專利名稱：改進的側流分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及側流分析，更具體地本發明涉及改進的側流分析，其中分析物結合劑偶聯于檢測劑和分析物非特異性試劑。
對流體樣品，尤其是體液樣品中的細胞和分析物進行定量分析，通常會為醫生和病人提供關鍵的診斷和治療信息。例如，利用了抗原-抗體反應高特異性的免疫測試方法，就提供了一種測量分析物的方法(Kennedy，D.M.和S.J.Challacombe(編)，酶聯免疫吸附測定和其他固相免疫測定理論和實踐(ELISAand Other Solid Phase ImmunoassaysTheoretical and Practical Aspects)，John Wiley and Sons，Chichester(1988)。該文獻與本文提及的其他文獻都被引用作為參考，就如同它們被完全復制那樣。這些分析方法也可用于其他應用方面，例如獸醫、食品測試或農業應用方面。
可提供樣品中分析物的定量測量值的免疫測定方法，早已使用只有在實驗室環境下才有的昂貴分析儀而且所用的程序復雜且步驟多。
免疫色譜分析，例如在下列文獻中所描述的免疫色譜分析是較簡單的，但是不能提供分析物的定量測量值英國2,204,398A；美國專利No.5,096,837、5,238,652和5,266,497；Birnbaum，S.等人，分析生物化學(AnalyticalBiochem.)，206168-171(1992)；Roberts，M.A.和R.A.Durst，分析化學(Analytical Chem.)67482-491(1995)；和Klimov，A.D.等人，臨床化學(Clinical Chem.)411360(1995)。相反，這些免疫色譜分析檢測是否有高于界定的測試截止水平(cutoff level)的分析物。無法進行定量測定限制了這些分析方法的用途。
Cathy等人在美國專利No.5,660,993中公開了一種一次性的診斷測試裝置及其用法。該裝置包括一個與至少一個主通道液體相通的加樣孔。在液體流動方向上，主通道包括一個與孵育區和廢物區液體相通的主試劑區。與主通道液體相通的是至少一個側向試劑通道。在液體流動方向上，側向試劑通道含有液體添加孔和側向試劑區，它們在主通道的孵育區上游某處與主通道液體相通。攪拌裝置可被包括在至少一個主的和側向的試劑區和/或孵育區。毛細閥可位于孵育區上游沿著主試劑通道和側試劑通道的不同位置，以便控制液體在裝置中的流動。這種裝置機械結構復雜，因此不適合重復而精確的用途。
Palace等人在國際出版號WO92/12428中公開了一種非濾紙的單步式側流分析的設計，它使用側流測試片來分析生物樣品中的分析物。在所公開的裝置中，采用了三個處于非濾紙式側流接觸的區域樣品接受區、標記區和捕獲區。含分析物的樣品被攜帶通過標記區，與具有可視分子的分析標記物反應，該分析標記物宜為顆粒并且這些顆粒偶聯于對分析物特異的結合劑或者偶聯于可與分析物競爭捕獲劑的競爭劑。樣品和某些可視分子一起繼續流動進入捕獲區，其中被分析物或競爭劑就被偶聯于或捕獲于可視分子。過量液體被吸入與捕獲區接觸的吸收區。可視分子在捕獲區顯現，就獲得了陽性結果。包含可視分子的對照標記物(較佳地可與分析標記物在顏色上區分開)也可被包括在標記區，并且在捕獲區單獨的對照區域被捕獲以證實液體流動是如預計的那樣。然而，對照標記物不能修正側流測試片之間的差異，從而導致測量值的不準確和不一致。對照劑流過捕獲區的對照區域這一證據，并不能證明分析的標記部分流過了捕獲區的分析物特異性區域。
Eisinger等人的美國專利No.4,943,522公開了一種進行特異性結合配對測定(例如免疫測定)的方法和裝置。一種允許非濾紙式側流的多孔膜被用作分析基質；結合配對的一員被固定在基質上劃定的指示區。樣品被加在遠離指示區的某處，并側流通過指示區；樣品中的任何分析物被固定化的特異性結合成員所結合，并被檢測出。然而，這種分析沒有任何對照，這會導致測試不準確和產生差錯。
Campbell等人的美國專利No.4,703,017公開了一種測試分析物的固相分析法，其中結合劑被負載在固相載體(例如硝酸纖維素)上，而示蹤物包括用有色顆粒標記物(如包含了染料的脂質體)標記的配體。該分析的靈敏度高，而且示蹤物在分析條件下可在載體上顯現出，因此示蹤物在測定時就被顯現出，而不需要測量儀器也不需要進一步處理。然而，因為無測量儀器，因此人的主觀因素被引入分析，導致不準確和產生差錯。
Campbell等人的美國專利No.4,743,560公開了一種測試分析物的固相分析法，其中結合劑被負載在固相載體(例如硝酸纖維素)上，而示蹤物包括用顆粒標記物(如脂質體)標記的配體，其中包括不直觀的可檢測標記物。然而，該分析方法沒有對照，因此會導致測試不準確和產生差錯。
Brooks的美國專利No.5,753,517公開了使用定量免疫測定來測量液體樣品中感興趣分析物的數量的方法，以及用于該測定方法的設備。該測定采用了“快速抗原測量平臺”(rapid antigen measurement platform，RAMP)設備。該設備包括一膜片，該膜片是用諸如硝酸纖維素和玻璃纖維之類的材料制成的，有足夠的孔隙度且能夠被含分析物的液體所潤濕，而且允許顆粒通過毛細作用移動。
所公開的膜片具有加樣點、接觸區和檢測區；接觸區位于加樣點和檢測區之間。包埋在接觸區的是許多顆粒，例如膠體金顆粒、有機分子、脂質體或有機聚合物乳膠顆粒。顆粒上涂有針對感興趣分析物的抗體。顆粒可用比色標記物、熒光標記物、發光標記物或其他合適標記物標記以便于檢測。檢測劑被固定在檢測區。檢測劑可以是針對感興趣分析物的抗體、或是感興趣的分析物本身。該裝置還可包括一個或多個下列特征位于加樣點之上并覆蓋住加樣點的加樣墊片；位于接觸區之上并覆蓋住接觸區的接觸墊片，接觸墊片中可包埋有涂著抗體的顆粒。如果有接觸墊片，則如公開的那樣存在一隔離墊片，并且該隔離墊片位于膜上且位于接觸區和接觸墊片之間。還公開了毛細墊片，它位于膜上且靠近接觸區，使得接觸區位于毛細墊片和接觸區之間；還公開了內部對照，它包括包埋在接觸區的內部對照顆粒、對照檢測劑和對照反應區。
該設備包括了內部對照，以便如公開地那樣補償各次測試之間在膜性能方面的差異。該內部對照包括內部對照顆粒、對照檢測劑和對照反應區。所公開的內部對照顆粒與涂有抗體的顆粒被一起包埋在接觸區。
這種“內部對照顆粒”與涂有抗體的顆粒相類似。如公開的那樣，它們涂有相同表面濃度的抗體，不同點在于內部對照顆粒上的抗體是針對對照檢測劑的，而該對照檢測劑不與針對分析物的抗體反應。所公開的“對照檢測劑”是一種不與待測量的分析物、位于涂有抗體的顆粒上的抗體反應，也不與檢測劑反應的試劑。對照檢測劑被涂在膜上的“對照反應區”。如所公開的那樣，對照反應區指膜片上固定有對照檢測劑的位點。然而，因為對照和分析物檢測劑在本質上是獨立的，因此對照移動通過測量基質并不能證明模擬了分析物檢測劑的移動。因此，通過測量各測量裝置中對照和分析物檢測劑的相對反應，會發現這些對照劑在所設計的補償測試間差異的方法中起的作用很差。
因此，需要有針對上述問題的側流免疫測定和使用這些測定的方法。
在一方面，本發明涉及一種進行側流分析(或側流測定)的方法，它包括讓感興趣的分析物與第一分析物結合劑接觸，其中第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑被偶聯于檢測劑。
在另一方面，本發明涉及一種在包括測試片的側流分析中提高測試平均陽性結果和測試平均陰性結果之間差異的方法，它包括在空間上重新排列測試片上一個或多個對照結合區相對于分析物結合區的位置。
在另一方面，本發明涉及一種在包括測試片的側流分析中降低側流分析的變差系數的方法，它包括在空間上重新排列測試片上一個或多個對照結合區相對于分析物結合區的位置。
在另一方面，本發明涉及一種在側流分析中提高側流分析重復性的方法，它包括定量位于第一對照區中的第一數量的檢測劑；定量位于第二對照區中的第二數量的檢測劑；將定量的第一和第二數量的檢測劑映射到相對標尺上，得到檢測劑的第一相對數量和第二相對數量；以及所進行的映射使得定量的第一數量檢測劑與第二數量檢測劑之比大于第一相對數量檢測劑與第二相對數量檢測劑之比。
在一個方面，本發明涉及一種包括測試片的側流分析，該測試片包括偶聯于檢測劑的分析物結合劑和分析物非特異性試劑。
圖1是本發明一種側流測試片的剖面圖。
如本文所用，術語“分析物”指待定量測定的分子或化合物。分析物的例子包括蛋白質，如激素或其他分泌蛋白質、酶和細胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細胞壁組份；或其他具有表位的化合物。感興趣的分析物宜具有免疫原性部分，這意味著可產生針對感興趣分析物該部分的抗體(如下所述)。
為了進行本發明的側流分析，可使用側流測試片。圖1描述了本發明的一種測試片例子。測試片100包括背襯片102、膜片104、隔離墊片106、偶聯物墊片108、測試區110、低對照區112、高對照區114、吸收墊片116和保護性蓋片118。測試片100具有遠端和近端。合適的測試片式樣的例子包括可從ScrippsLaboratories獲得的Scripps Laboratories牌側流免疫測定開發系統。
安裝在背襯片102中央的是膜片104。位于膜片104遠端且與膜片104有少許重疊的是偶聯物墊片108。在背襯片102上位于偶聯物墊片108遠端且與偶聯物墊片108幾乎完全重疊的是隔離墊片106。吸收墊片116也位于背襯片102上，吸收墊片116與膜片104接觸且位于膜片104的近端。保護性蓋片118復合于隔離墊片106、膜片104和吸收墊片116，且與背襯片102相對。
背襯片102可以由穩定的、無孔的材料制成，其強度應足以支承材料和粘于其的測試片。通常，背襯片102基本上不透水。在一個優選例中，背襯片102是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的。
測試片100還含有吸收墊片116。吸收墊片包含吸收材料，它可吸收因毛細管作用而輸送至膜片104末端的溶液。適用作為吸收墊片的材料例子包括纖維素和玻璃纖維。
保護性蓋片118復合于膜片104且與背襯片102相對。保護性蓋片118保護或覆蓋著膜片104、偶聯物墊片108、吸收墊片116和非必要的隔離墊片106。保護性蓋片118可用總體不透水的材料制成，而且較佳地是半透明或透明的。保護性蓋片可以是單層或多層。用作保護性蓋片118的優選材料包括透光材料，例如聚酰胺、聚酯、聚乙烯、丙烯酸類材料、玻璃或類似的材料。保護性蓋片118可以是透明或不透明的，這取決于所用的檢測方法。在一個優選例中，保護性蓋片是透光透明的聚酯。
膜片可以用具有如下特性的材料制成有足夠孔隙度從而允許在材料表面和內部發生流體的毛細管作用；允許涂有抗體或抗原的顆粒通過毛細管作用而移動(即宜不阻礙顆粒)；可被含分析物的液體所潤濕(例如，對于水性液體具有親水性，對于有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉變成親水表面)，可以改變膜的疏水性從而使膜具有親水性以便用于水性液體。膜材料的例子包括纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個優選例中，膜片是用硝酸纖維素制成的。
隔離墊片106可以由吸收材料制成，它能夠在將液體樣品加至隔離墊片106時，將液體樣品輸送至偶聯物墊片108。優選的材料包括(但并不限于)纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。
偶聯物墊片108與隔離墊片106相復合。偶聯物墊片108可以用吸收材料制成。代表性的材料包括纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。
偶聯物墊片含有一群結合于檢測劑的第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑。在另一例子中，這群試劑也可排他地或非排他地位于測試片上。分析物非特異性試劑被定義為對感興趣分析物不特異的試劑。第一分析物結合劑是可特異性地結合于感興趣分析物的試劑。在測試片上可以存在一群以上的結合于檢測劑的第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑。這些群體可以在組成、位置或其他特性方面相同或不同。
在一個優選例中，第一分析物結合劑是針對感興趣分析物的抗體。在另一優選例中，如果感興趣分析物是具有已知特異性的抗體，那么該群體可以含有該分析物(抗體)所針對的抗原。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。如本文所用，術語“抗體”也指足以結合于感興趣分析物的抗體片段。
或者，在優選例中還可使用各種可特異性地結合于感興趣分析物的分子，例如工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結合位點)的異源混合物的裂解物。P.Holliger等人，Trends in Biotechnology 137-9(1995)；S.M.Chamow等人，Trends in Biotechnology 1452-60(1996)。在另一優選例中，如果感興趣分析物是配體，那么可使用結合于該配體的受體，反之亦然。
第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑被偶聯于檢測劑。檢測劑包括各種不同物質，只要它便于檢測與檢測劑相結合的第一分析物結合劑。合適的檢測劑包括顆粒、發光標記物；比色標記物、熒光標記物；化學標記物；酶；放射性標記物；或射頻標記物；金屬膠體；和化學發光標記物。
在一優選例中，至少一種第一分析物結合劑和至少一種分析物非特異性試劑被偶聯于一種單一檢測劑。這種例子包括與至少一種第一分析物結合劑和至少一種分析物非特異性試劑偶聯的一群單一的檢測劑分子。如下所述，這種例子可降低非特異性結合并且能夠修正某些類型的測試差異。
如果使用不同種類的偶聯于檢測劑的第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑，那么可以使用不同的檢測劑。例如需要在同一測試片上分析兩種不同的有關分析物時，就會產生這種情況。使用兩種不同檢測劑有利于檢測兩種不同的有關分析物。例如，當檢測劑是熒光劑時，可以選擇檢測劑使其在不同的波長下發熒光。
在一個優選例中，可檢測標記物是顆粒。可用于本發明的顆粒例子包括(但并不限于)膠體金顆粒；膠體硫顆粒；膠體硒顆粒；膠體硫酸鋇顆粒；膠體硫酸鐵顆粒；金屬碘酸鹽顆粒；鹵化銀顆粒；二氧化硅顆粒；膠體(水合)金屬氧化物顆粒；膠體金屬硫化物顆粒；膠體硒化鉛顆粒；膠體硒化鎘顆粒；膠體金屬磷酸鹽顆粒；膠體金屬鐵酸鹽顆粒；涂有有機或無機層的上述任一種膠體顆粒；蛋白質或肽分子；脂質體；或有機聚合物乳膠顆粒，例如聚苯乙烯乳膠珠。優選的顆粒是膠體金顆粒。顆粒大小與膜片的孔隙度有關顆粒宜足夠小，從而能因液體的毛細管作用而在膜中被運輸。
膠體金顆粒可用任何常規方法制造，例如總結于G.Frens，1973，NaturePhysical Science，24120(1973)中的方法。其他方法描述于美國專利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。
顆粒大小的選擇會影響一些因素，例如總溶膠試劑及其偶聯物物的穩定性、偶聯物墊片108釋放顆粒的效率和充分性、反應的速度和充分性。此外，顆粒表面積會影響結合分子之間的空間位阻。
顆粒可以被標記，以協助檢測。標記物的例子包括(但并不限于)發光標記物；比色標記物如染料；熒光標記物；或化學標記物，如電活性劑(electroactiveagents)(如亞鐵氰化物)；酶；放射性標記物；或射頻標記物。
存在于測試片上的顆粒數目可以改變，這取決于顆粒的大小和組成、測試片和膜片的構成成分、以及分析測試的靈敏度水平。顆粒數目的范圍通常約為1×109-1×1013個顆粒，盡管也可使用低于1×109個顆粒。在一個優選例中，顆粒數目約為1×1011個顆粒。
還偶聯于檢測劑的是分析物非特異性試劑。可根據結合于除感興趣分析物之外的其他物質的穩定性，來選擇分析物非特異性試劑。例如，如果感興趣分析物是抗H.Pylori的抗體，那么分析物非特異性試劑可以是針對在抗H.Pylori抗體中沒有或罕有的抗原的抗體。這種結合對于除感興趣分析物之外的物質而言可以是特異性的，也可以是非特異性的。
在一個優選例中，分析物非特異性試劑可以是抗體，較佳地是兔IgG。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。如本文所用，術語“抗體”也指足以結合于感興趣分析物的抗體片段。或者，較佳地也可使用具有針對感興趣分析物的非特異性結合位點的諸如工程化蛋白之類的分子。在另一例子中，可使用受體，該受體會特異結合于除感興趣分析物之外的配體；反之亦然。此外，分析物非特異性試劑可以是抗原、其他有機分子或半抗原，它們被偶聯于對感興趣分析物非特異的蛋白之上。其他有關合適的分析物非特異性試劑的描述，可在美國專利No.5,096,837中找到，并且包括IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
在一個優選例中，分析物非特異性試劑包括對照結合劑。選擇對照結合劑，使其能特異地結合于除了特異結合于感興趣分析物的分子之外的其他分子。如下所述，在這種方式下，對照結合劑可結合于對照區。可用作對照結合劑的物質包括上述可用作第一分析物結合劑的物質。在一個優選例中，對照結合劑包括兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)抗體。對照結合劑的其他有利特性包括(但并不限于)整體穩定性、對有關分析物的非特異性、測試的重現性和可預測性、分子大小、與對照劑結合的親和力。
第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑與檢測劑的結合可以是共價的或非共價的(例如離子、氫鍵、范德瓦耳斯力等)。常規的偶合化學和技術可適用于本發明。此外，每一個第一分析物結合劑、檢測劑和分析物非特異性試劑都可相互偶聯，通過另一者而偶聯，或通過接頭、載體或間隔基團而偶聯。
例如，如果顆粒被用作檢測劑，那么第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑都可通過非特異吸附而結合于檢測劑。或者，可用常規偶聯技術將第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑共價連于顆粒。或者，可以使用非共價的結合系統，例如生物素-親和素或甚至對第一分析物結合劑特異的第二抗體，來將檢測劑(如熒光標記物)偶聯于第一分析物結合劑，而分析物非特異性試劑可直接偶聯于第一分析物結合劑。在另一例子中，還可用雙官能或多官能試劑將第一分析物結合劑、檢測劑和分析物非特異性試劑偶聯在一起。偶聯于檢測劑的第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑的數目可隨具體例子而變化。例如，可將兩份第一分析物結合劑偶聯于一份檢測劑和一份分析物非特異性試劑。或者，將兩種分析物非特異性試劑偶聯于一份檢測劑和一份第一分析物結合劑。這些配置的其他變化形式對于本領域技術人員而言毫無疑問是可行的，因此被包括在本發明范圍之內。
位于測試片100上的是多個檢測區120。每個檢測區的位置使得自動的或半自動的分析儀器，或者觀察者，能夠測定側流分析的確定結果。檢測區包括對測量分析的確定結果進行測量的測量區。檢測區可包括一個或多個分析物結合區和/或一個或多個對照結合區。
分析物結合區是膜片上含有第二(種)分析物結合劑的區域。一種或多種上述的適用于第一分析物結合劑的物質，可用作分析物結合區中的第二分析物結合劑。在一個優選例中，第一分析物結合劑是可被感興趣分析物(它是抗體)所識別的抗原。第二分析物結合劑也可是抗原或甚至對感興趣分析物(抗體)特異的第二種抗體。在另一優選例中，感興趣分析物是抗原。第二分析物結合劑是抗體，與第一分析物結合劑(當第一分析物結合劑也是抗體時)相比，第二分析物結合劑針對分析物上不同的表位。或者，當分析物具有多拷貝的相同表位時，第二分析物結合劑可以與第一分析物結合劑一樣針對相同的表位。
在某些例子中，讓一個或多個測量區也含有至少一個對照結合區，對照結合區包含至少一種對照劑。對照劑會特異地結合于對照結合劑，形成對照結合配對。
對照結合配對的一個特殊優點是，它們是內部對照--即與分析物測量結果作比較的對照位于各測試片上。因此，本發明的對照可用于修正測試片-測試片之間的差異。用基于例如對測試片的統計采樣而得出的外部對照來進行這種修正是不切實際的。此外，通過使用本發明的對照結合劑和對照劑，可以減小不同測試片在各個批次和各次使用之間的差異。此外，如下所述，還可減低非特異性結合的影響。在使用外部的非測試片對照時，所有這些修正都是難以實現的。
本發明的測量裝置可在測試片上具有一個以上的對照結合區。在這種情況下，對照結合區可被用于產生一標準曲線，而大量不同的分析物測量結果就可與該標準曲線進行比較。因此，具有一個以上內部對照，可使側流分析比常規側流分析具有更廣的動態量程。在優選例中，如下所述，將具有多個對照結合區的測試片與相對比例法結合使用，從而可以將檢測到的對照結合配對的數量映射到同一標尺，并根據該標尺得出分析物的數量。
在一個優選例中，本發明測試片有至少一個高對照結合區和至少一個低對照結合區。兩個區之間的差異通常為一種濃度。在高對照結合區中的對照劑濃度大于在低對照結合區中的對照劑濃度。因此，在高對照區中的對照結合配對的數量高于低對照區。在給定對照區中的對照結合配對物數量被映射到同一測量標尺上(并可根據該標尺得出分析物的數量)的例子中，可以通過高和低對照結合區中結合配對物的數值而繪制標準曲線。
在其他例子中，可存在2個以上對照結合區。這樣所產生的曲線能更好地反映測試中在檢測的分析物數量和被映射數量的測量值之間的非線性現象(如下所述)。盡管這些非線性現象原本會影響假定較為線性關系的測試，但是通過使用多個對照區可對其進行校正。
在另一實施例中，一個單個對照區可含有一種以上的對照劑。這在有一群組以上偶聯于檢測劑的分析物結合劑和分析物非特異性試劑的情況下是有用的。例如，當需要在同一測試片上分析兩種或多種感興趣的分析物時，可以制備兩群偶聯于檢測劑的分析物結合劑和分析物非特異性試劑。對于每群可使用不同的檢測劑，從而可以區分感興趣的兩種不同分析物的測量結果。在這種情況下，可能需要使用包含不同對照劑或對照結合配對的對照結合區。
適用于對照劑的物質包括上述適合作為對照結合劑的物質，不同點是對照劑會特異地結合于對照結合劑。例如，在一個優選例中，對照結合劑是兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)IgG，而對照劑是偶聯于BSA(牛血清白蛋白)的二硝基苯酚。
對照結合區可位于包含它的測量區的各種不同位置，而含有對照結合區的測量區可位于測試片上的各種不同位置。在不同的測試中，相對于分析物結合區和第一分析物結合劑、分析物非特異性試劑和檢測劑群體的貯藏所，來重新排列對照結合區的位置是有利的。例如，當含有該群體的貯藏所位于偶聯物墊片時，在某些例子中需要將分析物結合區位于偶聯物墊片和對照結合區之間。在另一些例子中，需要將對照結合區位于分析物結合區和偶聯物墊片之間。
此外，對照結合區和分析物結合區在測試片上相對液體流動方向的放置次序，會影響分析物結合劑結合于檢測區以及對照結合劑結合于對照檢測區的絕對量。這種效應會導致對照與分析物檢測測量值之比的增大或減小，尤其在測試非常強的陽性樣品時。這種改變對測試截止值有影響，如果使用截止值的話；對于截止處的測試精度有影響；或者對總體的測試動態量程和重復性有影響。
在操作中，先獲得含有感興趣分析物的液體樣品，再開始進行本發明的測量分析。樣品可包括具有如下特性的任何液體能濕潤膜片104，支持抗體/抗原反應(即不干擾抗體/抗原的相互作用)，并且其粘度足以讓樣品移動通過測試片。在一個優選例中，樣品是水溶液(例如體液)。
在本發明測試法的第一個例子中，隔離墊片106與含感興趣分析物的液體樣品接觸。在隔離墊片106與含感興趣分析物的液體樣品接觸之后，測試片100被維持在允許液體通過毛細管作用將感興趣分析物輸送至偶聯物墊片108的條件下。
當感興趣分析物被輸送至偶聯物墊片108時，存在于液體中的感興趣分析物就與偶聯物墊片108中所含的、偶聯于檢測劑上的第一分析物結合劑接觸。此時，還發生了液體中所含物質與偶聯于檢測劑的分析物非特異性試劑之間的接觸。因為這些接觸，同時導致了特異性結合和非特異性結合，從而形成各種復合物。優選地，所有或幾乎所有的特異性結合發生在感興趣分析物和第一分析物結合劑之間。
液體樣品的液體毛細管作用，使得結合或未結合的第一分析物結合劑(它偶聯于檢測劑和分析物非特異性試劑)移動，側向地移動至膜片104。此外，含有非特異結合的檢測劑的復合物會形成并增大，尤其是在樣品中存在與其他組份發生非特異結合的各種物質時。毛細管作用也會移動這些復合物，即使它們非常大。
在移動中，保護性蓋片118可減少了液體通過蒸發而導致的液體損失以及所導致的蒸發性冷卻，這提高了一致性和重復性，盡管這對于本發明的實施并不是必需的。保留合適的液體體積，對于液體在測試片100上的充分流動是至關重要的。防止蒸發性冷卻對于測試反應的速度和充分性是有用的。此外，保護性蓋片118起到使傳染性物質被保留在測試片100的作用。
第一分析物結合劑和其他復合物的移動，會在達到檢測區中的測量區時停止，如果測量區包含對感興趣分析物或對照結合劑特異的第二分析物結合劑，那么第一分析物結合劑和/或對照結合劑，以及任何直接或間接與它們復合的物質，會被固定在測量區。
一旦第一分析物結合劑和/或對照結合劑，以及任何直接或間接與它們復合的物質，被固定在測量區，那么就可用檢測劑來檢測它們的存在。停滯于測量區的檢測劑數量可用常規技術加以定量。例如，光學方法，如測量光散射、單反射、光度計或光電倍增管；放射性(用蓋革計數器等進行測量)；導電性或電介質(電容)；電化學法檢測所釋放的電活性物質，如銦、鉍、鎵、碲離子[如用Hayes等人(Analytical Chem.661860-1865(1994)所述的方法]，或亞鐵氰化物[如用Roberts和Durst(Analytical Chem.67482-491(1995)所提出的方法。其中通過在檢測區滴加洗滌劑，使包裹在脂質體中的亞鐵氰化物被釋放出，然后用電化學法檢測釋放的亞鐵氰化物]。其他常規方法只要合適，也可使用。
一旦檢測劑數量被定量，那么這些數量就可被映射到另一測量標尺上。例如，盡管本發明測試的結果是以(光)反射密度(density of reflectance，Dr)形式測量的，但是以其他單位來表示測量結果可能更有意義，例如用RI(相對于對照區的相對強度)。結果還可表示為測量體積中存在的分析物拷貝數。將檢測的分析物數量映射到其他測量標尺上，是一種報告本發明測試結果的優選例子。
例如，測試結果可被映射到相對標尺上。對于內部對照，使用相對標尺(例如相對強度(RI))，可以將反射密度(Dr)值轉化為RI值。在一個優選例中，低對照的RI值被定為1而高對照的RI值被定為3，盡管這些對照的Dr絕對值之比并不如此。在一個優選例中，Dr絕對值之比至少約為5∶1，而RI之比約為3∶1。
通過這樣做法，在各測試片中影響測量Dr絕對值的變化因素，會導致標準曲線在Y軸上下波動，但是對于沿X軸繪制的RI值的影響卻較小。這會全面地減小報告數據的可變幅度，即會表現為“負增益”。
例如，如果在分析物的測量數量和分析物的報告數量之間存在負增益，那么在分析物測量數量上的大變化會轉化為分析物報告數量上的較小變化。盡管分析物測量數量的內在差異沒有改變，但這種方法在某些情況下是有用的。負增益效應減小了某些測試差異度，并且與簡單地報告Dr測量值相比，可用于提高測試報告結果的重復性。
除了在連續標尺上報告測試結果(直接地報告所檢測分析物的數量，或者將檢測的分析物數量映射到標尺再間接地報告測量標度)之外，本發明測試方法還可用于“截止”式分析。如果檢測劑在分析物結合區被檢測，那么可將測得的檢測劑數量與截止值相比較。截止值是高于該數值時測試就被認為陽性的數值；即，感興趣分析物在液體樣品中的存在達到了某種統計置信度。低于截止值時，測試通常被認為非陽性--或者感興趣分析物并不存在，或者本發明側流分析不能檢測到它的存在。盡管可根據直接測量值(如測得的分析物數量)來建立截止關系，但是如果數據以間接或相對標度來表示那將更有意義。
陰性值和陽性值之間的區別越大，截止式側流分析越有利。陰性值是當有關分析物在統計意義上不存在時在連續標尺上的報告值。與之相反，陽性值是當有關分析物在統計意義上存在時在連續標尺上的報告值。當這些數值收斂時，能夠在統計上區分陽性和陰性的可能性就下降。
在截止處的準確度上升的截止式側流也是有利的。當在選定的截止處的變異度較小時，陽性被準確地定為陽性以及陰性被準確地定為陰性的可能性就增加。
測試結果可以被變換成上述的“相對”標度或“絕對”標度。絕對標度是以實際物理單位測量的，例如分析物的拷貝數/每毫升液體。用絕對標度表示的測量值，在測試某些疾病或病癥是有優選的，例如測試癌癥指標時。在這些優選例中，結果可用例如ng/ml之類的單位表示。因此，對照區具有指定濃度值的對照劑。作為相對測量概念的延伸，可以測量一系列已知分析物濃度的標準物的反射強度(density of reflectance，DR)值，并如上所述計算相對于對照的強度(相對強度值)。然后，可將RI值對分析物濃度進行作圖，以建立標準曲線，在該曲線中各RI值對應于有關分析物的某個濃度值。然后，樣品的RI可在這一數值對應的標準曲線上解讀，得出用所需單位表示的結果。
本發明的偶聯于檢測劑的單群分析物結合劑和分析物非特異性試劑，提供了優于雙群式(two population)測定的優點。一種雙群式測定包括一群偶聯于檢測劑的分析物結合劑和另一群偶聯于檢測劑的分析物非特異性試劑。如下面實施例所示，可根據本發明進行單群式測定，它優于類似的雙群式測定。這些優點包括測試方法可使陰性和陽性樣品組的測量值分得更開，并且截止準確度也更高。
許多環境因素會影響側流分析的絕對反應性，其中包括(但并不限于)制造方面的變數、操作者所引入的變數、環境所引入的變數和樣品效應。使用常規的側流分析時，任何這些因素會抑制或可能提高一個測試片相對另一測試片的反應性，從而導致假陰性或假陽性結果。對于這些或其他變數沒有對照，會導致很不準確、無重復性、缺乏敏感度和缺乏測試特異性。
側流分析還會受到多種干擾，它們會影響分析物結合劑或分析物非特異性試劑與對照結合區或分析物結合區之間結合的絕對量。影響因素包括(1)從偶聯物墊片上釋放分析物結合劑或對照結合劑方面的差異，(2)裝置和裝置之間在分析物結合群與測試片的非特異結合方面的差異，(3)在測試過程中，因測試片或膜片材料的孔徑或分析物結合劑的非特異聚集而導致的分析物結合群通過或沿測試片移動方面的差異。因此，由這些或其他因素而導致的結合絕對測量值的差異，會在常規側流分析中高得無法接受。
通過實施本發明，可以降低這些差異。使用單群偶聯于對照結合劑和檢測劑的分析物結合劑，可提供了優于常規測定(其中具有一群含對照結合劑的群體和另一群獨立的含分析物結合劑的群體)的多種優點。第一，與常規雙群式分析相比，已暴露于分析物非特異性試劑的側流分析基質的任何部分，也更可能暴露于分析物結合劑。第二，與常規雙群式分析相比，任何阻礙或防止分析物非特異性試劑沿著或通過側流基質運動的機制，也更可能阻礙或防止分析物結合劑的運動。第三，可以選擇分析物非特異性試劑以減少分析物結合劑的非特異結合量。
此外，還可通過修飾分析物檢測基質的疏水性/親水性來降低非特異性結合。分析物檢測基質顆粒的聚集“自締合”現象(這會阻礙基質在測試片上的運動)，也可通過選擇性質合適的分析物非特異性試劑而加以減少。最終的好處在于，因為只需制備更少的試劑，所以可降低制造成本。
如本文所述，在側流分析的實踐中多個對照區可提供許多潛在好處。額外的對照區可用于擴展分析標準曲線的動態量程，而不論曲線是線性還是非線性的。多個對照區還可用于確定在給定測試中是否存在前帶或高劑量彎曲效應(hookeffect)。如果存在這種效應，那么可建議用戶稀釋樣品以便準確地測定有關分析物的濃度。
本發明的側流分析可用于各種不同用途。例如，該分析可用于分析人類疾病，例如傳染性疾病、或任何其他涉及可識別表位的人類疾病(如癌癥、自身免疫疾病、心血管病癥和病理)。該分析還可用于獸醫、食品測試、農業和精細化學應用。本發明的側流分析可用各種不同方法進行，包括使用側流分析測試設備，例如在＿＿＿日提交的申請號為No.＿＿＿(案卷號No.19669-702)，名稱為“側流分析方法及設備”的未審定專利申請中所述的設備，該文獻在此引用作為參考。在一個優選例中，側流分析測試設備包括可從BlackHawk BioSystems(San Ramon，CA)得到的ReLIATM測試設備。
對于本領域的技術人員而言，很明顯可以在不背離本發明精神和范圍的情況下，對本發明的裝置和方法作各種改動和修改。因此，本發明覆蓋了本發明的這些改動形式，只要它們在所附權利要求或等價形式的范圍內。此外，下列實施例是為了闡明要求保護的本發明，而不是用于限制要求保護的本發明的范圍。
實施例實施例1如下制備Helicobacter pylori(幽門螺旋菌)單群偶聯物用100mM碳酸鉀將600毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調至pH9.5。將溶液置于攪拌馬達上的聚丙烯燒杯中。然后制備兔抗-DNP和Helicobacter pylori抽提物的混合物，每種試劑的含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將混合物(12毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質與膠體金的吸附進行10分鐘。時間結束時，加入12毫升0.2微米過濾處理過的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機的GSA離心頭中離心30分鐘。時間結束時，吸去上清液，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH9.0)(簡稱為“硼酸鹽/PEG”)，將膠體金偶聯物稀釋至約600毫升，并再次如上進行離心。在離心結束時，上清液被吸去，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
再用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯物稀釋至約600毫升，然后如上進行最后一次離心。在離心結束時，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中，然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約15毫升。接著，偶聯物溶液經0.2微米過濾處理，并貯藏于4℃。
產量是15毫升原料，在520納米處的光密度為26.64。
實施例2如下制備HIV單群偶聯物用100mM碳酸鉀將300毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達上的聚丙烯燒杯中。然后制備兔抗-DNP和HIV包膜抗原env-131-辣根過氧化物酶偶聯物的混合物，每種試劑的含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將混合物(4.5毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質與膠體金的吸附進行10分鐘。時間結束時，加入6毫升0.2微米過濾處理過的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機的GSA離心頭中離心60分鐘。時間結束時，吸去上清液，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯物稀釋至約300毫升，并再次如上進行離心。在離心結束時，上清液被吸去，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
再次用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯物稀釋至約300毫升，并如上進行最后一次離心。在離心結束時，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約10毫升。接著，偶聯物溶液經0.2微米過濾處理，并貯藏于4℃。
產量是9.5毫升原料，在520納米處的光密度為26.74。
實施例3如下制備對照偶聯物用100mM碳酸鉀將1200毫升41nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達上的聚丙烯燒杯中。然后制備兔抗-DNP的溶液，試劑的含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將溶液(12毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質與膠體金的吸附進行10分鐘。時間結束時，加入24毫升0.2微米過濾處理過的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機的GSA離心頭中離心60分鐘。時間結束時，吸去上清液，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯物稀釋至約1200毫升，并再次如上進行離心。在離心結束時，上清液被吸去，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
再次用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯物稀釋至約1200毫升，并如上進行最后一次離心。在離心結束時，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約42毫升。接著，偶聯物溶液經0.2微米過濾處理，并貯藏于4℃。
產量是42毫升原料，在520納米處的光密度為11.76。
實施例4如下制備Helicobacter pylori偶聯物用100mM碳酸鉀將140毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達上的聚丙烯燒杯中。然后制備Helicobacter pylori抽提物(含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍)和非特異性兔IgG(含量為完全封阻氯化鈉誘導的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍)的溶液(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將溶液(2.8毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質與膠體金的吸附進行10分鐘。時間結束時，加入2.8毫升0.2微米過濾處理過的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機的GSA離心頭中離心30分鐘。時間結束時，吸去上清液，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯物稀釋至約140毫升，并再次如上進行離心。在離心結束時，上清液被吸去，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
再次用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯物稀釋至約140毫升，并如上進行最后一次離心。在離心結束時，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約5毫升。接著，偶聯物溶液經0.2微米過濾處理，并貯藏于4℃。
產量是4.5毫升原料，在520納米處的光密度為28.4。
實施例5如下制備HIV檢測偶聯物用100mM碳酸鉀將400毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達上的聚丙烯燒杯中。然后制備HIV包膜抗原env-131-辣根過氧化物酶偶聯物(含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍)和非特異性兔IgG(含量為完全封阻氯化鈉誘導的膠體金聚集反應而所需含量的兩倍)的溶液(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將溶液(4.26毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質與膠體金的吸附進行10分鐘。時間結束時，加入8毫升0.2微米過濾處理過的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機的GSA離心頭中離心60分鐘。時間結束時，吸去上清液，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯物稀釋至約400毫升，并再次如上進行離心。在離心結束時，上清液被吸去，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。
再次用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯物稀釋至約400毫升，并如上進行最后一次離心。在離心結束時，通過回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約15毫升。接著，偶聯物溶液經0.2微米過濾處理，并貯藏于4℃。
產量是12毫升原料，在520納米處的光密度為26.66。
實施例6根據如下程序制備測試片。對微孔STHF背襯硝酸纖維素片(2.5厘米×20厘米)進行涂覆，即用Bio Dot XYZ3000分配平臺并且生物噴口(Biojet)的工作頻率為120Hz的情況下，以20.83nl/滴和0.5μl/cm將一個抗原條帶和兩個對照條帶按縱向涂于硝酸纖維素上。對照抗原是位于含0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的二硝基苯酚化的牛血清白蛋白(DNP-BSA)。對于各測試，高對照可合適地以150-500微克/毫升的范圍進行涂覆，而低對照可合適地以15-100微克/毫升的范圍進行涂覆。對于各測試，抗原可在含洗滌劑的磷酸鹽緩沖溶液中以0.5-4毫克/毫升的范圍進行涂覆。可將還原劑(如DTT和/或乙二胺四乙酸(EDTA))加至抗原溶液中，如果存在活性巰基的話。在實施例23中所用的測試片，HIV-env-131是以2毫克/毫升PBS(含2mM EDTA，10mM DTT，0.2％十二烷基磺酸鈉(SDS))的濃度進行涂覆，高對照涂覆濃度是300微克/毫升，而低對照涂覆濃度是25微克/毫升。
然后，片材在強風溫箱中于37℃干燥1小時，在含10mg/ml BSA、1％(w/v)PEG8000、3％(w/v)甘露醇、0.3％(w/v)明膠、0.01％(w/v)疊氮化鈉和0.05％(w/v)十二烷基硫酸鈉的PBS溶液中封閉15分鐘。接著在強風溫箱中于37℃再干燥1小時。涂覆的片材以干燥形式在室溫下貯藏于箔袋中。
Gelman 8980玻璃纖維墊片通過如下方式進行預封閉將其浸入PBS溶液(含10mg/ml BSA、2mg/ml兔IgG、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)，然后在強風溫箱中干燥1.5小時。預封閉的偶聯物墊片用根據實施例2制備的HIV OMNITM偶聯物，或根據實施例1制備的Helicobacer pylori OMNITM偶聯物進行涂覆，它們是通過將等體積的偶聯物原液(OD 520約26)與PBS(含20mg/ml BSA、4mg/ml兔IgG、2％(w/v)Triton X-100、5％(w/v)蔗糖和0.6％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)混合而成。然后加入1/40體積的20×PBS，溶液經0.2微米過濾處理，然后在室溫和27英寸汞柱的真空下脫氣1小時。用Bio Dot XYZ3000分配平臺并且單生物噴口的工作頻率為120Hz的情況下，以104.17nl/滴和2.5μl/cm的速度，將偶聯物的混合物按縱向涂于預封閉過的偶聯物墊片上。偶聯物的涂覆圖案是每厘米4線，并且在每個3厘米×10厘米的墊片上涂覆3個圖案。涂覆后的墊片在2托和室溫下真空干燥1小時，然后切割成1厘米×10厘米的小塊，每塊含一個4線的圖案。
測試片是這樣制備的按圖1所示的結構，將一片2.5厘米×20厘米的背襯硝酸纖維素片、一片1.8厘米×20厘米Gelman 133型吸收墊片、兩片1厘米×10厘米的涂有偶聯物的墊片(并排放置)和一片2厘米×20厘米GelmanCytosep 1662片，固定在一片涂有粘合劑且厚0.010’’的6厘米×20厘米乙烯背襯片上(G＆L Precision Die Cutting)。用背面涂有粘合劑的透明聚酯膜(G&LPrecision Die Cutting)覆蓋測試片，從Cytosep片上方2毫米覆蓋至吸收墊片上方。用Bio Dot Cutter 3000TM切片機，從組裝好的片材上切下0.5厘米寬的測試片。
實施例7用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒(cassette)置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori(幽門螺旋菌)的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
>實施例8用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例9用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例10用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是分析物結合區(即抗原區)最接近偶聯物墊片，低對照區位于分析物結合區(即抗原區)和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例11用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升BBI PMH201混合效價組樣品(n＝7)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例12用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升BBI PMH201混合效價組樣品(n＝7)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例13用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升BBI PMH201混合效價組樣品(n＝7)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例14用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是分析物結合區(即抗原區)最接近偶聯物墊片，低對照區位于分析物結合區(即抗原區)和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測h.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升BBI PMH201混合效價組樣品(n＝7)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例15用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升隨機血清樣品(n＝10)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例16用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升隨機血清樣品(n＝10)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例17用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升隨機血清樣品(n＝10)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例18用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是分析物結合區(即抗原區)最接近偶聯物墊片，低對照區位于分析物結合區(即抗原區)和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升隨機血清樣品(n＝10)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下<
實施例19用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升樣品(如下所述)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例20用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升樣品(如下所述)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例21用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是低對照區最接近偶聯物墊片，分析物結合區(即抗原區)位于低對照區和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合0.968毫升實施例3所述的偶聯物、0.681毫升實施例4所述的偶聯物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升BBI PMH混合效價組樣品(n＝4)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
實施例22用于該實施例的測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區在測試片上的次序是分析物結合區(即抗原區)最接近偶聯物墊片，低對照區位于分析物結合區(即抗原區)和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測H.pylori的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升樣品(如下所述)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PE6(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數。
結果如下
上面實施例的數據可總結如下。在實施例7-22中測試了4種分析格式。這4種分析格式格式1獨立的含對照結合劑的顆粒偶聯物群以及含分析物結合劑的顆粒偶聯物群，且分析物結合區位于高對照區和低對照區之間；格式2獨立的含對照結合劑的顆粒偶聯物群以及含分析物結合劑的顆粒偶聯物群，且高對照區和低對照區位于分析物結合區和偶聯物墊片之后；格式3含對照結合劑和分析物結合劑的顆粒的OMNITM偶聯物群，且分析物結合區位于高對照區和低對照區之間；格式4含對照結合劑和分析物結合劑的顆粒的OMNITM偶聯物群，且高對照區和低對照區位于分析物結合區和偶聯物墊片之后；按格式對結果進行分析，列于表1-5。
表1以HC/LC的CV％表示<
表2對陰性樣本的結果，以Dr平均值(分析物結合區)/低對照區的Dr平均值表示
表3對陽性樣本的結果，以Dr平均值(分析物結合區)/低對照區的Dr平均值表示
表4總體擴展，以表3平均值/表2平均值表示
表5在截止處的分析精確性(S/CO 0.9-1.2)
從這些表格中可看出，獨立的各顆粒群和OMNITM偶聯物群的不同配置，以及對照結合區和分析物結合區的不同配置，會產生不同的結果。對于測試H.pylori，格式2的HC/LC之比的變差系數最低而且對H.pylori陰性樣品的讀數最低。相反，格式3產生的對H.pylori陽性樣品的讀數最高。最后，格式4在指定的截止值處的精確性最好，而且H.pylori陰性樣品和H.pylori陽性樣品的測量值的擴展也最大。
因此，對于截止式測試H.pylori，格式4似乎是最佳選擇。
實施例23用于該實施例的格式2和格式4測試片，在高對照區涂有300微克/毫升偶聯于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對照區涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結合區(即抗原區)涂有2毫克/毫升的HIV包膜蛋白env-131溶液。這些條帶區在測試片上的次序是分析物結合區(即抗原區)最接近偶聯物墊片，低對照區位于分析物結合區(即抗原區)和高對照區之間，而高對照區離偶聯物墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例6所述，對硝酸纖維素片進行涂覆并制備測試片。
對于格式2測試片，偶聯物墊片在0.1M磷酸鈉(pH 7.4，含0.5M氯化鈉、1％(w/v)酪蛋白、1mM EDTA、1％(w/v)Triton X-100、0.1％(w/v)疊氮化鈉、0.05％(w/v)硫酸慶大霉素、0.1％(w/v)酵母提取物、0.05％(w/v)大腸桿菌提取物、1％(w/v)BSA、0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、0.05％SDS、2.5％蔗糖和2mg/ml兔IgG)中預封閉，然后在37℃干燥1.5小時。偶聯混合物的制備是通過混合0.908毫升實施例3所述的偶聯物、1.440毫升實施例5所述的偶聯物混合物和1.388毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
對于格式4的測試片，偶聯物墊片的制備是通過混合1.0毫升實施例1所述的偶聯物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實施例6所述，將混合物涂在預封閉過的偶聯物墊片上。
測試是這樣進行的將含測試片的測試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測HIV的測試并讀取數據。按提示，通過加入25微升樣品(HIV陽性或HIV陰性)而開始測試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測試片溫度被設為37℃，并在15分鐘后對測試片進行讀數
在上述實施例中，使用單群的偶聯于分析物結合劑和對照結合劑的檢測劑，顯示出優于獨立雙群式所代表的現有技術。本發明的單群格式的優點在于，它可提高陰性與陽性樣品群之間的分離。單群式還通過降低非特異性結合和提供更佳的流動控制機制，改善了截止處的精確度。與雙群式方法相比，結果導致更高的分析靈敏度和特異性。
此外，使用多個對照區以及能夠將結果表示為相對于對照條帶的相對強度，這都有助于分析測試的重復性和精確度。在本發明的單群式方法中，與獨立的第一分析物檢測顆粒群和對照檢測顆粒群相比，這可以通過更佳地控制測試差異的來源而加以實現。當然，盡管含有單群偶聯于檢測劑的第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑在某些情況下是優異的，但是本發明也包括具有多群(兩群或更多)偶聯于檢測劑的第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑的例子。
在測試片上對照結合區和分析物結合區相對于流動方向的放置次序，在上述實施例中會影響測試性能。對于Helicobacter pylori和HIV而言，從偶聯物墊片至吸收墊片的最佳測試結構似乎都是分析物結合區(即抗原區)、低對照區和高對照區。然而，這并不意味著在其他測試中不能通過不同的區結構來獲得最佳結果，因而本發明也具體地包括這些其他配置。
權利要求
1.一種進行側流分析的方法，其特征在于，它包括讓感興趣分析物與第一分析物結合劑接觸，其中第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑被偶聯于檢測劑。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，至少一種第一分析物結合劑或分析物非特異性試劑被共價連于檢測劑。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，至少一種第一分析物結合劑或分析物非特異性試劑被非共價偶聯于檢測劑。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，感興趣分析物包括蛋白質；糖蛋白；肽；小有機分子；多糖；抗體或其片段；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，蛋白質包括激素或其他分泌蛋白質、酶和細胞表面蛋白，而抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，感興趣分析物具有免疫原性部分。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，測試片包含第一分析物結合劑、檢測劑和分析物非特異性試劑。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，測試片具有膜片。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，測試片具有偶聯物墊片，偶聯物墊片含有第一分析物結合劑、檢測劑和分析物非特異性試劑，而且偶聯物墊片與膜片接觸且位于膜片遠端。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，測試片具有與膜片復合在一起的保護性蓋片。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，第一分析物結合劑包括針對感興趣分析物的抗體；具有分析物結合位點的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；針對感興趣分析物的受體；針對感興趣分析物的配體；或針對感興趣分析物的抗原。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，針對感興趣分析物的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、或足以結合于感興趣分析物的抗體片段。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測劑包括顆粒、發光標記物；比色標記物、熒光標記物；化學標記物；酶；放射性標記物；或射頻標記物。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，檢測劑包括顆粒。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，顆粒包括膠體金。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，分析物非特異性試劑包括抗體、具有對感興趣分析物的非特異性結合位點的工程化蛋白、可特異結合于除感興趣分析物之外的配體的受體、可特異結合于除感興趣分析物之外的受體的配體、抗原、其他有機分子、半抗原、IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、或足以結合于感興趣分析物的抗體片段。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，分析物非特異性試劑包括兔IgG。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，分析物非特異性試劑包括對照結合劑。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，對照結合劑包括抗體、具有對感興趣分析物的非特異性結合位點的工程化蛋白、可非特異結合于除感興趣分析物之外的配體的受體、可非特異結合于除感興趣分析物之外的受體的配體、抗原、其他有機分子、半抗原、IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
21.如權利要求19所述的方法，其特征在于，對照結合劑包括兔抗-二硝基苯酚IgG。
22.如權利要求7所述的方法，其特征在于，測試片具有至少一個檢測區。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，至少一個檢測區包含至少一個測量區。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，至少一個測量區包含至少一個分析物結合區和至少一個對照區。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，對照區含有對照劑。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，對照劑特異地結合于對照結合劑，但不特異地結合于感興趣分析物或第一分析物結合劑，對照結合劑也不特異結合于第二分析物結合劑。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，對照劑包括可偶聯于BSA的二硝基苯酚。
28.如權利要求25所述的方法，其特征在于，對照劑包括不特異結合于感興趣分析物的抗體；具有非特異性結合位點的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；對感興趣分析物非特異的受體；對感興趣分析物非特異的配體；或對感興趣分析物非特異的抗原。
29.如權利要求24所述的方法，其特征在于，分析物結合區包含第二分析物結合劑。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，第二分析物結合劑包括針對感興趣分析物的抗體；具有分析物結合位點的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；針對感興趣分析物的受體；針對感興趣分析物的配體；或針對感興趣分析物的抗原。
31.如權利要求7所述的方法，其特征在于，測試片具有多個對照區。
32.一種在包括測試片的側流分析中提高測試平均陽性結果和測試平均陰性結果之間差異的方法，其特征在于，它包括在空間上重新排列測試片上一個或多個對照結合區相對于分析物結合區的位置。
33.一種在包括測試片的側流分析中降低側流分析的變差系數的方法，其特征在于，它包括在空間上重新排列測試片上一個或多個對照結合區相對于分析物結合區的位置。
34.一種在側流分析中提高側流分析重復性的方法，其特征在于，它包括定量位于第一對照區中的第一數量的檢測劑；定量位于第二對照區中的第二數量的檢測劑；將定量的第一和第二數量的檢測劑映射到相對標尺上，得到檢測劑的第一相對數量和第二相對數量；以及所進行的映射使得定量的第一數量檢測劑與第二數量檢測劑之比大于第一相對數量檢測劑與第二相對數量檢測劑之比。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，定量的第一數量檢測劑與定量的第二數量檢測劑之比至少約為5∶1，而第一相對數量檢測劑與第二相對數量檢測劑之比至少約為3∶1。
36.一種側流分析，它包括測試片，其特征在于，該測試片包括偶聯于檢測劑的分析物結合劑和分析物非特異性試劑。
37.如權利要求36所述的側流分析，其特征在于，至少一種分析物結合劑或分析物非特異性試劑被共價連于檢測劑。
38.如權利要求36所述的側流分析，其特征在于，至少一種分析物結合劑或分析物非特異性試劑被非共價偶聯于檢測劑。
39.如權利要求36所述的側流分析，其特征在于，感興趣分析物包括蛋白質；糖蛋白；肽；小有機分子；多糖；抗體或其片段；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
40.如權利要求39所述的側流分析，其特征在于，蛋白質包括激素或其他分泌蛋白質、酶和細胞表面蛋白，而抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
41.如權利要求36所述的側流分析，其特征在于，感興趣分析物具有免疫原性部分。
42.一種試劑盒，其特征在于，它包含權利要求36所述的側流分析。
43.一種方法，它包括進行側流分析以測定與人類疾病、或獸醫、食品測試、農業和精細化學應用有關的感興趣分析物，其特征在于，該側流分析是權利要求36所述的側流分析。
44.如權利要求1所述的方法，其特征在于，第一分析物結合劑和分析物非特異性試劑在進行側流分析之前被偶聯于檢測劑。
全文摘要
公開了一種側流分析,它包括將分析物結合劑和分析物非特異性試劑偶聯于檢測劑。還公開了制備和使用該分析的方法,以及改進這類分析的性能的方法。
文檔編號G01N33/543GK1254844SQ9912437
公開日2000年5月31日 申請日期1999年11月23日 優先權日1998年11月23日
發明者A·J·波利托, R·M·塞耶, R·K·德尼羅, G·H·謝拉 申請人:普萊克斯生物系統股份有限公司