專利名稱：腫瘤早期檢測評估試劑盒及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤早期檢測評估試劑盒及其制備工藝。
腫瘤組織發生、發展依賴于新生血管的不斷形成，通過新生毛細血管為腫瘤細胞提供必需的營養和氧氣，同時血管的形成又可為腫瘤細胞代謝廢物的及時排泄提供了便利的通道。研究表明，實體腫瘤組織的血管內皮細胞倍增時間僅為4天，而正常成人的組織中的血管內皮細胞倍增時間約為1年，腫瘤組織的血管內皮細胞增殖的速度比正常組織快90多倍，腫瘤組織血管內皮細胞快速增長的原因在腫瘤發生或復發時，腫瘤血管形成有關的一組基因開始活動和高度表達。腫瘤切除后，這些基因產物開始下降，甚至降到正常水平。腫瘤一旦復發、轉移這些基因又開始活動，基因產物又開始升高。瘤體的縮小、發展與轉移，治療效果的好與壞都可影響到這些基因的表達。監測癌癥病人這些基因的活動情況及波動變化可以預示病情的變化趨勢。在這些基因中，尤以堿性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast GrowthFactor，bFGF)與血管的增生為密切。本試劑盒就是通過腫瘤病人血、尿中的bFGF來為臨床醫生提供了分子水平腫瘤狀態的檢測方法。
近年來的研究發現，當遠外微小轉移灶里的癌細胞處于無血管生成的血管前期時，其增殖速率與快速生長的原發灶的細胞增殖速率相近；而此時的微小轉移灶內的癌細胞有一個非常高的凋亡速率，這時腫瘤細胞的凋亡速率與增殖速率相平衡。當腫瘤血管系統在轉移灶里形成并使癌灶進入血管期后，凋亡和增殖之間的平衡被破壞，凋亡減少而增殖過程占優勢，結果表現為快速生長的轉移灶。
本發明的目的在于提供一種腫瘤早期檢測評估試劑盒及其試劑盒中bFGF單克隆抗體、多克隆抗體和其它緩沖劑的制備工藝，能夠簡單地對腫瘤的發生、發展，腫瘤的療效進行動態評估。
本試劑盒每盒是由以下物質組成的包被緩沖液1瓶陽性對照(bFGF)1瓶陰性對照(生理鹽水)1瓶BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體 1瓶二抗標記物1瓶酶底物溶液1瓶終止液1瓶洗滌液1瓶封口膠1塊酶標板1塊其中陽性對照(bFGF)、陰性對照(生理鹽水)、二抗標記物、封口膠、酶標板為現有物質；包被緩沖液、BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體、酶底物溶液、終止液、洗滌液是由本發明的工藝制備而成的。
本發明的工藝是通過以下步驟實現的；1.多克隆抗體的制備1.1 bFGF抗原瑞森基因項目工程藥物研究所制備1.2動物成年純種大耳白兔1.3方法A免疫準備于每只家兔兩后肢腳掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5—6mg。B第一次免疫注射弗氏完全佐劑(FCA)抗原的制備，取不完全佐劑5ml，緩慢滴加BCG，邊滴邊研磨。再逐滴加入等量bFGF抗原液(邊滴邊研磨)直至形成油包水乳劑，滴1滴于冷水上久置不散為合格，滴加BCG及抗原時不可太快，加1滴充分研勻再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐劑中，應含BCG5—6mg/ml，抗原5mg/ml。
免疫準備后10天左右，于每只兔兩后支窩已腫大的淋巴結構內或其近旁各注入弗氏完全佐劑抗原(bFGF)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg。C第二次免疫注射間隔2-3周后，于每只兔脊柱兩側，兩肩部，兩臀部及兩腹股溝皮下作多點注射，每點0.2ml弗氏完全佐劑抗原，共8—10點。D第三次免疫注射間隔2-3周后，再于每只家兔脊柱兩側、肩部、兩臀部選不同點上，作皮下多點注射，共8點，每點注射弗氏不完全佐劑抗原(不含BCG)0.2ml。E試血測抗體效價間隔7-10天，無菌采兔耳靜脈血0.5-1ml，分離血清，以雙向瓊脂擴散試驗測抗體效價。效價＞1∶32時，可以放血。否則，以不加佐劑的抗原作靜脈注射免疫，一周內注射3次，依次為0.1、0.3、0.5m.l(含人bFGF分為1mg，3mg，5mg)。一周后再試血測效價，達到要求，立即放血。F放血采用頸動脈采血法。G分離血清將放出或抽出的血液傾斜放入37℃孵箱15-30分鐘，再移至4℃數小時，待血塊收縮，血清析出時，吸出血清，放入試管中，2000轉/分鐘離心30分鐘。HIgG的分離純化IgG的提取分兩步進行，第一步采用鹽析法粗提人γ球蛋白；第二步將提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱層析提純IgG。具體方法如下取血清60ml+生理鹽水60ml，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨120ml，4℃，30分鐘，離心3000轉X20分鐘，棄上清，加生理鹽水60ml溶液，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨30ml，4℃，3小時，離心3000轉/分X20分鐘，棄上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml。在PH7.2-7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成為穿過峰，獲得較純的IgG。2.單克隆抗體的制備2.1 小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug bFGF加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周后，用同樣劑量bFGF腹腔加強免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾細胞融合。2.2 抗原bFGF，由陜西瑞森基因工程藥物研究所提供。2.3 細胞融合，免疫小鼠脾細胞和Sp2/0細胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進行細胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽性克隆，再用中和抑制試驗證實為陽性克隆后，經有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽性的單個克隆，穩定傳代3個月，制備腹水和液氮凍存。2.4 單克隆抗體的鑒定2.4.1 雜交瘤細胞系染色體分析取對數生長期的雜交瘤細胞用秋水仙素處理，經Giemsa染色，鏡檢計數。2.4.2 Ig類及IgG亞類測定用美國Sigma公司的抗鼠Ig亞類抗血清與濃縮至原容積1/20的雜交瘤細胞培養上清液作瓊脂雙向免疫擴散。2.4.3 單克隆抗體特異性的測定將bFGF進行電轉移，而后用各株單抗分別進行ELISA染色。2.4.4 單克隆抗體比活性測定將各株單抗的蛋白進行定量，然后按不同稀釋度測定各株的滴度。3. 多克隆及克隆ELISA測定尿樣中的的bFGF3.1 各種緩沖液及試劑的配制方法A.包被緩沖液0.05M PH9.6的Na2CO3—NaHCO3Na2CO3(MW105.99)1.59克NaHCO3(MW84.01)2.93克蒸餾水溶至1000mlB.洗滌液PH7.4的PBS-Tween 20NaCl(MW58.44)8.0克KH2PO4(MW136.09)0.2克Na2HPO4·12H2O(MW358.14)2.9克(或者NaHPO41.14克 )KCl(MW74.56)0.2克蒸餾水溶至1000mlTween 20 0.5mlC.酶標記物稀釋液在上述洗滌液中加入羊血清，濃度為2％。D.酶底物溶液鄰苯二胺(O.P.D)—H2O2(2)磷酸—檸檬酸緩沖液PH5.0①0.2M Na2HPO4
取Na2HPO4·12H2O 71.63克用蒸餾水溶至1000ml。
②0.1M檸檬酸液取檸檬酸19.2克，用蒸餾水溶至1000ml，取①液25.7ml，②液24.3ml，再加蒸餾水50ml。
(2)O.P.D—H2O2鄰苯二胺(O.P.D)10mg磷酸—檸檬酸緩沖液25ml3％H2O2(分析純)0.4mlE.終止液2MH2SO4濃硫酸(95-98％)22.2ml蒸餾水 177.3ml(配時將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊搖勻。)3.2操作步驟取單克隆或多克隆抗體，正常鼠IgG(均稀釋成10mg/ml)平行包被40孔板(如A排包被單克隆或多克隆抗體，B排包被正常鼠IgG)，0.1ml/孔，放入濕盒中4℃冰箱過夜，用洗滌液洗滌板3次，每次3分鐘，甩干。在平行包被的孔中加入被檢抗原0.1ml/孔，37℃孵育1小時，同上洗滌3次，甩干。再在各孔內加入單克隆或多克隆抗體(稀釋成10mg/ml)，0.1ml/孔，37℃孵育1小時，同上洗滌3次，甩干，在各孔中加入酶標的二抗(稀釋成1∶4000)，0.1ml/孔，37℃孵育1小時，同上洗滌3次，甩干。在各孔內加入酶底物溶液0.1ml/孔，37℃避光孵育20分鐘。在各孔內加入2M H2SO40.025ml/孔，終止反應，用酶聯檢測儀測定各孔的490nm的吸光度。3.3 結果判定OD 比值計算
實施例一.試劑盒組成96人份 48人份 20人份包被緩沖液 1瓶 10ml 5ml 2.5ml陽性對照(bFGF) 1瓶 1ml 0.5ml 0.25ml陰性對照(生理鹽水) 1瓶 1ml 0.5ml 0.25mlBFGF的單克隆抗體或多克隆抗體 1瓶 10ml 5ml 5ml二抗標記物 1瓶 10ml 5ml 5ml酶底物溶液 1瓶 6ml 3ml 3ml終止液 1瓶 6ml 3ml 3ml洗滌液 1瓶 25ml 12.5ml 6ml封口膠 1塊 10塊 10塊1塊酶標板 1塊 96孔板 48孔板 24孔板二、標本收集1.晨尿、脫水及大量輸液病人不宜采尿。
2.最好新鮮尿樣，4℃可保存48小時，-20℃可保存4周。
3.尿液不能反復凍融。三、試劑貯存1. 4℃保存，有效期為4-6個月。
2.包被液必須蓋緊，4℃保存，長期不用，應更換新包被液。四、檢測步驟1.取出酶標板，每孔加包被液2滴(其中3孔不加，直接加陽、陰性對照液各2滴，一孔留作空白對照)。2.加病人尿液10ul，與包被液混勻。加蓋封口膜，置濕盒，4℃過夜或37℃3.5—4小時以上。3.到時取出，吸去包被液，每孔加洗滌液200ul，洗3次，每次加洗液后靜置1分鐘后，甩凈，拍干余液。4.加一抗2滴，37℃濕盒60分鐘。5.同步驟3，洗3次。6.加二抗2滴，37℃濕盒60分鐘。7.同步驟3，洗3次。8.每孔滴加底物A和B各1滴(空白不滴)，混勻，置濕盒37℃×30分鐘(或室溫45分鐘)避光。到時，每孔加終止液1滴，在酶標儀490mm處測OD值。五、判斷結果OD比值計算
六、臨床評估參考1 待檢標本OD比值≥2.1，表明血管形成肽基因表活躍。2 待檢標本OD比值在1.5—2.0之間為可疑。3 待檢標本OD比值在1.5以下，表示血管形成肽基因表達處于靜止期。
權利要求
1.腫瘤早期檢測評估試劑盒，包括陽性對照(bFGF)、生理鹽水、二抗標記物、封口膠、酶標板，其特征在于，其中還包括包被緩沖液、BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體、酶底物溶液、終止液和洗滌液。
2.根據權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所說的包被緩沖液為0.05M、PH9.6的Na2CO3—NaHCO3，所說的酶底物溶液為鄰苯二胺(O.P.D)—H2O2，所說的終止液為2MH2SO4，所說的洗滌液為PH7.4的PBS—Tween 20。
3.根據權利要求1所述的試劑盒的制備工藝，其特征在于，所說的BFGF的多克隆抗體按以下A-H步驟制備A免疫準備于每只家兔兩后肢腳掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg；B第一次免疫注射弗氏完全佐劑(FCA)抗原的制備，取不完全佐劑5ml，緩慢滴加BCG，邊滴邊研磨，再逐滴加入等量bFGF抗原液(邊滴邊研磨)直至形成油包水乳劑，滴1滴于冷水上久置不散為合格，滴加BCG及抗原時不可太快，加1滴充分研勻再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐劑中，應含BCG5—6mg/ml，抗原5mg/ml；免疫準備后10天左右，于每只兔兩后支窩已腫大的淋巴結構內或其近旁各注入弗氏完全佐劑抗原(bFGF)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg；C第二次免疫注射間隔2-3周后，于每只兔脊柱兩側，兩肩部，兩臀部及兩腹股溝皮下作多點注射，每點0.2ml弗氏完全佐劑抗原，共8—10點；D第三次免疫注射間隔2-3周后，再于每只家兔脊柱兩側、肩部、兩臀部選不同點上，作皮下多點注射，共8點，每點注射弗氏不完全佐劑抗原(不含BCG)0.2ml；E試血測抗體效價間隔7-10天，無菌采兔耳靜脈血0.5-1ml，分離血清，以雙向瓊脂擴散試驗測抗體效價。效價＞1∶32時，可以放血，否則，以不加佐劑的抗原作靜脈注射免疫，一周內注射3次，依次為0.1、0.3、0.5m.l(含人bFGF分為1mg，3mg，5mg)，一周后再試血測效價，達到要求，立即放血；F放血采用頸動脈采血法;G分離血清將放出或抽出的血液傾斜放入37℃孵箱15-30分鐘，再移至4℃數小時，待血塊收縮，血清析出時，吸出血清，放入試管中，2000轉/分鐘離心30分鐘；HIgG的分離純化IgG的提取分兩步進行，第一步采用鹽析法粗提人γ球蛋白；第二步將提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱層析提純IgG，具體方法如下取血清60ml+生理鹽水60ml，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨120ml，4℃，30分鐘，離心3000轉X20分鐘，棄上清，加生理鹽水60ml溶液，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨30ml，4℃，3小時，離心3000轉/分X20分鐘，棄上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml，在PH7.2-7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成為穿過峰，獲得較純的IgG。
4.根據權利要求1所述的試劑盒的制備工藝，其特征在于，所說的BFGF的單克隆抗體按以下步驟制備(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug bFGF加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周后，用同樣劑量bFGF腹腔加強免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾細胞融合；(2)免疫小鼠脾細胞和Sp2/0細胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進行細胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽性克隆，再用中和抑制試驗證實為陽性克隆后，經有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽性的單個克隆，穩定傳代3個月，制備腹水和液氮凍存。
全文摘要
本發明提供一種腫瘤早期檢測評估試劑盒,由包被緩沖液、陽性對照(bFGF)、生理鹽水、BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體等組成,同時,本發明還提供了BFGF單克隆抗體、多克隆抗體和其它緩沖劑的制備工藝,能夠簡單對腫瘤的發生、發展,腫瘤的療效進行動態評估。
文檔編號G01N33/531GK1251901SQ9911590
公開日2000年5月3日 申請日期1999年11月9日 優先權日1999年11月9日
發明者趙永同, 祁淼 申請人:趙永同, 祁淼