秒鐘或者甚至在幾分之一秒鐘內收集充分的數據組(例如，Laue晶體衍射法)。J.Hajdu等，自然，V 329.pp.178-81(1987)。更快的計算機和更自動化的軟件，已大大減少了收集和分析資料所需要的時間。最后，本發明者已發現，摻入或共結晶化合物的混合物，有可能用于篩選潛在的配體。因此，如下面所述，現在，晶體學方法是一種實用的和可行的篩選方法。
在CrysteLEADTM中，是通過將小分子文庫，單獨地或以混合物狀態暴露于靶分子(例如蛋白質，核酸等)來鑒別具有晶體形態的靶分子配體。因此，可獲得假定靶標-配體復合物的電子密度圖與靶生物分子的電子密度圖相比較的結晶學數據。電子密度圖同時提供了配體結合的直接證據，對結合配體的鑒別，以及配體-靶標復合物的詳細3-維結構。還可以通過結晶衍射圖形中單個反射波的改變來監測配體結合，已知這種結晶衍射圖形對在活性位點配體的結合是敏感的。這可以作為預篩選，但不是選擇的主要方法，因為它不能提供詳細的結構信息。
通過觀測此衍射圖形中配體電子密度水平或某些反射波強度，作為對晶體加入的或共結晶中的配體濃度函數的改變，還可以確定配體對生物分子的結合親和性。還可以通過競爭性實驗獲得結合親和性資料。在此，是用已知結合親和性的一系列不同形狀配體中的一個浸泡或共結晶此新化合物。如果已知配體在電子密度圖形中出現，那么未知的配體是較弱的結合物。但是，如果發現新化合物中的一個化合物競爭此位置，那么它將是最緊密的結合物。通過改變已知配體的濃度或同一性，可估算對CrysteLEADTM命中復合物的結合常數。
所篩選化合物的數目是根據所要求的檢測極限，化合物的溶解度及此晶體所允許的有機共溶劑的量。確切的數目取決于各個晶體。例如，對于一個允許1％有機共溶劑的典型晶體，為了同時篩選10個化合物其靈敏度極限應該是Kd＜1.5mM。對于20個化合物，其靈敏度極限將是Kd＜0.63mM。但是，允許高含量有機共溶劑(例如40％)的晶體，在Kd＜1.5mM的檢測極限內可篩選達到50個化合物。
在CrysteLEADTM法的最一般性的應用中，是將命中復合物或引導化合物用于確定，在基于結構的藥物設計中應該對什么化合物測定其生物活性。然后通過傳統的藥物化學獲得衍生物和類似物，以便找出最好的配體或藥物。
另一方面，在篩選過程中收集的結構信息可被直接用于提示該命中復合物的類似物或衍生物。對這種方法的圖解說明顯示，此時其活性位點是由一個主要的空穴組成，它周圍環繞著多種亞位點和小空穴(圖1)。當檢測命中復合物時，可同時獲得有關受體如何結合化合物的詳細結構信息。這種信息對于普通的技術人員設計更好的配體是有用的。P.Colmen，結構生物學現代觀點V.4.pp 868-74(1994)；J.Crreer等，醫療化學雜志，V.37.pp.1035-54(1994)。特別是，此命中復合物可識別用于類似物合成的位點，這樣使之能夠接近周圍的亞位點和小空穴。這意味著可設計更好地適合活性位點的新化合物。而且，在具有現存的結構-功能關系的情況下，可以在3-維結構水平將增強活性的取代圖形直接轉移至新的前導支架。
另一種圖解(圖2)通常可應用于具有將容納片段的2個或更多單獨空穴的靶標。在此，將為結晶靶標篩選按順序或同時占據全部位點的配體。因為是通過觀察共結晶結構來監測此結合過程，所以可直接鑒別配體結合的位點，并且為了確保此配體確實在蛋白質上占據不同的位點，沒有必要作競爭性實驗。分別篩選可用于對不同空穴結合的配體，這些空穴重疊于它們的結合位置。在存在前者時篩選后者，可檢測在第二位點的協同結合。一旦確立了潛在的前導和結構-活性關系，則可應用此詳細的結構信息和以前描述的片段連接方法設計每個位點間的連接，以便產生新型的，更有效的配體。S.B.Shaker等，科學，V.274.PP 1531-34(1996),C,Verlimde等，結構，V.15,PP.577-87(1994)。
在第三種應用中，即支架融合法(未顯示)，其靶活性位點是由二個或多個亞位點組成。可篩選結晶蛋白借助于這些亞位點與之結合的配體，并且經過多次實驗觀測相對配體的結合取向。這些配體將通過占據一個或幾個亞位點，并且覆蓋多命中復合物的結構而相結合，可設計一個有利于接近多亞位點的核心。然后，此核心將作為一個新穎并更有效的前導化合物，此化合物也可在藥物設計循環中作為前導支架。
CrysteLEADTM連接-片段法為基于結構的連接片段法提供了實驗性方法，后者僅在計算水平被Verlinder等在計算機輔助分子設計雜志V,16.PP.131-47(1992)中報導過。Verlinde等提出了基于數學計算的配體片段。然后測定這些所提議片段的結合活性。如果這些片段確實被結合了，則可借助于X-射線晶體學方法測定它們的三維結構，并設計一個接頭。相比之下，CrysteLEADTM可同時檢測結合過程并提供此配體-蛋白質復合物的實驗性測定的三維結構。本發明還提供了一種方法，用于測定靶分子與其配體之間的結合常數。本發明不需要對靶標作特定的標記。因此，靶分子可以包括蛋白質，多肽，核酸，核蛋白，或者其它任何適合的靶分子，它們可從天然來源中分離出，或者作為普通技術人員的開發實踐，通過重組技術從任何適合的宿主系統得到。
晶體篩選法有幾個優點。一個重要的優點是可直接監測結合過程，這樣可使假陽性的可能性降低至接近于零。晶體學數據可提供配體-受體復合物的三維電子密度快速攝影照片，顯示出結合了哪種化合物，以及它如何被結合。
此方法對靶標和配體的結構改變特別靈敏。在設計前導支架的過程中，觀測結構的改變是關鍵性的，此支架結合了來自不同配體-靶復合物結構的信息。存在這樣一個實例，當為了適應一個配體蛋白質改變了結構，但是，此結構改變同時也阻礙了第二個配體的結合。類似地，測定結構改變也是重要的，因為如果主要支架以不同方式結合，那么它也許不可能使它們組合成較大的支架。
因為可直接監測結合過程，CrysteLEADTM不需要對配體結合間接敏感的特殊標記的樣品、探針或靶分子。只要能夠獲得靶標的晶體結構，就可以應用CrysteLEADTM篩選配體。
如果適當地設計成形狀各異的化合物混合物，本發明則可減少對作為混合物被浸泡的文庫脫盤繞的需要，因為可通過測定在結合位點的電子密度形狀直接檢測此結合過程。因此，電子密度的形狀可直接地鑒別結合過程和化合物的同一性。按另一種方法，還可以設計此混合物使之包含帶有不規則散射原子(例如Br,S)的化合物，這可以借助于不規則散射技術來鑒別。另外，因為CrysteLEADTM可直接監測結合過程，所以它特別適合用于研究尚未知存在配體的靶標。
因為在CrysteLEADTM中計算的電子密度函數顯示出晶體的“真實空間”，所以可直接聚焦于感興趣的區域。因此，可專門在感興趣的位點檢測結合，雖然此方法并不局限于活性位點。從整體考慮可以將在其它位點的結合刪除，在大多數結合測定中這種結合會使分析復雜化。
CrysteLEADTM還提供了一種在不同位置同時監測結合的方法。這就是，對于具有一個以上空穴的靶標，對第二位點的篩選不需要在有第一配體存在時篩選。但是，為了發現協同配體，可在有第一配體存在時完成對第二位點的篩選。
CrysteLEADTM適用于任何一種可獲得晶體結構的靶分子。根據目前的文獻這包括任何一種具有分子量大約5000-200000的可溶性大分子。但是，隨著技術的進步，此范圍幾乎在日益擴展。此方法還對很寬的結合離解常數范圍(＜毫纖克分子至克分子)敏感。應用較靈敏的CCD攝像檢測器，以一個旋轉的陰極源，可以在大約＜4小時-4小時之內收集數據。這使每個檢測器，每天有可能篩選上千個化合物。應用同步加速器源，每個檢測器篩選的化合物數目可增加至數千個，并且，以Lane數據收集法和檢測混合物，可在一秒或更短的時間內收集CrysteLEADTM數據，這樣，每天每束射線可檢測上千個化合物。因此，多檢測器或單個同步加速器射線有助于實現真正高產率的篩選。
圖3是本發明的概要。在有一個或幾個化合物存在時通過浸泡其結晶或者通過通過共結晶此靶分子，使靶分子的結晶暴露于一個或幾個化合物。然后收集處理晶體學數據，并將它轉變成作為配體結合證據被檢測的電子密度圖。檢測配體結合的一種方法是將初始晶體的結構與所暴露晶體的結構相比較。
可借助于所公布的條件或者通過在本領域已成熟的其它方法將新靶標結晶。類似地，靶標的結構可從數據庫如蛋白質數據庫獲得，或者可通過已成熟的方法測定獲得。分子生物學和蛋白質工程的進展促進了靶標的結晶過程，同時，數據收集的進展有助于對以前未知結構的靶標快速地測定其結構。
通過浸泡暴露于潛在配體的晶體需要一個未占用并易接近的活性位點。可以通過多種方法獲得具有未占用活性位點的晶體，包括但不局限于在沒有配體的情況下結晶；在存在結合于遠端位點的配體時結晶；或者在存在非共價配體的情況下結晶，一旦此生物分子形成結晶，此配體易被稀釋或者從靶分子中被交換。借助于一種新穎的方法，本發明者通過在活性位點存在可降解的配體時結晶一個生物分子，然后在晶體形成時使此配體降解，獲得了此生物分子的結晶。按另一種方法，有可能在有將被篩選的化合物存在的情況下生長出晶體。使晶體在存在此混合物的情況下達到平衡，在此平衡點，配體作為它們的濃度和結合親和性的函數而結合。
對于浸泡法，此方法的靈敏度可能接近于簡單的平衡關系，因為在晶體中蛋白質的濃度可以計算，配體的濃度是已知量。例如，晶體中25000MW的蛋白質(尿激酶)的濃度可按如下計算在具有55×53×823體積的正交晶單位細胞(全角90°)中有4個分子；應用阿伏伽德羅數，此濃度是28mM。因此，對于每個配體具有6mM濃度的混合化合物將導致Kd＜1.5mM的計算靈敏度極限(假定晶體中有大約80％占有率的檢測極限)。
浸泡混合化合物還會產生多占有率的問題(一個以上配體結合于所需位點)。對于配體被結合在不同空穴的多占有率的情況(見圖2)，通過CrysteLEADTM法分辨是容易的，因為，借助于電子密度圖，可逐個地區分在不同位點的結合。對于不同配體競爭占據相同位點的情況，為了計算對這種結合的需要量，可應用一個簡單的競爭性抑制模型。根據實驗觀測人們相信，晶體學方法可以分辨一個抑制劑的占有率是80％，另一個是20％的情況。因此，大于4的結合親和性比率將導致僅由較高親和性配體的明顯占有率。在混合物中二個化合物的結合常數之比小于4的不大可能的情況下，所形成的電子密度可能將是二個分隔密度的重量平均數而難以鑒別。從而，只有當結合親和性的比率小于4的情況下，為了使混合物脫盤繞，有必要進行進一步的浸泡實驗(例如逐個檢查各個晶體中的每個化合物)。這仍然是值得和有效的，因為它已經確定在此混合物中至少存在二個命中復合物。
使被篩的化合物組成文庫。為了對此進行論述，文庫是化合物的大混合物(100-10000+)，并且可能是一般性的或結構定向的。一般性的文庫是隨機的，也就是說其大小，形狀和官能度完全不同。結構定向性文庫被指向特定的功能混合物或靶分子活性位點中的亞位點(例如，其所有的化合物都含有羧化官能度的文庫將定向于靶活性位點中的正電荷)。
在優選的實施方案中，兩種類型的文庫都被分成較小的形態不同的混合物組。因此，可將混合物定義為可能被浸漬或生長成晶體的文庫子系統。通過對二維化學結構的目測或者通過計算程序，可確定此混合物是形態不同的。此混合物的形態差異使有可能根據形成的電子密度圖直接鑒別結合的配體(見圖4)。這就避免為了確定混合物中什么化合物是命中復合物(結合于靶標的)而需要持續地實驗。
如果待測化合物是水溶性的，可將應用于結晶的特定緩沖液和沉淀劑溶液用來溶解此混合物，并將它們浸漬成為晶體。對于較低水溶性的化合物，可單個地在適當的有機溶劑中溶解，成為最終濃度2M。在一個實施方案中，是將它們溶解于100％DMSO，并存放于4℃，在暴露于晶體之前，通過混合這些DMSO貯備液面使化合物混合。這些混合物可用于共結晶生長條件不包含有機試劑的大多數晶體系統。一般是將這些化合物浸泡達到1-10％的最終DMSO濃度，并使其與結晶蛋白平衡一段預先確定的時間(4-24小時)。在此情況下，每次浸漬混合物都將每個晶體暴露于多個化合物。某些晶體生長條件可包括高濃度的有機溶劑(40-50％)，一般是醇衍生物。在此情況下，可將此化合物文庫溶解于結晶有機溶劑中，對于浸漬實驗，此有機溶劑允許達到最終共溶劑濃度40-50％。在此，每次浸漬混合物時化合物的數目可能增加。
浸泡之后，在浸漬混合物中將每種晶體暴露于晶體保護劑如5-20％甘油，并安裝在尼龍環中，置于在氮冷卻氣流(160K)下的X-射線裝置上。還可以在室溫或其它為晶體穩定所必要的適當條件下對晶體進行研究。可使用自動化晶體安裝和更換裝置，以便加速此操作過程。
收集和處理晶體學數據，其中對衍射圖形上的每個反射(點)賦予一個指數值(h,k,l)，并測定其強度作為此范圍的標準。X-射線源可以是實驗室X-射線發生器，或者是高亮度的同步加速器源，后者可非常快速地收集衍射數據。具體地說，實驗室數據收集對每種晶體可能花費30分鐘-幾小時，而使用同步加速器源可以減少時間。應用Lane數據收集方案可使每種晶體數據收集的時間縮短至幾分之一秒。
然后借助于普通技術人員熟悉的方法將此衍射數據轉變成電子密度圖。此電子密度圖是配體和/或靶生物分子的三維圖象。
對于Fo-Fc圖形，是從觀測的結構因子幅度(｜Fo｜)減去計算的結構因子幅度(｜Fc｜)，后者是從不具有所結合配體的已知晶體結構獲得的。因此，這圖形表示從由存在文庫混合物時浸泡的晶體所得到的數據，直接減除由天然蛋白質結構所得到的數據。此結果是具有正向和負向峰值的電子密度圖形。與CrysteLEADTM有關的峰是正向峰，它是配體在靶標上所需位點結合的直接結果，也就是將配體加入靶分子中。在圖3，其Fo-Fc圖形在尿激酶的活性位點清晰地顯示了一個大的正向峰。此峰的形狀相當于配體2-氨基-8-羥基喹啉。顯示出此配體擁有正向差異密度。其它的正向峰相當于結合的硫酸鹽部分(以SO42-指示)和結合的水分子(以H2O指示)。這種類型的圖形對小的結構改變(以Δ指示)也非常靈敏，當和2Fo-Fc圖形一起應用時，使之可能確定整個配體-蛋白質復合物的詳細結構。為了計算2Fo-Fc圖形，可從2(｜Fo｜)減去(｜Fc｜)。在此，此圖形是正向的，并且有此分子的所有原子的密度。
在圖3，對圖形的觀測可指示出所結合化合物的同一性和結構。優選地，可將暴露晶體的圖形與未暴露靶分子的圖形相比較，以便區別可能在Fo-Fc圖形中所發現的正向密度。在不存在結合配體的情況下，有時水分子占據晶體中的活性位點。這易于被區分，因為所結合水分子常常以和結合的氫一致的幾何形狀定向，并且因為它們不被共價鍵的網絡連接。因此，所產生的圖形傾向于被斷開，指示結合的溶劑而不是有機化合物。如果確定Fo-Fc或2Fo-Fc圖形中的密度代表有機化合物，那么可將此三維圖形與存在于文庫中的化合物的三維圖形相比較，并可形成最適合的匹配。按另一種方法，應用程序如QUANTA的XFIT模型(分子模擬公司，產生和展示量子的分子，San Diego分子模擬公司，1997)可使此方法自動化。
由于測定或處理衍射強度的能力改進了，可以不需要對電子密度圖進行比較。可以通過將暴露晶體的衍射圖形與未暴露晶體的進行簡單的比較來檢測結合。因此，如果在此預篩選過程檢測結合情況，只需要產生電子密度圖形。
如上面所示，可以將CrysteLEADTM應用于能獲得晶體結構的任何靶生物分子。因為它的廣泛適用性，下面將通過實施例對它作最好的說明。
尿激酶和VanX實施例代表CrysteLEADTM應用的二種情況。對于尿激酶，重建的微UK(μUK)晶體衍射性能非常好，并且是高度對稱性空間晶群。與之相反，VanX晶體衍射性能較弱并具有較低的對稱性。因此，VanX需要較多的數據收集時間。此外，尿激酶晶體在其不對稱單元中有一個分子，而VanX具有6個。較大的不對稱單元需要收集較高分辨率的數據，并且使對圖形的觀測更加緩慢。但是，在VanX的情況下，在借助于CrysteLEADTM發現它們之前，尚不知有任何非真晶格(non-Substrate)擬態結合物。因此，CrysteLEADTM提供了一種新穎的非肽前導化合物，將被注入藥物發現的周期中。對于尿激酶，CrysteLEADTM提供了一種新穎的初始支架。通過應用現存的SAR和晶體結構，本申請者能夠迅速地增加此初始支架的效力，以便設計優于已知尿激酶配體，具有改進生物有效度的較高親和性的衍生物。
但是，這些實施例僅說明本發明的優選實施例，并不對權利要求或詳細說明構成限制。普通的技術人員很快將體會到，只有按照本發明的范圍和精髓，才能對特定的實施方案進行改變和修飾。最后在此將所有引證的文獻引入作為參考。
實施例實施例1尿激酶尿激酶是一種絲氨酸蛋白酶，與腫瘤細胞密切相關聯。尿激酶激活血纖維蛋白溶酶原變成血纖維蛋白溶酶，后者又激活基質金屬蛋白酶。血纖維蛋白溶酶和金屬蛋白酶使細胞內基質降解，并促進腫瘤生長和轉移。因此，特異性對準尿激酶的抑制劑可能用作有效的抗癌藥劑。
人的前一尿激酶由411個氨基酸組成(圖5)。Verde等，國家科學院學報.V.81(5),pp 4727-31(1984)；Nagai等，基因V.36(1-2).pp.183-8(1985)。當通過蛋白水解在Lys158-Ile159斷開肽鍵而被激活，此酶成為由單一二硫橋(Cys148-Cys279)連接的二條鏈。A-鏈(殘基1-158)包含EGF樣功能區和kringle功能區。B鏈(殘基159-411)包含絲氨酸蛋白酶催化功能區。對尿激酶的進一步溫育將導致在Lys135-Lys136進一步蛋白水解斷開肽鍵，形成低分子量的尿激酶。Spraggon等，在結構，V.3.pp.681-91(1995)中報道，他們獲得了在與共價抑制劑Glu-Gly-Arg氯甲基酮的復合物中存在的此酶的結晶形式，并且在高能同步加速器源下顯示出達到2.5分辨率的衍射。但是，這些晶體連同存在的共價結合抑制劑的衍射質量差，使之難以應用CrysteLEADTM法。
μUK晶體的制備及其結構為了實施CrysteLEADTM法，重新構建了人的尿激酶，使之僅由B-鏈的殘基159-404組成，其中以谷氨酸取代天冬酰胺302，以便除去糖基化位點，并以丙氨酸取代半胱氨酸，以便除去自由巰基部分。這種形式的尿激酶(μUK)顯示出完全的活性，并發現能以同CrysteLEADTM法相容的晶體形式形成結晶。(也可參見Heyneker等的美國專利No.5112,755,1992年5月12日發表。)制備載體構建體pBC-LMW-UK-Ala279將人UK的突變體克隆進入雙順反子細菌表達載體pBCFK 12。Pilot-Matias等，基因，V.128.pp 219-25(1993)。借助于PCR，用下列寡核苷酸產生多種UK突變體SEQ ID #PCR引物序列15′-ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTTCAGTGTGGCCAA-3′25′-ATTAATAAGCTTTCAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTCCTTGGTGTGACTCCTGATCCA-3′35′-ATTAATTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCT-3′
按照標準的PCR反應，應用人UK cDNA作模板，用SEQ ID No 1和2作引物，對低分子量UK(此后被稱為LMW-UK(L144-L411))進行起始克隆。將PCR擴增的DNA作凝膠純化，并用限制性酶SalⅠ和HindⅢ消化。然后使此消化產物連接進入預先用相同的這二種酶酶切的pBCFK12載體中，產生表達載體pBC-LMW-UK。將此載體轉化進入DH5α細胞(LifeTechnologise,Gaithersburg.MD)，然后分離，并通過DNA測序證實其序列。借助于SDS-PAGE和酶譜學方法分析細菌中產生的LMW-UK,Granelli-Piperno等，實驗醫學雜志，V.148.pp.223-34(1978)，此方法測定UK對血纖維蛋白溶酶原的激活作用。通過Commassie蘭染色凝膠已證明，在大腸桿菌中表達了LMW-UK，在酶譜學檢測法中它是有活性的。
對大腸桿菌中LMW-UK快速表達和檢測的成功，使之有可能對UK進行誘變分析，以便確定它的最小功能結構。借助于PCR，用SEQ ID NO2和3構成了一個具有Cys279變成Ala279置換的突變體，以AviⅡ和HindⅢ酶切此PCR產物，并用于置換PBC-LMW-UK構建體中的AviⅡ和HindⅢ片段。在大腸桿菌中表達了所形成的PBC-LMW-UK-Ala279構建體，并在酶譜學方法中顯示其產物是有活性的。
在桿狀病毒中克隆和表達μUK(UK(I159-K404)A279Q302)應用如下的寡核苷酸引物，通過PCR產生了μUK(包含Ala279Gln302的UK氨基酸Ile159-Lys404)SEQ ID # PCR引物序列45′-ATTAATCAGCTGCTCCGGATAGAGATAGTCGGTAGACTGCTCTTTT-3′55′-ATTAATCAGCTGAAAATGACTGTTGTGA-3′65′-ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTTCAGTGTGGCCAA-3′75′-ATTAATGCTAGCCTCGAGCCACCATGAGAGCCCTGCT-3′85′-ATTAATGCTAGCCTCGAGTCACTTGTTGTGACTGCGGATCCA-3′95′-GGTGGTGAATTCTCCCCCAATAATGCCTTTGGAGTCGCTCACGA-3′為了使UK中的唯一糖基化位點(Asn302)突變，將寡核苷酸引物SEQID NO:4和6，以及SEQ ID NO:5和8用于以pBCLMW-UK-Ala279作模板的二個PCR反應。用限制性酶PVUⅡ酶切此二個PCR反應的產物，以T4 DNA連接酶連接，然后用作模板產生LMW-UK-A279-Q302。與此同時，應用天然UK cDNA作模板，以SEQ ID NO:7和9通過PCR將天然UK前導序列直接融合于Ile159。
用此PCR產物和SEQ ID NO.8作引物，在以LMW-UK-A279-Q302DNA作模板的另一PCR反應中產生μUK cDNA。以NheⅠ酶切μUK，并連接于用相同酶酶切的桿狀病毒轉移載體pJVP10z。Vialard等，病毒學雜志，V.64(1),pp.37-50(1990)。通過標準的DNA測序技術證實了所形成的構建體pJVP10z-μUK。
應用來自PharMingen(San Diego.CA)的BaculoGold試劑盒，通過磷酸鈣沉淀法將構建體pJVP10z-μUＫ轉染至Sf9細胞。在此培養基中檢測了μUK的活性。通過標準的方法將表達μUK的單重組病毒作噬斑純化，并制備了大量貯備病毒。
在另一個昆蟲細胞系，High-Five細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中進行了大批量μUK表達，此細胞在2種搖瓶中，懸浮培養于無血清的Excel 405培養基(SRH Biosciences,LeneXa,Ks)中，28℃，以80rpm的速度振蕩。使High-Five細胞生長達到2×106個細胞/ml后，以0.1感染復數加入重組μUK病毒，并繼續培養3天。收獲培養上清液用作純化的起始材料。通過UK生色底物S2444的酰胺分解測定此培養上清液中μUK的活性，底物S2444的濃度為6-10mg/升。Claeson等，止血法.V.7.p.76(1978)。
在巴斯德畢赤酵母中表達μUK為了在畢赤酵母中表達μUK，使用了帶有合成前導序列的表達載體。通過修飾載體pHil-D2(Invitrogen)構建了畢赤酵母表達載體pHil-D8，使其含有分泌重組蛋白的合成前導序列。此前導序列5’-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3’(SEQ ID NO:10)編碼為KEX2斷裂而有效連接于前-肽序列(黑體字母指示的)的PH01分泌信號(下面加單線指示的)。為了構建pHil-D8，用pHil-S1(Invitrogen)作模板進行PCR，因為此載體含有編碼pH01的序列，這是相當于pHil-S1的核苷酸509-530的正向引物(SEQ ID NO:11)和具有一種核苷酸序列的反向引物(SEQ ID NO:12)，這種核苷酸序列編碼PH01分泌信號的后部分(SEQ ID NO:10的核苷酸45-66)以及前肽序列(SEQ ID NO:10的核苷酸67-108)。此引物序列(從Alamed.CA Operon技術公司獲得)如下SEQ ID # PCR引物序列115′-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3′125′-ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGGAACCAACGGTAGTGCAGATAACTGGCTGAGCGAAGACAGATTGCAAAGTA-3′在標準的PCR條件下進行擴增。對此PCR產物(大約500個bp)作凝膠純化，用BlpⅠ和EcoRⅠ切割，并連接于用相同酶切割的pHil-D2。將此DNA轉化進入大腸桿菌HB101細胞，并通過限制性酶切消化和序列分析對陽性克隆進行鑒定。一個具有合適序列的克隆被稱為pHil-D8。
然后使用下面二個寡核苷酸引物擴增用于克隆進入pHil-D8中的μUK。
SEQ ID # PCR引物序列135′-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGATTATTGGGGGAGAATTCACCA-3′145′-ATTAATCTCGAGCGGTCCGTCACTTGGTGTGACTGCGAATCCAGGGT-3′用pJVP10z-μUK作模板，以SEQ ID NO:13和14獲得了PCR產物。用BamHⅠ和XhoⅠ酶切此擴增產物，并連接于用相同的這二個酶酶切的pHil-D8。通過DNA測序證實所形成的質粒是pHil D8-μUK，并按照供應商的說明將它用于轉化畢赤酵母GS115株(Invitrogen)。根據供應商(Inivitrogen)詳述的方法，通過在BMGY培養基中培養，在BMMY培養基中表達，篩選轉化的畢赤酵母菌落對μUＫ的表達。用生色底物S2444測定了μUK的活性。與在桿狀病毒-High-Five細胞中觀察到的相比較，在畢赤酵母中μUK的表達水平較高，達到30-60mg/L。
純化μUK.
將High Five細胞或畢赤酵母的培養上清液合并于20升的容器內。加入蛋白酶抑制劑碘乙酰胺，苯甲脒和EDTA，使之分別達到最后濃度為約10mM,5mM和1mM。然后通過加入5mM,pH7.5的Hepes緩沖液將此上清液稀釋5倍，并使之通過1.2μ和0.2μ的濾膜。在以50-100ml/min的流速通過膜時，μUK被捕獲在Sartorius膜吸附劑S100(SartorinsEdgewood,NY)上。用10mM pH7.5的Hepes緩沖液，10mM碘乙酰胺，5mM苯甲脒，1mM EDTA徹底漂洗之后，用在10mM pH7.5 Hepes緩沖液配制的NaCl梯度液(20mM-500mM,200ml)，10mM碘乙酰胺，5mM苯甲脒，1mM EDTA從S100膜上洗脫μUK。在含有抑制劑的10mM Hepes緩沖液中將此洗出液(～100ml)稀釋10倍，然后對S20柱(BioRad,Hercules.CA)加樣。用20倍柱體積的NaCl梯度液(20mM-500mM)洗脫μUK。在此洗脫緩沖液中不使用抑制劑。然后用10mM，pH7.5 Hepes緩沖液將此洗出液稀釋5倍，并對肝素-瓊脂糖(Sigma)柱加樣。用10mM-250mM的NaCl梯度液洗脫μUK。將此肝素柱μUK洗出液(～50ml)施加于用10mMpH7.5 Hepes緩沖液，200mM NaCl平衡的苯甲脒-瓊脂糖(Sigma.St.Louis.MO)柱(40ml)。然后用平衡緩沖液洗柱，并用50mM,pH4.5的NaOAc,500mM NaCl洗脫。通過超濾將此μUK洗出液(～30ml)濃縮至4ml，并施加于用20mM pH4.5 NaoAc,100mM NaCl平衡的Sephadex G-75柱(2.5×48cm；PharmaciaBiotech,Uppsala，瑞典)。收集含有μUK的單一主峰，冷凍干燥成最終產物。此純化的材料在SDS-PAGE上呈現單一主電泳帶。
高質量的μUK結晶有助于通過達到1.0分辨率的X-射線晶體學方法確定它的遠-三維結構。借助于懸滴氣霧擴散法得到了晶體。典型的孔池液由0.15M Li2SO4,20％聚乙二醇，MW 4000和琥珀酸緩沖液，pH4.8-6.0組成。在蓋玻片上，將2μl孔池液與2μl蛋白質溶液混合，并將此蓋玻片封蓋在孔池上。在約18-24℃下，24小時內可出現結晶，此蛋白質溶液含有6mg/ml(0.214mM)μUK，配制在10mM,pH4.0的檸檬酸，3mMε-氨基己酸對-乙酯基苯基酯氯化物(抑制劑)與1％DMSO的共-溶劑中。據信用于共結晶中的此抑制劑可酰化活性位點絲氨酸195，隨之通過酶促脫酰化，因為，在有這化合物存在時生長的晶體3維X-射線結構顯示出沒有在此酶的活性位點的遺留抑制劑。Menegatei等，酶抑制作用雜志V.2.PP 249-59(1989)。出現的唯一密度是由于結合的溶劑分子密度。因為不存在此抑制劑時μUK將不結晶，認為此結晶體是亞穩態抑制劑UK復合物據信是結晶實體。重要的是，所形成的μUK晶體是由酶和空活性位點組成，這對于實現CrysteLEADTM法是理想的情況。
在這些條件下獲得的晶體屬于空間晶群P212121，具有單元室尺寸a=55.16,b=53.00,c=82.30,和α=β=γ=90°。在旋轉的陽極源上它們的衍射超過1.5。更進一步地，在紐約Ithaca的Cornell高能同步加速器源下，已收集到1.0分辨率的自然數據組。應用AMORE程序(Navaja，結晶學報，A50:157-163(1994))，以低分辨率尿激酶結構作檢查探針(Spraggon等,結構V,S.pp.681-691(1995)；PDB eneryILMW)，通過分子置換法確定了此晶體的結構。應用XPLOR程序包(A.Brunger,X-PLOR(2.1版本)手冊，耶魯大學，New Haven CT(1990))對此結構進行了精選加工。
篩選弱堿將此μUK對結構定向性文庫進行了篩選，以便發現可能具有優越藥物動力學特點的新型初始支架。因為尿激酶的活性位點是由一個主空穴組成，此空穴含有以天冬氨酸(Asp189)形成的游離羧化物，所以最被熟知的支架是強堿性的，并含有脒或胍部分。已發現此堿性基團以氫鍵鹽鍵與Asp189連接。這在藥理學可能是一個問題，因為已知強堿降低口服生物有效度。因此，選擇了弱堿性的文庫，它包含以前未知是尿激酶結合劑的化合物。
在可利用的化學制品目錄(ACD)中查到了一個弱堿文庫，它含有61個具有PKa在大約1-9的化合物。通過觀測其二維化學結構確定，將此文庫細分為各有大約6-7個形狀不同化合物的9組混合物。通過上面所述的方法對此化合物混合物進行篩選。準確地說，將每種化合物溶解于100％DMSO中使之達到最終濃度約2M(或者對于小溶解度的成飽和液)。將含有此混合物的6或7種化合物的每種化合物等體積混合，形成單個化合物的最終濃度為0.33M。將單一的μUK晶體置于含有27％PEG4000,15.6mM琥珀酸pH5.4,0.17M Li2SO4和0.5-0.8ml化合物混合物的50ml溶液中，此化合物混合物被加入形成1-1.6％DMSO和3.3-5.2mM單個化合物最終濃度。在這些條件下，預期檢測結合劑的實驗靈敏度為Kd＜1.0mM。使晶體能夠平衡達大約8-24小時。
在配有RAXISII或MAR像平面檢測器的Rigaku RTP 300 RC旋轉陽極源上收集數據。典型的數據由具有2-5分鐘暴光時間的45-50 2°振蕩組成。典型的數據，在2.0-3.0的分辨率70-90％是完整的具有13-26％的交匯R-因子。因此，根據快速的數據收集方案，數據質量從好至差地排列。但是，已表明數據的這種質量適合于對結合劑的初步檢測，由于具有高質量的起始模型，它已被精選達1.5的分辨率(R=20.7％,Rfree=25.3％)。使用DENZO程序包(Otwinowski等，酶學方法276(1996))處理數據，借助于XPLOR程序包計算電子密度圖形。
應用QUANTA 97程序包(分子模擬公司，產生和展示量子的分子，San Diego分子模擬公司1997)，在Silicon Graphics INDIGO2工作站上檢查電子密度圖形。在活性位點電子密度的形態被目視鑒別為產生自混合物中的一個(或幾個)化合物，指示出存在陽性命中復合物(hit)，或者產生自有序的水分子，指示出不存在結合。對于導致陽性命中復合物的實驗，觀察到適合的化合物移動進入電子密度之中。還核查了電子密度圖確定是否蛋白質結構有任何改變，如果觀測到，則作適當的修正。因此，在圖形檢查和化合物配合步驟之后，就可知道化合物蛋白質復合物的三維結構。尿激酶的例子采用目測移動化合物進入此密度中，因為仍然是小批量進行篩選。當擴展至篩選大批量化合物時，商用程序如QUANTA的XFIT模型裝有助于自動化配合化合物至此密度。 圖6顯示陽性命中復合物的實例。所篩選的化合物編號為1-6，活性位點Fo-Fc電子密度圖形顯示在圖6A。此密度的形態鑒別結合劑為化合物5。圖6B顯示主要的特異性空穴中化合物的詳細結合模型，是通過對CrysteLEADTM電子密度圖的描述直接獲得。氨基氮的氫與Asp189的羧基結合，嘧啶基氮的氫與骨架羰基(Gly218)結合。此結構還顯示，理想的修飾位點應該是在吡啶甲基。 化合物的另一個混合物(化合物7-13)不產生任何命中復合物(hits)。浸漬這組化合物之后所形成的電子密度圖形，與此混合物中任何待測化合物的圖形不相對應。代之，它們與結合的溶劑分子相對應。見圖6C。
圖7顯示陽性命中復合物的另一個實例。在被篩選的7個化合物(14-20)中，圖7A中所示的Fo-Fc圖形表明，被結合的是化合物19。圖7B中描繪的結合模型顯示，2-氨基是以氫鍵同Asp189側鏈結合，并且為了接近相鄰的疏水亞空穴(圖7B中以S1β指示的)，8-羥基是取代的理想位點。圖8代表另一個命中復合物，發現其中化合物22即5-氨基吲哚(圖8A)是以同Asp189結合的氨基氫結合于尿激酶(圖8B)。被篩選的化合物是化合物21-27。
圖9顯示一個實例，發現其中來自相同混合物(化合物28-34)的二個化合物相結合而不存在多占有率的問題。在起初的實驗中，是在存在全部混合化合物時浸漬此晶體，發現化合物28被結合(圖9A)。此外，當將較弱結合的化合物31單獨浸漬時(基于通過CrysteLEADTM確立的原有結構活性關系)，也發現此化合物被結合(圖9B)。在本方法更典型的應用中，如果需要，為了檢測混合物中較弱的結合劑，當不存在較弱結合劑時文庫應被再浸漬。
表1概括了每種CrysteLEADTM命中復合物的抑制常數，是通過焦Glu -Gly-Arg-pNA/HCl(S-2444,Chromogenix)生色活性確定的。測定是在pH6.5(0.1M NaPO4)和pH7.4(50mM Txis)完成。其它的測定條件是150mM NaCl,0.5％Pluronic F-68去垢劑，200mM S-2444，具有DMSO最終濃度2.5％。底物的Km被測定為55μM。
表1通過CrysteLEADTM檢測命中復合物的抑制常數和pKa化合物(CAS#) Ki Ki pKa(pH6.5) (pH7.4) ——5(42753-71-9) ＞＞500μM ＞＞500μM 6.0*19(70125-16-5) 56μM 137μM7.322(65795-92-8) 200μM ＞500μM 6.0*28(580-22-3) 71μM 136μM 7.331(1603-41-4) ＞＞500μM ＞＞500μM 7.0**表示估計的pKa基于此活性和結構信息，選擇了化合物19作為前導化合物。晶體學信息表明，在8-位置取代使之可能接近相鄰的疏水空穴S1β空穴，并從而導致效力增加。根據來自基于脒系列的晶體學和結合信息、合成了化合物35(化合物19的8-氨基嘧啶基類似物)。這種修飾導致在pH6.5(Ki pH7.4=2.5μM；Ki pH6.5=0.32μM)時結合效率增加大約200倍。實驗表明，CrysteLEADTM法可提供前導支架，又可提供詳細的結構信息，這些都是通過基于結構的藥物設計，精心制作這種支架，使之成為更有效的化合物所必需的。 圖10中顯示出化合物35尿激酶晶體的母體化合物19的外罩。此外罩表明，如所預期的，氨基吡啶環被結合于疏水的亞-空穴(S1β)空穴中，并且這種取代導致喹啉環向此位點移動。
還測定了化合物35,8-氨基嘧啶基-2-氨基喹啉的口服生物有效度。對于大鼠，已確定當給予10mg/Kg的劑量時，化合物35的口服生物有效度為30-40％。因此，CrysteLEADTM的成功實施導致形成了一種新穎的前導支架，通過一次基于結構的藥物設計循環產生了具有200倍增效的化合物，并發現是口服生物可利用的。
實施例2VanX萬古霉素是一種特選的藥物，用于由對β-內酰胺抗菌素抗性的鏈球菌或葡萄球菌菌株引起的感染。但是，對于最終依賴的這種藥物，現在已經發現了萬古霉素抗性菌菌株。某些研究者認為VanX，一種金屬蛋白酶與萬古霉素抗性有關聯。VanX是一種級聯過程中的一部分，此過程導致以D-Ale-D-乳酸置換細菌肽聚糖鏈(對萬古霉素的結合位點)末端的D-Ala-D-Ala部分。這樣可導致對萬古霉素的結合降低100倍。VanX的唯一已知的抑制劑是幾種肽或肽衍生物，例如D-Ala-D-Ala底物的膦酸或膦酸類似物。因此，它們并不是適合的藥物，因為在體內它們會被代謝和/或被降解。最初試圖通過正常的篩選方法找到適合的藥物，但未能揭示出適當的配體。隨后，本申請者借助于CrysteLEADTM尋找非肽的前導化合物，用于開發針對治療這些抗性菌株的藥物。
VanX的制備在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養大腸桿菌W3110，使之達到在595nm的吸光度大約為1.3-1.5，此大腸桿菌W3110株含有質粒PGW1，其中的VanX基因是在IPTG-誘導性tac啟動子的控制之下。然后加入IPTG至最終濃度0.8mM，并將細胞再培養1.5小時。
通過以6000rpm離心10分鐘收獲細胞。然后將細胞沉淀再懸浮于含有0.01％NaN3,1mM MgCl2,1mM PMSF,1mM DTT(緩沖液A)和25單位/ml苯并酶(benzonase)(Nicomed Pharma,Copenhagen,Denmark)的冰冷20mM Tris-HCl(pH8.0)中。在一種超聲球磨機微珠制漿機(Biospec)中，通過對裂解混合液(1∶1 V∶V)加入0.1μm的氧化鋯陶瓷微珠，運行1-3分鐘使細胞裂解。這種微珠制漿機隨貯冰容器一起運行，以便保持裂解物冷卻。然后，將裂解液從沉淀的玻璃微珠上輕輕倒出。用1-2倍體積的裂解緩沖液漂洗此微珠，并將此洗液同原來的裂解液合并。然后以25000g離心此裂解液30分鐘使細胞碎片沉淀。在50mM Tris-HCl,pH7.6,1mM EDTA和1mM DTT(緩沖液B)中，4℃將此上清液透析過夜。
然后，將透析過的裂解液對Q-瓊脂糖速溶柱加樣，此柱先以4mm/分鐘的速度用緩沖液A預平衡過。用緩沖液A徹底洗柱，隨后用緩沖液B-緩沖液B+0.5M NaCl的線性梯度液洗脫。將由此步驟得到的VanX活性組份合并在一起，濃縮后對緩沖液B中的Superose-75柱加樣。然后將從Superose柱層析得到的VanX組份以2ml/min的速度對在緩沖液A中的Source-Q柱加樣。用幾倍柱體積的起始緩沖液洗柱。然后用緩沖液A-緩沖液A+25mM NaGl的稀薄梯液洗脫出VanX蛋白。用Amicon濾器，將來自這最后步驟的VanX活性組份濃縮至在緩沖液A中大約15mg/ml的最終濃度。除非另有說明，上面的過程均在4℃進行。純化后，VanX蛋白質的純度大約為95％，并容易結晶。
VanX晶體的結構借助于多同晶型置換，以2.2的分辨率確定了VanX的晶體結構。Bussiere等，分子細胞，Vol 2.pp 75-84(1998)。通過定滴氣霧擴散法(Sitting drop vapor diffusion method)，按空間晶群P21結晶前面獲得的重組蛋白。典型的結晶具有單元室尺寸為a=83.4，b=45.5，c=171.4，α=γ=90°，β=104°，在不對稱單元中具有六個分子。典型的池溶液由0.1M Mes pH6.4,0.24M硫酸銨和20％PMME 5000組成。在定滴微橋(Sitting drop microbridge,Hampton USA)上，將2ml蛋白質與2ml池溶液混合，并用蓋玻片封閉池室。在18℃出現結晶，在大約2-3天之內晶體生長達到充分大小。此蛋白質溶液由在10mMTris中配制的12-15mg/ml(0.5-0.6mM)VanX,15Mm DTT,pH7.2組成。在這些條件下生長的晶體三維結構顯示出一個空活性位點，使此系統可高度適合用于CrystaLEADTM。
VanX活性位點具有能夠接納D-Ala-D-Ala底物的延伸空穴。此空穴還包含催化鋅。因此對于這種情況，最初是針對鋅定向的文庫篩選VanX，以便找到可能匯合成單一前導化合物的多結合支架。篩選了三個文庫，它們利用定向鋅的氨基酸，硫醇，異羥肟酸或羧化物部分。
篩選氨基酸文庫由102個可購得的光學純天然和非天然存在的氨基酸化合物組成。將此文庫分成含8-10個形態不同化合物的12組混合物，并用上述方法進行篩選。具體地說，將每種化合物溶解于100％DMSO中，使之達到最終濃度2M(或者對于小溶解度的成飽和液)。將每組混合物中的每種化合物等體積混合，形成單個化合物的最終濃度為0.33M。將單一的VanX晶體置于含有0.1M Mes pH6.4,0.24M硫酸銨，20％PMME5000和0.5-0.8ml混合化合物的50ml溶液中，此混合化合物被加入形成1-1.6％DMSO和3.3-5.2mM單個化合物最終濃度。使晶體能夠平衡3-4小時。制備了硫醇，異羧肟酸和羧化物文庫，并以類似的方式進行了篩選。
在配有RAXISII,MAR像平面檢測器或MAR CCD檢測器的Rigaku RTP300 RC旋轉陽極源上收集數據。對于像平面系統，典型的數據由具有15分鐘暴光時間的90 1.25°振蕩組成，面對于CCD,100 1.0°振蕩暴光2分鐘。典型可用的數據在2.6-2.8分辨率＞90％是完整的，具有10-20％的交匯R-因子。這需要充分地觀察并鑒別Fo-Fc或2Fo-Fc圖形中的抑制劑。對于這些圖形，其初始模型已被精選達2.1的分辨率(R=25％，Rfree=28％)。借助于DENZO程序包處理數據，借助于XPLOR程序包計算電子密度圖形。存在羧化物文庫的某些化合物時，顯示出空間晶群從P21移向C2(a=170.6,b=47.5,c=83.6,α=γ=90°,β=104°)。對于這種形式，其不對稱單元含有一個三聚體，從而降低了自由度的數目，以致使較低的分辨率數值(3.0)就足夠用于結合觀察。
應用QUANTA 97在Silicon Graphics INDIGO2工作站上檢查電子密度圖形。在活性位點的電子密度圖形被目測鑒別，通過混合物中一個或幾個化合物的形狀鑒別指示出存在陽性命中復合物，或者通過有序的水分子鑒別指示出不存在結合。對于導致陽性命中復合物的實驗，觀察到適合的化合物移動進入電子密度中。還檢查了電子密度圖形有無蛋白質結構有任何改變，如果觀測到，則對其結構作相應的修正。因此，在圖形檢查和化合物配合步驟之后，就可知道化合物蛋白質復合物詳細三維結構。 在VanX篩選中目前已檢測出6個命中復合物(化合物36-41)。圖11顯示代表性命中復合物的結合模型。在所有的情況下，電子密度圖形可鑒別結合的化合物。圖11A顯示與協同于活性位點鋅的羧化物結合的化合物39。圖11B顯示與指向活性位點鋅的羧化物結合的化合物36。圖11C中，還發現化合物37通過羧化物相結合。化合物39和化合物41的結合(后者未顯示)暗示，活性位點鋅優選與羧化物協同，優于自由的硫醇。這導致對羧化物文庫進行了篩選，在此發現了另一些命中復合物。在所有的情況下，化合物都是在7-10個化合物的混合物中被篩選，通過電子密度圖形直接鑒別此命中復合物。可按照類似于對尿激酶實施例所述的方式，將這些命中復合物直接提供給以結構為基礎的藥物設計循環。
實施例3以100個化合物的混合物進行篩選為了增加每單位時間通過CrystaLEADTM法可篩選化合物的數目，本方法的優選實施方案將篩選100個化合物的混合物，而不是10個化合物的混合物。這種方法的好處是較高的化合物吞吐量與降低對命中復合物檢測的靈敏度同時存在。此外，因為只是結合混合物中最有效的化合物，較弱的命中復合物可能被遺漏。例如，當借助于CrystaLEADTM篩選一般性文庫時，其中之一大小，形狀和功能都完全不同，則預期命中碰撞率(hit-rate)較低。因此，較粗略的篩選被證明是合理的。此外，因為從這種篩選獲得的命中復合物可能是更有效的結合劑，所以它們可作為起始支架用于基于結構的藥物設計。因為化合物的混合物將由100個化合物組成，所以應該精心設計此混合物，以便確保全部成員形態不同而足以免除對去盤繞的需要。因此，在檢測命中復合物時，為了鑒別命中復合物，進行某些去盤繞可能是必要的。
為了測驗這種特殊的方法，將一個已知結合于μUK的化合物加到100個化合物的組中。這種已知的結合物化合物19原先已用CrysteLEADTM法發現，表明在pH6.5以56μM的Ki，在pH7.4以137μM的Ki結合于μUK。通過混合10個化合物的10組混合物構成了此100種化合物的混合物。具體地說，將10種干化合物的混合物溶解于100％DMSO中，形成大約80-240mM的最終濃度(或者對于小溶解度的制成飽和液)。將等量的10種化合物的每個混合物混合，形成單個化合物的最終濃度為8.0-24.0mM，并摻入化合物19的100％DMSO貯備液，使之達到最終濃度為18.0mM。將單一的μUK晶體置于27％PEG4000,15.6mM琥珀酸pH5.4,0.17M Li2SO4和0.5μl混合化合物的50μl溶液中，此混合化合物被加入形成1％DMSO。在浸漬實驗中每種化合物的最終濃度在80-240mM的范圍，化合物19的濃度是180mM。在這些條件下，預計本實驗檢測結合物的靈敏度為Kd＜20-60mM。晶體能夠平衡達4小時15分鐘。
以配有MarCCD攝像機的Argonne National Labs新式光子源同步加速器ID射線IMCA收集數據。數據由具有7秒暴光時間的100 1°振蕩組成。數據在1.6分辨率為87.4％完整，具有5.4％的總并匯R-因子。用DENZO程序包(Otwinowski等，酶學方法，276(1969))處理數據，用XPLOR程序包計算電子密度圖形。
應用QUANTA 97程序包(分子模擬公司，量子產生和展示分子。SanDiego分子模擬公司，1997)，在Silicon Graphics INDIGO 2工作站上檢查此電子密度圖形。在活性位點此密度圖形的形態被目測鑒別為是由指示陽性命中復合物的混合物中的一個化合物引起的，此化合物被鑒別為化合物19，并被描繪在圖12中。
對于發現前導化合物這種方法是優選的。前導化合物一般應具有作為較緊密結合物的特征(例如，在本方法靈敏度范圍內)。還能使此方法在1-2星期的時間范圍內篩選10000個化合物的非定向文庫。此方法還可用于同篩選10-20個化合物的其它方法結合，此時較弱的結合物可被鑒別。這些結合物不可能用作前導化合物，但是可附著于前導支架以使增加其效力。
實施例4用CrystaLEADTM篩選ErmC’ErmC’是一種rRNA甲基轉移酶，它在23SrRNA的肽基轉移酶環路內，從S-腺苷基-L-甲硫氨酸將甲基轉移至腺嘌呤的N6。這種甲基化作用使之對許多大環內脂抗菌素如被廣泛開處方的紅霉素具有抗菌素抗性。預期抑制ErmC’將使抗性反轉。為了設計一種特異性的并有效的ErmC’抑制劑，已把目標對準輔助因子或S-腺苷基-甲硫氨酸結合位點。S-腺苷基-L-甲硫氨酸被顯示為下面的化合物42 ErmC’的晶體結構顯示，S-腺苷基-L-甲硫氨酸位點由二個可容納腺嘌呤環和甲硫氨酸的主空穴組成。此外還存在第三個空穴，此空穴可容納受到甲基化的rRNA腺嘌呤。為了在此位點確立SAR，產生了一個在N6和/或5’羥基被取代的腺苷類似物文庫。文庫中變化的位點被顯示為下面的化合物43。 ErmC的表達和純化通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增ErmC’基因和來自pERM-1的上游kdsB順反子，構建了表達載體pTERM31。應用包含在“加尾的”PCR引物中的BamHⅠ和HimdⅢ位點，將此PCR產物亞克隆進入PET24+(Novagen,Madison,WI)中。在T7lac啟動子控制下，通過對kdsB的翻譯偶聯，這個新構建體能夠表達ErmC’。將pTERM31質粒轉化進入E-ColiBL21P(DE3)/PLYS S株(Novagen)，并將所形成的菌株用于產生ErmC’。在New Brunswick Scientific(Edison,NJ)Micros發酵罐中，27.5℃培養轉化的細胞，此發酵罐中含有以卡那霉素，氯霉素和葡萄糖補充的10升Superbroth(BIO 101,La Jolla,CA)。當培養物的光密度達到1.10，通過加入1mM異丙基β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導ErmC’表達。誘導后400分鐘收獲細胞。
在室溫下融化冷凍的細胞糊狀物(200-250g)，并再懸浮于5-10倍體積的冷裂解緩沖液(50mM Tris,5mM1,4-二硫蘇糖醇(DTT)，1mM苯甲基磺酸氟化物(PMSF)，2mM乙烯-二胺四乙酸(EDTA),0.2％TritonX-100,pH7.8)中。用French壓碎器裂解細胞，離心除去細胞碎片。將其上清液對20升Tris-DTT-甘油-鎂(TDGM)緩沖液pH7.8(50mMTris,5mM DTT,10％甘油，10mM MgCl2)透析過夜。然后將此透析物對已在TDGM緩沖液中預平衡的Sepharose Fast Flow柱加樣。檢測各組份中甲基轉移酶活性，將含有ErmC’的組份合并在一起，對TSK SP-5PW柱(TosoHaas,Nontgomeryville,PA)加樣，用NaCl梯度液洗脫。然后在YM-10(Amicon)濾膜上濃縮此純化的蛋白質。
ErmC晶體結構借助于懸滴氣霧擴散法培育ErmC’的晶體。對裝有100mM Tris,500mMNH4(SO)4,15％PEG 8000,pH7.8的儲液器平衡含有在25mM Tris/Cl,100mM NaCl,2mM DTT,10％(v/v)甘油，pH7.5中配制的5-8mg/ml ErmC’的液滴。在1天內出現晶體，1周內長至充分的體積。晶體屬于空間晶群P43212。應用在空間晶群P6中ErmC’的晶體結構(Bussiere等，生物化學Vol 137,pp 7103-7112)，通過達2.2分解率的分子置換確定了在這種空間晶群中ErmC’的結構。在這些條件下長成的晶體3維結構顯示出一個空活性位點，使它成為非常適合應用CrystaLEADTM的系統。
篩選此腺苷文庫由59個化合物組成。將此文庫分成8-9個形態不同化合物的7組混合物，并借助于CrystaLEADTM法進行篩選。具體地說，將每個化合物溶解于100％DMSO中，形成最終濃度1M(或者對于小溶解度的成飽和液)。混合等體積的每個化合物，組成10個化合物的混合物。將單一的ErmC晶體置于20％PEG 8000,0.3M硫酸銨，10％甘油,pH7.7和0.5-0.8ml混合化合物的50μl溶液中，被加入的混合化合物形成1-1.6％DMSO和3.3-5.2mM單個化合物最終濃度。使晶體能平衡3-4小時。
在帶有RAXISII，MAR像平面檢測器或MAR CCD檢測器的Rigaku RTP300 RC旋轉陽極源上收集數據。對于像平面系統，典型的數據由15-20 2°振蕩組成，具有20-30分鐘的暴光時間，而對于CCD系統，15-20 2.0°振蕩暴光8-15分鐘。典型可用的數據在3.4-3.6分辨率80-90％是完整的，具有7-16％的交匯R-因子。這需要充分地觀測，并在Fo-Fc或2Fo-Fc圖形中鑒別抑制劑。對于這些圖形，起始模型已被精選達2.2分辨率(R=20％ Rfree=25％)。用DENZO程序包處理數據，通過XPLOR程序包計算電子密度圖形。
應用QUANTA 97，在Silicon Graphics INDIGO2工作站上檢查電子密度圖形。目測鑒別活性位點此密度圖形的形狀，通過混合物中一個或幾個化合物的形狀指示陽性命中復合物(Positive hit)，或者通過有序水分子指示不存在結合。對于導致陽性命中復合物的實驗，目視發現適合的化合物移動進入此電子密度中。還核查了此電子密度圖形是否存在蛋白質結構的改變，如果觀測到則對結構作相應的修改。因此，在圖形檢查和化合物配合步驟之后，就可知道化合物蛋白質復合物的詳細3維結構。
在對ErmC’腺苷類似物的篩選中檢測到二個命中復合物(化合物44和45)。圖13和14顯示出化合物44和45與ErmC’復合物的晶體結構。 在所有情況下，電子密度的形態可鑒別結合的化合物。發現疏水的替代物沿著部分暴露的疏水表面相結合，暗示存在可能有助于這些化合物結合的優選相互作用，使它們能夠作為命中復合物被檢出。沒有檢測出在5’OH位置含有替代物的命中復合物。對化合物44和45的后隨化合物在此疏水位點含有最優化的氫化茚取代基。
序列表<110>Nienaber,VickiGreer,JonathanAbad-Zapatero,CelerinoNorbeck,Daniel<120>借助于X-射線晶體學方法篩選和設計配體<130>6308.US.P1<150>09/036,184<151>1998-03-06<160>14<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>51<212>DNA<213>合成的<400>1attaatgtcg actaaggagg tgatctaatg ttaaaatttc agtgtggcca a51<210>2<211>57<212>DNA<213>合成的<400>2attaataagc tttcagaggg ccaggccatt ctcttccttg gtgtgactcc tgatcca57<210>3<211>47<212>DNA<213>合成的<400>3attaattgcg cagccatccc ggactataca gaccatcgcc ctgccct47<210>4<211>46<212>DNA<213>合成的
<400>4attaatcagc tgctccggat agagatagtc ggtagactgc tctttt46<210>5<211>28<212>DNA<213>合成的<400>5attaatcagc tgaaaatgac tgttgtga28<210>6<211>51<212>DNA<213>合成的<400>6attaatgtcg actaaggagg tgatctaatg ttaaaatttc agtgtggcca a51<210>7<211>37<212>DNA<213>合成的<400>7attaatgcta gcctcgagcc accatgagag ccctgct37<210>8<211>42<212>DNA<213>合成的<400>8attaatgcta gcctcgagtc acttgttgtg actgcggatc ca42<210>9<211>44<212>DNA<213>合成的<400>9ggtggtgaat tctcccccaa taatgccttt ggagtcgctc acga44<210>10<211>111
<212>DNA<213>巴斯德畢赤酵母<400>10atgttctctc caattttgtc cttggaaatt attttagctt tggctacttt gcaatctgtc60ttcgctcagc cagttatctg cactaccgtt ggttccgctg ccgagggatc c111<210>11<211>22<212>DNA<213>合成的<400>11gaaacttcca aaagtcgcca ta22<210>12<211>92<212>DNA<213>合成的<400>12attaatgaat tcctcgagcg gtccgggatc cctcggcagc ggaaccaacg gtagtgcaga60taactggctg agcgaagaca gattgcaaag ta92<210>13<211>46<212>DNA<213>合成的<400>13attaatggat ccttggacaa gaggattatt gggggagaat tcacca46<210>14<211>47<212>DNA<213>合成的<400>14attaatctcg agcggtccgt cacttggtgt gactgcgaat ccagggt4權利要求
1．一種用于鑒別靶生物分子配體的方法，包括a)獲得靶生物分子的晶體；b)將此靶生物分子晶體暴露于一個或更多的待測樣品，以及c)獲得X-射線晶體衍射圖形，以便確定是否形成了配體/受體復合物。
2．權利要求1的方法，進一步還包括在暴露于待測樣品之前，獲得靶生物分子晶體X-射線衍射圖形的步驟，并且將暴露前后的靶分子X-射線衍射圖形相比較。
3．權利要求1的方法，進一步還包括將衍射圖形轉化成電子密度圖的步驟。
4．權利要求3的方法，進一步還包括將電子密度圖變換成結構的步驟。
5．權利要求1的方法，其中是通過在含有待測樣品的溶液中浸泡靶生物分子晶體，而使此靶生物分子暴露于待測樣品。
6．權利要求1的方法，其中是通過在含有待測樣品混合物的溶液中浸泡靶生物分子晶體，而使此靶生物分子暴露于待測樣品。
7．權利要求1的方法，其中是通過使靶生物分子晶體與待測樣品共結晶，而使此靶生物分子暴露于待測樣品。
8．權利要求1的方法，其中是通過使靶生物分子晶體與待測樣品的混合物共結晶，而使此靶生物分子暴露于待測樣品。
9．權利要求6的方法，其中混合的待測樣品是不同形狀的。
10．權利要求8的方法，其中混合的待測樣品是不同形狀的。
11．權利要求1的方法，其中的配體是生物學活性部分。
12．權利要求1的方法，其中的靶分子是多肽。
13．權利要求1的方法，其中的靶分子是工程改造的多肽。
14．一個生物學活性部分，是通過權利要求11的方法鑒別的。
15．權利要求1的方法，其中該配體是一個前導化合物。
16．一種為靶生物分子設計配體的方法，包括a)獲得靶生物分子的晶體；b)通過X-射線晶體學篩選鑒別至少二個靶生物分子的配體；c)當這些配體結合于靶生物分子時，確定它們的空間取向；以及d)按照其空間取向將這些配體連接在一起，以便形成該配體。
17．權利要求16的方法，其中是通過形成多配體/靶分子復合物，以及產生此多配體/靶分子復合物的X-射線晶體結構，來確定結合配體的空間取向。
18．權利要求16的方法，其中是一個配體先結合于靶分子，然后另一個配體結合于此靶分子。
19．權利要求16的方法，其中該配體是生物學活性部分。
20．權利要求16的方法，其中的靶分子是多肽。
21．權利要求16的方法，其中的靶分子是工程改造的多肽。
22．一個生物學活性部分，是通過權利要求19的方法設計的。
23．權利要求16的方法，其中該配體是前導化合物。
24．一種設計靶生物分子配體的方法，包括a)獲得靶生物分子的晶體；b)通過X-射線晶體學篩選法鑒別靶生物分子的配體；c)制備該配體的衍生物。
25．權利要求24的方法，其中該配體是前導化合物。
26．權利要求24的方法，其中該配體是生物活性化合物。
27．權利要求24的方法，其中的靶分子是多肽。
28．權利要求24的方法，其中的靶分子是工程改造的多肽。
29．一種前導化合物，是通過權利要求25的方法鑒別的。
30．一種生物活性化合物，是通過權利要求25的方法設計的。
31．一種生物活性化合物，是通過權利要求26的方法設計的。
32．一種形成具有易接近的生物分子活性位點晶體的方法，包括a)使生物分子與可降解的配體共結晶；以及b)一旦晶體形成就使此配體降解。
33．權利要求32的方法，其中生物分子的活性位點可降解此配體。
34．權利要求32的方法，還進一步包括加入降解劑以便降解此配體。
35．權利要求32的方法，其中該配體可自發地降解。
全文摘要
對于未知是靶生物分子配體的化合物,可應用X－射線晶體學方法篩選它們結合靶生物分子的能力。此方法包括:獲得靶生物分子的晶體;將此靶生物分子晶體暴露于一個或多個待測樣品;以及獲得X－射線晶體衍射圖形,以及確定是否形成了配體/受體復合物。可通過存在一個或多個待測樣品時共結晶生物分子,或者通過在一個或多個待測樣品的溶液中浸泡此生物分子的晶體,而使此靶分子暴露于待測樣品。在另一個實施方案中,應用來自配體/受體復合物的結構信息設計配體,此配體結合更緊密,更特異性地結合,具有更好的生物活性,或者具有更安全的分布。本發明進一步的實施方案,包括借助于這種直接的方法鑒別或設計生物活性部分。在還有一個實施方案中,是通過使此生物分子與一個可降解的配體共結晶,并使此配體降解而形成具有易接近的活性位點的生物分子晶體。
文檔編號G01N33/15GK1299467SQ99805886
公開日2001年6月13日 申請日期1999年3月5日 優先權日1998年3月6日
發明者V·L·尼納伯, J·格雷爾, C·阿巴德-扎帕特洛, D·W·諾爾貝克 申請人:艾博特公司