利用抑制劑治療與rtk機(jī)能亢進(jìn)相關(guān)的紊亂的制作方法

專利名稱：利用抑制劑治療與rtk機(jī)能亢進(jìn)相關(guān)的紊亂的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用抑制劑治療和／或預(yù)防由于受體酪氨酸激酶活性增高而導(dǎo)致的疾病，尤其是癌癥。這一應(yīng)用特別針對于抑制或降低受體酪氨酸激酶(RTK)的過表達(dá)和／或其改變的活性。具體地說，受體酪氨酸激酶活性的這種改變通過FGFR-4的突變激發(fā)，其中該突變特別地是FGFR-4跨膜結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變，導(dǎo)致疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及FGFR激酶抑制劑的應(yīng)用，尤其是用于治療和／或預(yù)防癌癥。此外，本發(fā)明涉及導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)和／或活性改變的突變FGFR-4。最后，本發(fā)明涉及突變FGFR-4分子的DNA和RNA序列。另外，本發(fā)明涉及含上述抑制劑的藥物組合物及診斷和篩選方法。
細(xì)胞生長是取決于生物體特殊需要的細(xì)微調(diào)控過程。在年輕的生物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度超過細(xì)胞死亡速度，導(dǎo)致機(jī)體大小的增長。在成體內(nèi)，新細(xì)胞的形成和細(xì)胞死亡是平衡的，因此出現(xiàn)“穩(wěn)定期”。然而，在很少一些情況下，細(xì)胞增殖的調(diào)控?fù)p壞，盡管在生物體內(nèi)無需更多的此類細(xì)胞，細(xì)胞仍開始生長和分裂。該不受控制的細(xì)胞生長是癌癥的起因。能引起不受控細(xì)胞生長、有時(shí)與轉(zhuǎn)移形成相關(guān)的因子通常是化學(xué)性的，但有時(shí)也可是物理性的，如放射性輻射。引起癌癥的另一原因是某些生物體內(nèi)的遺傳異?；蛲蛔?，它們遲早會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的退化。
迄今為止，仍未可能滿意地闡明調(diào)控正常生長和分化(例如乳腺)的過程。除激素調(diào)節(jié)外，還有局部產(chǎn)生的干預(yù)乳腺細(xì)胞發(fā)育之不同生長因子的網(wǎng)狀系統(tǒng)復(fù)合體。乳腺細(xì)胞中癌癥發(fā)生的準(zhǔn)確原因是不同的，因而也是不清楚和未知的，其它細(xì)胞的情況也是如此。癌基因和腫瘤抑制基因的變化似乎在乳腺癌發(fā)生中起重要作用。此外，遺傳性改變的細(xì)胞中的調(diào)節(jié)因子引起的刺激增強(qiáng)可導(dǎo)致細(xì)胞生長的增加。
目前，癌癥治療基本上有兩種方法。一種是通過外科手術(shù)將癌細(xì)胞從發(fā)病生物體內(nèi)成功地完全去除，另一種是嘗試使退化細(xì)胞在生物體內(nèi)變得無害，例如通過施用藥物(化學(xué)療法)或物理治療方法，如放射治療。
在化學(xué)療法中，藥物經(jīng)常以干預(yù)DNA代謝并損傷快速生長細(xì)胞的形式使用，該細(xì)胞有更強(qiáng)的DNA代謝能力，比緩慢分裂或根本不分裂的細(xì)胞要強(qiáng)。不過，許多化學(xué)治療藥物的嚴(yán)重缺點(diǎn)是所用活性物質(zhì)的特異性低，其結(jié)果是健康細(xì)胞在化療過程中也被損傷。活性物質(zhì)的這種低特異性還要求其劑量在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)必須盡可能的少地?fù)p傷健康細(xì)胞。這經(jīng)常是不可能的，由于癌細(xì)胞不斷進(jìn)一步蔓延，在最后階段引起重要功能衰竭而使癌癥病人死亡。
推測某些生長因子受體的過表達(dá)和／或活性改變可加強(qiáng)許多腫瘤，包括乳腺癌的生長。例如，已知乳腺癌中EGFR，即表皮因子受體或ERB B-2受體的過表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)。FGF(歷史上稱為成纖維細(xì)胞生長因子)蛋白質(zhì)也可能與乳腺癌或其它癌癥的發(fā)展有關(guān)；不過這方面的結(jié)果比較矛盾或者不太確定。
FGF組成調(diào)節(jié)因子肽的一大家族，迄今為止其中9個(gè)成員是已知的。其中8個(gè)已在人體內(nèi)得到很好的鑒定(Basilico和Moscatelli，1992；Coulier等，1993)。FGF通過高親和性的酪氨酸激酶受體起作用，所述受體由至少4個(gè)不同基因編碼。此外，F(xiàn)GF是多功能的調(diào)節(jié)肽，它不僅可影響腫瘤發(fā)生，還可能在心血管疾病、組織損傷后的重建、神經(jīng)生物學(xué)和胚胎發(fā)育中起主要作用。酸性和堿性FGF(aFGF和bFGF)是此家族中最早且最為全面地表征了的成員。例如，在體內(nèi)，F(xiàn)GF與胚胎發(fā)生中的中胚層誘導(dǎo)有關(guān)(Slack等，1987；Kimelman等，1988)，還與血管發(fā)生有關(guān)(Thomas等，1985；Thompson等，1989；Folkmann和Klagsbrun，1987)。
已鑒定出了編碼相應(yīng)受體(FGFR)的4個(gè)類似基因。這些基因編碼結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含由3個(gè)免疫球蛋白環(huán)和一酸性部分組成的胞外結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，具酪氨酸激酶活性。這些基因中的兩個(gè)，F(xiàn)GFR-1和FGFR-2具有不同剪接引起的多種轉(zhuǎn)錄物(Givol和Yayon，1992和Johnson和Williams，1993)。這些基因的剪接變體不同在于受體胞外區(qū)域中免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和第三個(gè)免疫球蛋白后半部分的序列差異，它們可能是由于外顯子不同引起。此外，還可能出現(xiàn)跨膜和近膜區(qū)的縮短或缺失，產(chǎn)生分泌型或激酶失活型的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
對于FGFR-3，有可能找到不同轉(zhuǎn)錄物和相應(yīng)同種形，但對于FGFR-4則只有單獨(dú)的一種已知蛋白質(zhì)產(chǎn)物。因?yàn)橛写罅康腇GFR基因和轉(zhuǎn)錄物，而許多蛋白質(zhì)產(chǎn)物缺乏對給定FGF的特異性，所以測定具體配體對具體受體的作用是困難的。因此，確定特定FGF受體和具體疾病間的相關(guān)性就有很大的困難，更不用說具體受體特殊作用機(jī)制與疾病的相關(guān)性了。因而，利用FGFR有效治療疾病，尤其是復(fù)雜疾病如癌癥是不容易的。
因而本發(fā)明的一個(gè)目的是描述一種治療和／或預(yù)防體細(xì)胞紊亂，尤其是癌癥的可能方法，在所說的紊亂發(fā)展過程中涉及受體酪氨酸激酶(RTK)。特別是，本發(fā)明的一目的是抑制和／或降低例如受體酪氨酸激酶的過表達(dá)和／或固有活性的改變。
本發(fā)明的另一目的是抑制和／或降低突變FGFR-4之受體酪氨酸激酶的變化活性。
本發(fā)明的另一目的是描述涉及癌發(fā)生和／或轉(zhuǎn)移形成的另一種RTK。另外，本發(fā)明的目的是描述該RTK的DNA序列或相應(yīng)RNA序列。
本發(fā)明的另一目的是描述改善的診斷或差別診斷和篩選的方法。
最后，本發(fā)明的一目的是描述尤其可治療癌癥的藥物組合物。
通過獨(dú)立權(quán)利要求的對象可達(dá)到這些目的。該獨(dú)立的權(quán)利要求顯示了本發(fā)明的優(yōu)選方面。
為了更好地理解本發(fā)明，本文詳述了所用術(shù)語。
“抑制劑”理解為可抑制RTK或降低其活性的任何物質(zhì)。它可以是直接針對RTK的低分子量物質(zhì)、激酶失活受體或抗受體抗體。
“激酶失活受體”理解為不再具任何酪氨酸激酶活性的任何受體。
“受體酪氨酸激酶”理解為具酪氨酸激酶活性的任何受體。該術(shù)語包括具酪氨酸激酶活性的生長因子受體和HER2或met受體。
“RTK機(jī)能亢進(jìn)”理解為過表達(dá)(見下文)和／或改變了的活性(見下文)。
“缺陷信號轉(zhuǎn)移活性”指突變受體不再能將胞外生長信號或另一信號轉(zhuǎn)變成胞內(nèi)信號，即此缺陷信號的產(chǎn)生不再依賴于配體，例如生長因子的存在。
“生長因子”是指由正常和／或轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌并在細(xì)胞生長的調(diào)控，特別是細(xì)胞增殖的刺激和其生活力的維持中起重要作用的任何促有絲分裂化學(xué)物質(zhì)，通常是多肽。術(shù)語“生長因子”包括例如表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)和神經(jīng)生長因子(NGF)及FGF，即成纖維細(xì)胞生長因子。
“突變的受體酪氨酸激酶”理解為與野生型受體相比包含結(jié)構(gòu)的改變，以致受體具有不同于野生型受體之可調(diào)控的酪氨酸激酶活性的受體酪氨酸激酶。一類突變導(dǎo)致RTK的改變了的活性。
“野生型生長因子受體”或“野生型”受體理解為天然存在的生長因子受體或帶非突變氨基酸序列的受體。“野生型”對應(yīng)于種群中最為常見的受體變體。
生長因子受體或受體的“胞外結(jié)構(gòu)域”應(yīng)理解為通常從細(xì)胞中伸出至細(xì)胞外環(huán)境的受體部分。胞外結(jié)構(gòu)域包括例如與生長因子或另一分子(配體)進(jìn)行結(jié)合的受體部分。
生長因子受體或受體的“跨膜區(qū)”理解為受體的疏水部分，它通常位于表達(dá)受體之細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)。
生長因子受體或受體的“酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域”或“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”理解為通常位于細(xì)胞內(nèi)并導(dǎo)致酪氨酸殘基發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸化作用的受體部分。
“有效量”是能達(dá)到預(yù)期治療效果的本發(fā)明組合物的量。
“成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)”是可影響細(xì)胞，尤其是成纖維細(xì)胞的生長和其他特性的促有絲分裂多肽。
“過表達(dá)”指與野生型相比，細(xì)胞的RTK蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加。這可由例如RTK基因的基因擴(kuò)增引起，導(dǎo)致過度的、不受控制的細(xì)胞分裂活性。
“改變了的活性”是指由生長因子受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)移途徑的持久活性。因此，具有改變了的RTK時(shí)，激酶活性在無配體時(shí)還存在。
按照本發(fā)明，突變FGFR-4可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)受體酪氨酸激酶的過表達(dá)和／或改變了的活性，從而導(dǎo)致癌癥。
生長因子受體在人癌細(xì)胞的發(fā)展和增殖中起決定性的作用。在健康細(xì)胞里，生長因子受體參與控制細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞遷移等。細(xì)胞分裂的真正信號是生長因子，它的形成取決于生物體的需求。受體承擔(dān)信號轉(zhuǎn)移功能，即它涉及將細(xì)胞外生長信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞分裂活性。對于許多生長因子受體，在生長因子與胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，它們轉(zhuǎn)移磷酸基至蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基上的能力起決定性的作用。這些受體也稱為受體酪氨酸激酶。受體酪氨酸激酶的綜述可見于Yarden Y和UllrichA，Rev．Biochem．1988，57，443-78。這些生長因子受體在與生長因子結(jié)合后的二聚化是信號轉(zhuǎn)移過程中進(jìn)一步的重要事件。由具酪氨酸激酶活性的生長因子受體介導(dǎo)的將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)信號的過程可分成以下5個(gè)步驟1．生長因子(也稱配體)與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，誘發(fā)構(gòu)象改變；這引起2．具改變構(gòu)象的受體的二聚化；及3．同時(shí)誘導(dǎo)激酶活性；4．受體二聚體中酪氨酸殘基的轉(zhuǎn)磷酸作用，再次產(chǎn)生和穩(wěn)定了活化的受體構(gòu)象；和5．多肽底物的磷酸化作用及與細(xì)胞因子的相互作用。
例如由于受體過表達(dá)或活性改變而引起的該信號轉(zhuǎn)移鏈不受控的機(jī)能亢進(jìn)可與其他因素一起導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞的分裂活性增高，在極端例子中產(chǎn)生退化的癌細(xì)胞。有關(guān)生長因子受體及其從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移信號至細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的功能和對癌發(fā)生中異常表達(dá)受體的可能影響的綜述可見UllrichA和Schlessinger J(1990)細(xì)胞61，203-212。
現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在上述5個(gè)階段的信號轉(zhuǎn)移鏈中，突變FGFR-4導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)移活性的提高，在此發(fā)展過程中特別地涉及突變RTK的改變了的活性。
因此，按照本發(fā)明的權(quán)利要求1，利用至少一種受體酪氨酸激酶抑制劑治療和／或預(yù)防RTK機(jī)能亢進(jìn)誘發(fā)的紊亂，特別是癌癥。而且，按本發(fā)明，由于信號轉(zhuǎn)移增加而使組織過度增殖和／或組織侵入力提高引起的疾病或體細(xì)胞紊亂也可被消除或減輕。
對于抑制劑及低分子量物質(zhì)，例如可使用至少一種激酶失活受體。通過使用如激酶失活受體之類的抑制劑，受體酪氨酸激酶之改變了的活性可被抑制和／或降低。正如前面已提到的，生長因子受體的過表達(dá)和／或改變了的活性是引起癌癥或其發(fā)展中的重要因素。例如已知乳腺癌中EGFR或Erb B-2受體的過表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)(見上文)。因此抑制這種過表達(dá)和／或改變了的活性是癌癥治療和／或預(yù)防中重要的部分。在胚胎發(fā)生中，F(xiàn)GFR-4被組織特異性關(guān)閉。然而，它存在于30％的乳腺癌病人中；在健康個(gè)體的組織中則檢測不到。使用受體酪氨酸激酶的抑制劑可導(dǎo)致降低或完全抑制過表達(dá)和／或改變了的活性。同樣地，使用激酶失活受體可導(dǎo)致降低和／或完全抑制受體酪氨酸激酶活性，因?yàn)殡s二聚體的激酶功能不再能轉(zhuǎn)移信號。激酶失活受體的作用基于的是形成了非功能性雜二聚體(稀釋效果)。信號轉(zhuǎn)移的缺乏導(dǎo)致不會(huì)傳遞過表達(dá)和／或改變了的活性信號，其結(jié)果是阻止了信號轉(zhuǎn)變成細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)。因此，通過受體酪氨酸激酶的抑制或通過這些激酶失活受體，有可能有效和積極地介入癌癥的治療和／或預(yù)防。
已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR-4突變還出現(xiàn)于健康人種系中。推測種系突變會(huì)導(dǎo)致遺傳性的易患病體質(zhì)，致使病人易患多種疾病。關(guān)于癌發(fā)生，推測腫瘤組織中突變受體的表達(dá)提高與癌生成相關(guān)。種系突變還被認(rèn)為是以下疾病的誘因動(dòng)脈硬化癥、白血病、淋巴瘤、肝細(xì)胞癌和膽管癌。
因此，本發(fā)明提供了一種新的遺傳標(biāo)記，它在多種疾病及其易感性的診斷和早期識別中極其有用。
因而本發(fā)明還涉及待檢材料中編碼FGFR-4之核酸的檢測方法，從而特別檢測受體編碼核酸的突變。這可通過與寡核苷酸探針雜交進(jìn)行，該方法可特異指示突變，尤其是點(diǎn)突變的存在與否。在此利用了例如突變核酸和寡核苷酸之間的“錯(cuò)配”，若錯(cuò)配存在，雜交就不會(huì)發(fā)生從而無信號?；蛘?，還可用特異FGFR-4 PCR引物擴(kuò)增核酸，隨后用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割來檢測突變。若突變影響到限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，以致突變的識別序列不再被限制性核酸內(nèi)切酶識別為切割位點(diǎn)，這就產(chǎn)生了與非突變野生型不同的限制片段。用PCR方法可特異檢測限制片段，從而例如在已提到的情況中，突變體存在的限制片段較野生型的大?；蛘撸蛔冞€可導(dǎo)致新限制性切割位點(diǎn)的產(chǎn)生，其結(jié)果是在用恰當(dāng)酶切割后，“野生型片段”在突變體里更小。以X57205收錄于EMBL GeneBank／DDBJ序列的FGFR-4內(nèi)跨膜結(jié)構(gòu)域中第388位的突變，導(dǎo)致野生型中的甘氨酸替換為突變體中的精氨酸，這一突變與限制性核酸內(nèi)切酶BstNI的識別序列GGWCC有關(guān)。結(jié)果形成80和29bp的兩個(gè)新限制片段，可通過限制酶分析被特別檢測。
本發(fā)明進(jìn)一步顯示RTK的過表達(dá)、特別是改變了的活性會(huì)導(dǎo)致侵入性增加，即加強(qiáng)了轉(zhuǎn)移的形成。既然轉(zhuǎn)移形成是癌癥的一個(gè)主要問題，這表明抑制或降低過表達(dá)和／或改變了的活性可有效抗癌，從而尤其可以抑制轉(zhuǎn)移形成。
可能的抑制劑例如可見于Mohammadi等(1997)。
優(yōu)選按本發(fā)明干預(yù)由FGFR-4突變引起的受體酪氨酸激酶過表達(dá)和／或改變了的活性。此突變可以是一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。尤其是此突變可發(fā)生在FGFR-4的跨膜結(jié)構(gòu)域中，其結(jié)果是親水性氨基酸替換了疏水性氨基酸。
已知FGFR-3中導(dǎo)致親水性氨基酸替換疏水性氨基酸的點(diǎn)突變與某些疾病相關(guān)。例如，在軟骨發(fā)育不全病人中，已發(fā)現(xiàn)由于跨膜結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變導(dǎo)致成纖維細(xì)胞生長因子受體3的活性改變。軟骨發(fā)育不全是侏儒癥最通常出現(xiàn)的遺傳形式，是一種常染色體顯性疾病，本質(zhì)上基于的是某些骨成熟過程的缺陷。軟骨發(fā)育不全可由FGFR-3跨膜結(jié)構(gòu)域中一個(gè)精氨酸取代甘氨酸引起。還顯示FGFR-3中的精氨酸突變激活了二聚體受體的激酶功能。精氨酸點(diǎn)突變還導(dǎo)致FGFR-3本身的酪氨酸激酶活性的不依賴于配體的刺激作用，并使得受體上改變的磷酸酪氨酸水平大大提高。這些結(jié)果表明，軟骨發(fā)育不全的分子基礎(chǔ)是FGFR-3不受調(diào)控的信號轉(zhuǎn)移。
FGFR-3跨膜結(jié)構(gòu)域中的另一突變是丙氨酸替換為谷氨酰胺。此氨基酸替換導(dǎo)致另一種疾病，即具黑棘皮癥的Crouzon’s病。
按照本發(fā)明，F(xiàn)GFR-4中的突變，尤其是跨膜結(jié)構(gòu)域中親水性氨基酸替換疏水性氨基酸的點(diǎn)突變與癌癥產(chǎn)生和不良預(yù)后有關(guān)，因此，受體酪氨酸激酶的抑制或激酶失活受體的應(yīng)用適于癌癥的治療和／或預(yù)防，其中由于突變，受體酪氨酸激酶被過表達(dá)或以改變的方式起活性作用。
特別是，對于第388位精氨酸替換甘氨酸的點(diǎn)突變，其結(jié)果之一是受體酪氨酸激酶以改變的方式起活性作用，且這純合或雜合地導(dǎo)致無需配體刺激的信號轉(zhuǎn)移，從而可引起不受控的細(xì)胞生長。在最壞的情況下，此不受控細(xì)胞生長導(dǎo)致癌癥?？缒そY(jié)構(gòu)域具如下序列(ID No．1)RYTDIILYASGSLALAVLLLLARLY，而突變結(jié)構(gòu)域具以下序列(ID No．2)RYTDIILYASGSLALAVLLLLAGLY．不局限于一種理論，設(shè)想帶前述點(diǎn)突變之一，尤其是第388位引起精氨酸替換甘氨酸之點(diǎn)突變的受體酪氨酸激酶的活化作用是以二聚體構(gòu)象的受體的穩(wěn)定性為基礎(chǔ)的，此二聚體的存在是由于通過它們的相互作用可能改變跨膜結(jié)構(gòu)域。配體非依賴性二聚體的形成加強(qiáng)導(dǎo)致受體酪氨酸激酶活性增高和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。點(diǎn)突變對引發(fā)癌癥作用的其他可能性機(jī)制有，例如，突變作用于FGFR-4的信號轉(zhuǎn)移，受體通過膜的遷移被阻止，受體自身或與其他FGFR的二聚化作用被打斷，或受體的酪氨酸激酶活性受到影響。
按照本發(fā)明，可見56％來自St Petersburg的乳腺癌病人(活體切片檢查研究)在第388位攜帶與精氨酸替換甘氨酸相關(guān)的突變。其中45％是雜合的，而11％是純合的。此明顯高的比例表明第388位點(diǎn)突變與乳腺癌發(fā)生之間存在聯(lián)系。
在對德國乳腺癌病人的進(jìn)一步研究中，只有43％的病人顯示有第388位的點(diǎn)突變。從對癌癥病人的正常組織和來自正常個(gè)體組織之DNA的研究中可推斷該突變是種系突變。
此外，為了確定第388位點(diǎn)突變的比例，還研究了來自細(xì)胞系的基因組DNA和cDNA。以正常乳腺上皮細(xì)胞系為對照，所研究的細(xì)胞系來源于乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和子宮癌。除正常乳腺上皮細(xì)胞系外，所有的細(xì)胞系中可發(fā)現(xiàn)在FGFR-4分子的第388位有很高百分比的點(diǎn)突變。因此上述抑制劑或激酶失活受體的使用尤其適于治療癌癥。成神經(jīng)細(xì)胞瘤、子宮癌和胰腺癌的治療，還有其他類型癌癥的治療，看上去尤其有希望。
特別優(yōu)選的是使用抑制突變FGFR-4的抑制劑，尤其是抑制跨膜結(jié)構(gòu)域中第388位甘氨酸突變?yōu)榫彼岬腇GFR-4的抑制劑。
此外，本發(fā)明涉及導(dǎo)致細(xì)胞中受體過表達(dá)和／或活性改變的突變FGFR-4。優(yōu)選地，此突變FGFR-4的特征在于其野生型的疏水性氨基酸被突變受體中的親水性氨基酸取代。尤其優(yōu)選的是該突變是點(diǎn)突變且發(fā)生在跨膜結(jié)構(gòu)域中。還更優(yōu)選的是，此點(diǎn)突變發(fā)生在第388位，優(yōu)選甘氨酸被精氨酸置換。
迄今為止，專家們認(rèn)為只存在一種FGFR-4，它是未突變的。突變FGFR-4是未知的。因此令人驚訝的是，按照本發(fā)明顯示有突變FGFR-4的存在。特別是，按照本發(fā)明，可證實(shí)在突變，尤其是388位點(diǎn)突變與癌癥發(fā)生之間存在聯(lián)系。而且，健康人中的種系突變與遺傳性易患病體質(zhì)有關(guān)，對動(dòng)脈硬化癥特別如此。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含突變FGFR-4編碼序列的DNA分子。本發(fā)明還包括含編碼突變FGFR-4之RNA序列的RNA分子。以上序列可用于癌癥診斷。在此，所述序列可特異識別FGFR-4中的突變。FGFR-4中突變的存在與癌癥治療的不良預(yù)后相關(guān)。其原因可能是由于相應(yīng)腫瘤的侵入性生長特性。
除此之外，本發(fā)明涉及用于乳腺癌差別診斷的方法，包括使病人的核酸與上述DNA和／或RNA之一接觸，以獲得指示突變FGFR-4是否存在的信號。最后，本發(fā)明涉及含上述抑制劑或激酶失活受體的藥物組合物。除此之外，本發(fā)明還涉及鑒定酪氨酸激酶活性抑制劑的方法，其中包括使本發(fā)明受體與可能的抑制劑接觸，并在存在和／或缺乏抑制劑的情況下測定酪氨酸激酶活性。
此外，突變存在與否的檢測也可如上詳述的通過PCR和隨后的限制酶切割完成。
最后，其他的分子生物學(xué)診斷方法也是有可能的。
此外，本發(fā)明的一個(gè)目的是可與本發(fā)明的突變FGFR-4特異反應(yīng)的抗體。“特異”在本發(fā)明的意義上表示本發(fā)明抗體可與突變受體結(jié)合，但不與未突變受體結(jié)合。
以下通過附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳述。
在此

圖1顯示FGFR-4免疫沉淀的SDS PAGE(用箭頭標(biāo)出了磷酸化FGF受體-4)，圖2顯示突變FGFR-4的聚丙烯酰胺凝膠電泳，圖3顯示FGFR-4跨膜結(jié)構(gòu)域的序列分析，圖4顯示FGFR-4突變G388R與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移形成狀態(tài)之間的相互關(guān)系(n=病人數(shù)，p=P值)和圖5顯示FGFR-4突變G388R與無復(fù)發(fā)生存時(shí)間之間的相互關(guān)系(n=病人數(shù)，p=P值)。
實(shí)施例細(xì)胞培養(yǎng)。人細(xì)胞系MDA-MB-453、ZR 75-1、K562和SKBr3獲自ATCC。個(gè)體供應(yīng)來源見最后的表中。MDA-MB-453、K562和ZR 75-1培養(yǎng)于含10％胎牛血清(Sigma，Taufkirchen)的RPMT(Gibco，Eggenstein)中。SKBR3培養(yǎng)于含10％胎牛血清的McCoy’s 5a(Gibco，Eggenstein)中。所有的細(xì)胞培養(yǎng)液均含青霉素／鏈霉素(Sigma，Taufkirchen)。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)于水蒸汽飽和的空氣和8％二氧化碳中。
FGFR-4388Arg／wt的克隆。為了從K562和MDA-MB-453細(xì)胞中制備RNA，用異硫氰酸胍溶解3X107個(gè)細(xì)胞并通過氯化銫梯度超速離心純化。按制造商說明書用逆轉(zhuǎn)錄酶(Boehringer，Mannheim)完成cDNA的合成，每個(gè)反應(yīng)加10pmol“隨機(jī)寡核苷酸”。將0．5ul用于后來的PCR反應(yīng)。
用PCR反應(yīng)擴(kuò)增FGFR-4388Arg和FGFR-4wt。所用引物如下有義鏈-GCTCAGAGGGCGG GCGGGGGTGCCGGCCG；反義鏈-CCGCTCGAGTGCCTGCACAGCCTTGAGCCTTGC。按制造商說明書使用如下PCR條件1．5U／25ul Expand-聚合酶(Boehringer，Mannheim)和反應(yīng)緩沖液200uM dNTP；0．01％v／v TritonX100；10％v／v DMSO及有義和反義引物各0．2pmol。進(jìn)行如下反應(yīng)步驟35個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘，64℃1分鐘，72℃2．5分鐘。MDA-MB-453 cDNA用于FGFR-4388Arg的克隆，而K562 cDNA用于FGFR-4wt的克隆。將PCR產(chǎn)物克隆入pcDNA3載體(Invitrogen)。為了進(jìn)一步的試驗(yàn)，具G388R的FGFR-4和野生型FGFR-4都可用此方法獲得。
FGFR-4跨膜結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增。所用引物如下有義鏈-GACCGCAGCAGCGCCCGAGGCCAG；反義鏈-AGAGGGAAGAGGGAGAGCTTCTG。按制造商說明書使用如下PCR條件1．5U／25μl Taq-聚合酶(Boehringer，Mannheim)和反應(yīng)緩沖液200μM dNTP；有義和反義引物各0．2pmol，來自腫瘤活組織標(biāo)本和細(xì)胞系的0．5μlcDNA或基因組DNA；進(jìn)行如下反應(yīng)步驟35個(gè)循環(huán)，94℃45秒，72℃45秒。
限制性酶消化分析。如上擴(kuò)增來自基因組或cDNA的FGFR-4跨膜結(jié)構(gòu)域。為通過限制酶消化檢測活組織標(biāo)本和細(xì)胞系是否有G1217A突變，PCR產(chǎn)物用5U／25μl BstN1(NEB，Schwalbach／Taunus)在60℃保溫1小時(shí)。用20％聚丙烯酰胺凝膠分離限制性酶消化的DNA片段并EB染色。野生型受體的分析產(chǎn)生109、37和22bp大小的片段各一條(第4泳道)。另一方面，作為突變G1217A的結(jié)果，形成了另一BstN1的限制性切割位點(diǎn)。突變受體還顯示80和29bp大小的片段，而109bp大小的片段則消失了(泳道1純合基因；泳道2和3雜合基因)(見圖2)。
用限制性消化進(jìn)行基因組DNA的基因型分析。
用標(biāo)準(zhǔn)方法(分子生物學(xué)通用流程，John Wiley和Sons，Inc_1995)從原發(fā)腫瘤的組織樣品中分離基因組DNA。為了能對基因組DNA進(jìn)行基因型分析，在PCR反應(yīng)中用以下引物擴(kuò)增FGFR-4基因中的跨膜區(qū)5’-GACCGCAGCAGCGCCCGAGGCCAG-3’(bp 1129-1142)，和5’-AGAGGGAAGAGGGAGAGCTTCTG-3’(bp 1275-1297)。對于PCR反應(yīng)，使用了Ready-to-go PCR Beats(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。PCR循環(huán)如下95℃3分鐘，94℃45秒，72℃45秒和72℃5分鐘。總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用5U／25μl BstN1(NEB，Schwalbach／Taunus)在60℃保溫1小時(shí)。用20％聚丙烯酰胺凝膠分離限制性酶消化的DNA片段并EB染色。388Arg等位基因有80和29bp大小的兩條特征性帶，388Gly等位基因只顯示109bp大小的一條片段。各基因型分析均重復(fù)3次。
PCR產(chǎn)物的DNA測序。為了對FGFR-4跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列分析，將PCR產(chǎn)物克隆入Bluescript載體。為此，如上所述進(jìn)行PCR反應(yīng)。所用引物如下有義鏈-GGGAATTCGACCGCAGCAGCGCCCGAGG；反義鏈-GCTCTAGAAGAGGGAAGAGGGAGAG。FGFR-4388Arg／wt克隆的PCR產(chǎn)物可在載體pcDNA3中直接測序。用鏈終止法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的DNA測序。在T／-引物與質(zhì)粒DNA退火后，用T／-DNA聚合酶(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)進(jìn)行測序反應(yīng)。然后將測序反應(yīng)產(chǎn)物分離于5％變性聚丙烯酰胺凝膠(7．5M尿素；1xTBE)上并在晾干后曝光于X-射線膠片上(見圖3)。由此得到野生型和突變體的DNA序列。
免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析。將2．2x106個(gè)細(xì)胞鋪于10cm的平皿上并保溫過夜。然后用無胎牛血清的培養(yǎng)液置換原培養(yǎng)液并再保溫24小時(shí)。為了進(jìn)行刺激，將細(xì)胞與50ng aFGF／ml保溫10分鐘，用冷PBS洗兩次并冰置。細(xì)胞在4℃與300μl冷裂解緩沖液(1％w／w NP-40，1．25％w／v脫氧膽酸鈉，0．1％w／v SDS，0．15M NaCl，0．01M磷酸鈉，pH7．2，2mM EDTA，10mM氟化鈉，1mM PMSF，20μg／ml抑酶肽，1mM原釩酸鹽，10mM焦磷酸鈉)一起保溫15分鐘，4℃離心(13000RPM)澄清細(xì)胞裂解物。為了測定蛋白質(zhì)的量，按制造商說明書使用Micro-BCA Protein Assay(Pierce)進(jìn)行。為了進(jìn)行免疫沉淀，將細(xì)胞裂解產(chǎn)物調(diào)整成相等的蛋白質(zhì)含量，然后與0．5μg抗FGFR-4(Santa Cruz)和蛋白A-Sepharose(PharmaciaFreiburg)在旋轉(zhuǎn)搖床上4℃保溫18個(gè)小時(shí)。用冷HNTG(20mM HEPESpH7．5，150mM NaCl，0．1％Triton X100，10％甘油，10mM焦磷酸鈉)洗免疫復(fù)合物4次。為了樣品制備，用50μl 3xSDS-Laemmli緩沖液處理免疫復(fù)合物并99℃保溫5分鐘。沉淀蛋白質(zhì)于7．5％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離(見圖1)。
為進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。在室溫與TBS-T／0．25％明膠(10mM Tris／HCl pH8．0，0．15M NaCl，0．05％ Tween20)保溫2小時(shí)以封閉膜上的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。與初級抗體4℃保溫于晃動(dòng)搖瓶中6小時(shí)。然后用TBS-T／0．25％明膠洗4次去除非特異結(jié)合抗體。二級抗體的結(jié)合在室溫進(jìn)行1小時(shí)。通過進(jìn)一步的漂洗步驟去除非特異結(jié)合的二級抗體。用ECLTM試劑盒(Amersham，Braunschweig)按制造商說明書使免疫復(fù)合物顯現(xiàn)。
統(tǒng)計(jì)方法。在統(tǒng)計(jì)軟件MedCalc(MedCalc Software，Belgium)和EpiInfo 6．04b(CDC Atlanta，Georgia)的幫助下完成統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。為了確定不同病人組基因型與臨床數(shù)據(jù)之間的相互關(guān)系，計(jì)算優(yōu)勢率(oddsratio)、置信區(qū)間(CI)和統(tǒng)計(jì)顯著性(P值)。由于388Arg純合基因的病人數(shù)目較少，將其與388Arg雜合基因病人組合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。
腫瘤細(xì)胞系中FGFR-4的檢測。表1顯示了RTK表達(dá)與乳腺癌之間的相互關(guān)系。RTK的表達(dá)明顯地更經(jīng)常存在于乳腺癌來源細(xì)胞系中，而在正常乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞系中則無可檢測到的表達(dá)。
表1乳腺癌細(xì)胞中FGFR-4的檢測
圖解-無表達(dá)+表達(dá)++強(qiáng)表達(dá)+++很強(qiáng)表達(dá)++++極強(qiáng)表達(dá)從表2中可見，明顯地G388R突變還存在于其他癌類型細(xì)胞系中并與其相關(guān)。在健康上皮細(xì)胞系中檢測不到該突變。
表2多種其他腫瘤細(xì)胞系中的FGFR-4 G388R突變樣品 基因組DNAcDNA成膠質(zhì)細(xì)胞瘤U-138 -／--／-U-373 -／--／-U-172 -／--／-U-118 -／*-／*SF-763 -／--／-U-1240*／**／*T-98G (*)／- (*)／-U-937 -／--／-成神經(jīng)細(xì)胞瘤SK-N-SH-／*-／*SH-SY-SY -／*-／*子宮癌OAW-42 -／*-／*PA-1 -／--／-Caov-3 -／--／-鱗狀細(xì)胞癌Hlac-78 -／- -／-Hlac-79 -／--／-Scc-4 -／--／-Scc-10a -／--／-Scc-10b -／--／-Scc-17a -／--／-Scc-17b -／--／-Scc-22a*／**／*Scc-22b*／**／*HaCat -／--／-FaDu-／--／-正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100 -／--／-MCF-10A -／--／-圖解-／- 純合型未突變*／- 雜合型突變*／*純合型突變活組織檢查中FGFR-4突變G388R的檢測。表3在此顯示在來自StPetersburg的61個(gè)被研究女乳腺癌病人中，56％攜帶G388R突變，其中45％為雜合基因的而11％為純合基因的。在來自Munich的69個(gè)被研究女乳腺癌病人中，43％攜帶G388R突變，其中32％為雜合基因的而11％為純合基因的。在來自St Petersburg和Munich的女病人中該突變的總百分比比率是不同的。這表明G388R突變是種系突變。
表3活組織檢查中FGFR-4突變G388R的檢測乳腺腫瘤樣品
FGFR-4 G388R突變與FGFR-4表達(dá)之間的相互關(guān)系。從下表4可見，明顯地只有當(dāng)表達(dá)和／或加強(qiáng)的表達(dá)存在時(shí)G388R突變(基因組DNA和cDNA)才存在。在正常乳腺上皮細(xì)胞系和未見RTK表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中均檢測不到該突變。
細(xì)胞系MDA-MB453的RTK表達(dá)尤其顯著，其顯示為純合基因的G388R突變。
表4FGFR-4-G 388R突變和FGFR-4表達(dá)檢測間的相關(guān)性
圖解-無表達(dá)+表達(dá)++強(qiáng)表達(dá)+++很強(qiáng)表達(dá)++++極強(qiáng)表達(dá)-／-無突變*／-雜合型突變*／*純合型突變
FGFR-4突變G388R的存在與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)或無復(fù)發(fā)生存時(shí)間之間相互關(guān)系的研究。
表5顯示了參加有關(guān)在乳腺癌腫瘤發(fā)生中G388R突變之作用研究的所有病人的臨床參數(shù)。發(fā)現(xiàn)具G388R突變的病人的長期預(yù)后比無G388R突變病人更壞。
表5說明(見下文)Her2Her2受體的表達(dá)水平；0=無表達(dá)至3=過表達(dá)OPDAT手術(shù)日期M／R轉(zhuǎn)移形成／復(fù)發(fā)；0=無／1=有Vers死亡；0=否／1=是UBERRE無復(fù)發(fā)生存時(shí)間，以月計(jì)Grade腫瘤的分化級別；1=強(qiáng)分化／3=低分化Stage原發(fā)腫瘤的大小E-Rec雌激素受體的表達(dá)；0=無表達(dá)至12=最高表達(dá)GENFGFR-4的基因型；G=野生型等位基因；R=突變等位基因BEDAT最后觀察日期REZDAT復(fù)發(fā)診斷日期TODDAT死亡日期UBERLEB總生存時(shí)間Nod．淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)移；0=無／1=有Men終止活動(dòng)時(shí)期P-Rec孕酮受體的表達(dá)0=無表達(dá)至12=最高表達(dá)表5FGFR-4基因型和臨床病例數(shù)據(jù)
表5(續(xù))
表5(續(xù))
從圖4中可見，明顯地在第一階段治療時(shí)已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人中發(fā)現(xiàn)更大量的G388R突變。在具G388R突變的病人中，62．7％有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而無G388R突變的病人中只有38．2％顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因?yàn)榱馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移狀況是進(jìn)一步辨別腫瘤預(yù)后更壞或更好的重要預(yù)后標(biāo)志，所以從這些結(jié)果中可推斷在85個(gè)被研究病人中G388R突變導(dǎo)致更嚴(yán)重的腫瘤發(fā)展。
從圖5中可見，在被研究病人組中，具G388R突變病人比無G388R突變病人的無復(fù)發(fā)生存概率小得多。74．4％復(fù)發(fā)病人有388R基因型，只有25．6％具有388G基因型。這表明有G388R突變的病人復(fù)發(fā)更快，因此不能成功地治愈。
總之，可以認(rèn)為FGFR-4突變G388R導(dǎo)致淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移形成的危險(xiǎn)提高2．7倍(OR=2．7；CI1．02＜OR＜7．4)，而腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)增加了5．44倍(OR=5．44；CI1．93＜OR＜7．4)。具突變FGFR-4等位基因(G388R)病人看上去易于腫瘤復(fù)發(fā)，因此疾病預(yù)后更差。
材料丙烯酰胺Serva，Heidelberg瓊脂Difco，Detroit瓊脂糖 BRL，Eggenstein氨芐青霉素 Boehringer，Mannheim抑酶肽 Sigma，TaufkirchenN-N’-甲叉雙丙烯酰胺Roth，Karlsruhe氯化銫 BRL，Eggenstein脫氧核苷酸 Pharmacia，F(xiàn)reiburg溴化乙錠Sigma，Taufkirchen明膠Sigma，Taufkirchen異硫氰酸胍 Fluka，SwitzerlandHEPES Serva，Heidelberg氟化鈉 Sigma，TaufkirchenPMSFSigma，TaufkirchenSDS Roth，KarlsruheTris Riedel de Haen，SeelzeTrition X100 Serva，HeidelbergTween20 Sigma，Taufkirchen所有在此未列物質(zhì)均來自Sigma(Taufkirchen)、Serva(Heidelberg)、Riedel De Haen或Merck(Darmstadt)公司，且使用最高級別的純度。
設(shè)備DNA電泳儀 Workshop，MPI for Biochemistry，Martinsried蛋白質(zhì)電泳儀Atto，Japan冷凍離心機(jī)Biofuge 17S Heraeus，Hanau蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移儀Semidry blot apparatus，Workshop，MPI forBiochemistry，Martinsried超凈工作臺 Biogard，The Baker Company，USA細(xì)胞培養(yǎng)箱 Incubator B5060 EK／CO2，Heraeus，Hanau細(xì)胞計(jì)數(shù)器 Coulter Counter，Coulter Electronics，Glasgow．
文獻(xiàn)Basilico C和Moscatelli D生長因子和癌基因的FGF家族。癌癥研究進(jìn)展(Advanc．Cancer Res．)59，115-164(1992)Coulier F，De Lapeyriere O和Birnbaum DFGF家族的復(fù)雜性9個(gè)證據(jù)。Med．／Sci．9，1113-1115(1993)。
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細(xì)胞系 來源 編號U-138 ATTC HTB-16U-373 ATTC HTB-17U-172U-118 ATTC HTB-15SF-763 SUGENU-1240 SUGENT-98G SUGENU-937 ATCC CRL-1593SK-N-SH ATCC HTB-11SH-SY5Y F．J．KlinzOAW-42 DKFZPA-1ATCC CRL-1572Caov-3 ATCC HTB-75Hlac-78 Dr．WustrowHlac-79 Dr．WustrowScc-4 ATCC CRL-1624Scc10a Dr．WustrowScc10b Dr．WustrowScc22a Dr．WustrowScc22b Dr．WustrowScc17a Dr．WustrowScc17b Dr．WustrowFaDuDr．WustrowHaCatHBL100 ATCCHTB-124MCF10A ATCCCRL-10317SKBr-3 ATCCHTB-30BT-549 ATCCHTB-122MCF-7 ATCCHTB-22BT483 ATCCHTB-121T-47-D ATCCHTB-133ZR-75-1 ATCCCRL-1500MDA-MB-468 ATCCHTB-132MDA-MB-453 ATCCHTB-131MDA-MB-361 ATCCHTB-27MDA-MB-415 ATCCHTB-128MDA-MR-231 ATCCHTB-26K-562 ATCCCCL-243
序列表〈110〉Max-Planck Society for the promotion of Science e．V_Brerlin〈120〉利用抑制劑治療與RTK機(jī)能亢進(jìn)相關(guān)的紊亂，尤其是癌癥〈130〉P29374-03166〈140〉〈141〉〈160〉2〈170〉PatentIn Vers．2．0〈210〉1〈211〉25〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1Arg Tyr Thr Asp Ile Ile Leu Tyr Ala Ser Gly ser Leu Ala Leu Ala1 5 10 15Val Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Tyr20 25〈210〉2〈211〉25〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2Arg Tyr Thr Asp Ile Ile Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Ala Leu Ala1 5 10 15Val Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Tyr20 2權(quán)利要求
1．受體酪氨酸激酶(RTK)至少一種抑制劑用于治療和／或預(yù)防RTK機(jī)能亢進(jìn)誘發(fā)的紊亂，尤其是癌癥的用途。
2．按照權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述抑制劑是激酶失活受體。
3．按照權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述受體酪氨酸激酶的過表達(dá)和／或改變了的活性被降低和／或被抑制。
4．按照權(quán)利要求3的用途，其特征在于所述受體酪氨酸激酶的過表達(dá)和／或改變了的活性是由FGFR-4突變引起的。
5．按照權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述突變是一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。
6．按照權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述突變發(fā)生在FGFR-4的跨膜結(jié)構(gòu)域。
7．按照權(quán)利要求5或6的用途，其特征在于所述突變導(dǎo)致疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸。
8．按照權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的用途，其特征在于所述點(diǎn)突變發(fā)生在FGFR-4分子中第388位氨基酸處。
9．按照權(quán)利要求5-8中一或多項(xiàng)的用途，其特征在于所述第388位氨基酸處的點(diǎn)突變導(dǎo)致甘氨酸替換為精氨酸(G388R)。
10．按照上述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其特征在于所述突變是種系突變。
11．按照上述一或多項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其特征在于用于治療癌癥和／或由于過度增殖和／或入侵造成的疾病，特別是癌，這尤其是通過抑制轉(zhuǎn)移形成進(jìn)行的。
12．按照上述權(quán)利要求中一或多項(xiàng)的用途，其治療乳腺癌。
13．按照上述權(quán)利要求1-11中一或多項(xiàng)的用途，其治療鱗狀細(xì)胞癌。
14．按照上述權(quán)利要求1-11中一或多項(xiàng)的用途，其治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
15．按照上述權(quán)利要求1-11中一或多項(xiàng)的用途，其治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
16．按照上述權(quán)利要求1-11中一或多項(xiàng)的用途，其治療子宮癌。
17．按照上述權(quán)利要求1-16中一項(xiàng)的用途，其特征在于所述抑制劑抑制FGFR-4，優(yōu)選突變的FGFR-4。
18．一種突變的FGFR-4，其導(dǎo)致細(xì)胞中該受體過表達(dá)和／或活性改變。
19．按照權(quán)利要求18的突變FGFR-4，其特征在于所述野生型受體中的疏水性氨基酸被替換為突變受體中的親水性氨基酸。
20．按照權(quán)利要求18或19的突變FGFR-4，其特征在于所述突變是點(diǎn)突變，優(yōu)選該突變發(fā)生在跨膜結(jié)構(gòu)域。
21．按照權(quán)利要求18的突變FGFR-4，其特征在于所述點(diǎn)突變發(fā)生在第388位，優(yōu)選為精氨酸替換甘氨酸。
22．一種DNA分子，其中含有編碼按權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的突變FGFR-4的序列。
23．一種RNA分子，其中含有編碼按權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的突變FGFR-4的序列。
24．按照權(quán)利要求22或23之一的序列在疾病，尤其是癌癥診斷中的用途。
25．按照權(quán)利要求24的用途，其特征在于所述序列可特異檢測FGFR-4中第388位的點(diǎn)突變。
26．一種診斷方法，尤其是用于癌癥差別診斷的方法，其中包括對個(gè)體樣品中突變FGFR-4蛋白質(zhì)或其編碼核酸進(jìn)行檢測的步驟。
27．按照權(quán)利要求26的診斷方法，其特征在于將所述病人的核酸與DNA和／或RNA接觸，以便獲得指示突變FGFR-4是否存在的信號，和／或用PCR擴(kuò)增病人的核酸并隨后用識別序列被突變影響的限制酶切割，和／或?qū)⒉∪说牡鞍踪|(zhì)與特異于該突變蛋白質(zhì)的抗體接觸。
28．用于篩選癌癥和／或其他疾病的遺傳性易患病體質(zhì)情況的方法，包括對個(gè)體樣品中突變FGFR-4蛋白質(zhì)或其編碼核酸或擴(kuò)增的FGFR-4核酸進(jìn)行檢測的步驟。
29．一種藥物組合物，其中包含按權(quán)利要求1-17中一或多項(xiàng)的抑制劑。
30．用于鑒定酪氨酸激酶活性抑制劑的篩選方法，其中包括將按權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的受體與可能的抑制劑接觸，并測定在抑制劑存在和／或缺乏情況下的酪氨酸激酶活性。
31．一種突變FGFR-4，優(yōu)選按權(quán)利要求18-21之一的突變FGFR-4，其作為癌癥治療的靶目標(biāo)。
32．與按權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的突變FGFR-4蛋白質(zhì)可特異反應(yīng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用抑制劑治療和/或預(yù)防由于受體酪氨酸激酶活性增高而導(dǎo)致的疾病,尤其是癌癥。該應(yīng)用特別涉及抑制或減少受體酪氨酸激酶(RTK)的過表達(dá)和/或改變了的活性。受體酪氨酸激酶活性的這種變化可通過FGFR－4的突變激發(fā),該突變特別地是FGFR－4跨膜結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變,導(dǎo)致由親水性氨基酸替換疏水性氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及抗FGFR－4的抑制劑用于治療和/或預(yù)防癌癥的用途。本發(fā)明還涉及引起其在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)和/或活性改變的突變FGFR－4。最后,本發(fā)明涉及突變FGFR－4分子的DNA和RNA序列、含上述抑制劑的藥物組合物,以及診斷和篩選方法。
文檔編號G01N33/566GK1291096SQ99803223
公開日2001年4月11日 申請日期1999年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月22日
發(fā)明者A·尤爾里奇, J·班格, P·尼亞澤夫 申請人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)