檢測和診斷流感病毒的篩選方法

專利名稱：檢測和診斷流感病毒的篩選方法
1．發明領域本發明涉及篩選方法和試劑盒，以及用所述篩選方法和試劑盒檢測和診斷流過病毒感染的方法。具體地講，本發明涉及以用于檢測流感神經氨酸酶的快速、特異性的檢測系統為基礎，用于檢測和診斷流感病毒感染的篩選方法。本發明還包括以流感神經氨酸酶的種特異性檢測為基礎的用于診斷流感病毒感染的試劑盒。此外，本發明涉及快速、特異性的高通量檢測系統以篩選與流感病毒神經氨酸酶相互作用并可用作抗病毒藥物的試劑。
2．發明背景2．1流感病毒感染流感病毒感染是一種世界性的重要臨床疾病。對流感已有數個世紀的了解，它是一種周期性發生的流行病，開始得很快，傳播迅速，而且經常是世界性的。事實上，在歷史上，流感曾引起最大的瘟疫之一；在1917至1918年間，約2千萬人死于流感感染。盡管流行病是周期性發生的，但流感每年都爆發。僅在美國，每年約4千萬人會受到流感的感染。在這些個體中，約15萬人入院治療，而1萬至4萬人死于流感或與流感有關的并發癥(Welch，S1988，Gilead’s OralInfluenza Drug Proves Positive in Phase Ⅲ，BioWorld Today9∶1，3)。在美國，每年因流感病毒引起的治療費用、生產力損失以及工資達約100億美元。
流感是一種與全身癥狀有關的急性呼吸性疾病。這種疾病起因于由流感病毒感染引起的上呼吸道細胞層、氣管和支氣管的破壞、流感病毒進入鼻咽，隨后擴散到表達特異性粘蛋白受體的細胞中。盡管病毒必須通過呼吸分泌物，呼吸分泌物含有病毒顆粒可結合的粘蛋白，但并不會阻斷感染，因為病毒神經氨酸酶可水解粘蛋白，使其成為無效的抑制劑。
急性流感病毒感染導致病毒復制，隨后被感染的細胞壞死以及呼吸道上皮大范圍脫落。這直接引起與急性感染有關的呼吸癥狀。與急性流感病毒感染有關的全身癥狀包括發燒、寒戰、全身性疼痛、頭痛、虛脫和食欲缺乏。通常，因流感病毒感染引起的疾病是自限性的，持續3-7天。繼發細菌感染(例如，金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌和β溶血性鏈球菌)造成大部分因流感引起的死亡。僅因流感病毒感染引起的死亡很少見。2．2流感病毒流感病毒是被膜病毒，含反義成片斷的單鏈RNA基因組。流感病毒是正粘病毒科的成員。根據其核殼和M蛋白質抗原，將流感病毒進一步分成三型(屬)，流感病毒A、B和C。A和B型流感病毒的新變體不斷出現，根據免疫獨特表面抗原、血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)糖蛋白的表達，將其分成亞型(種)。這兩種表面抗原的抗原變異是由抗原性漂移引起的。有兩種截然不同形式的抗原性漂移小抗原性漂移和主要抗原性漂移。小抗原性漂移反映了因病毒的HA和NA基因突變而引起的改變。主要抗原性漂移產生于流感病毒的人與動物株之間的重組(即基因重新配對)。因此，在混合感染過程中，病毒可以重新配對基因并產生世界上大部分人無免疫力的新病毒種。
流感病毒粒子由一個含單鏈RNA基因組的內核糖核蛋白核心(螺旋核殼)和一個內層有基質蛋白(M)的外層脂蛋白被膜組成。A和B型流感病毒的成片段基因組由編碼10個多肽的8個線性、負極性單鏈RNA組成(C型流感病毒是7個)，所述多肽包括形成核殼的RNA指導的RNA聚合酶蛋白質(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP)；基質蛋白(M1，M2)；核外輸蛋白；從脂蛋白被膜伸出的兩個表面糖蛋白(HA)和神經氨酸酶(NA)；和一個非結構蛋白(NS1)。在下表Ⅰ中總結了流感病毒的基因和其蛋白質產物。
表Ⅰ流感病毒基因組RNA片段和編碼安排a片段 長度b編碼的 長度d每個病毒備注(核苷酸) 多肽c(氨基酸) 粒子的分子12341 PB2 759 30-60 RNA反轉錄酶組分；宿主細胞RNA帽結合22341 PB1 757 30-60 RNA反轉錄酶組分；反轉錄的開始；核酸內切酶活性 32233 PA 716 30-60 RNA反轉錄酶組分；mRNA鏈的延長 41778 HA 566 500 凝素；三聚體；被膜糖蛋白；介導與細胞的粘附51565 NP 498 1000 核蛋白；與RNA有關；RNA反轉錄酶的結構組分61413 NA 454 100 神經氨酸酶；四聚體；被膜糖蛋白71027 M1252 3000 基質蛋白；被膜的內層M296 質膜中的結構蛋白；剪接的mRNA8890 NS1230 非結構蛋白NEP 121 核外輸蛋白a 改編自R.A.Lamb and P.W.Choppin(1983)，轉載自AnnualReview of Biochemistry，Volume 52，467-506b A/PR/8/34株的c 由生物化學和遺傳方法確定的
d 由核苷酸序列分析和蛋白質測序確定的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)是流感病毒表達的兩種主要表面糖蛋白。HA介導病毒粒子與宿主細胞的粘附，這是病毒感染的第一步，通過與糖綴合物中的末端唾液酸殘基結合而實現的。與HA活性相反，NA催化除去與糖蛋白和糖脂連接的末端唾液酸。NA在感染過程中的作用尚不清楚。據推測，NA活性用于通過消化HA受體中的唾液酸，從感染的細胞中釋放剛形成的病毒。此外，NA可以促進病毒通過呼吸道粘膜的運動，由此增強病毒的感染力。
對于A型流感病毒株而言，已根據其血清學特性將其分成9個亞型。B型流感病毒沒有任何亞型。A和B型流感病毒的NA僅有30％的氨基酸序列同源性(Kim，C.H.等人，1997，Journal of the AmericanChemical Society 119∶681)。但是，不同株之間的NA酶活性是相同的，這表明了該酶活性位點的高度保守性。NA分子形成以盒狀頭部區為頂的細長莖組成的四聚突起。已確定了三種流感病毒亞型A/Tokyo，A/Tern和B/Beijing的NA的X射線結晶結構(Varghese，J.H.and Coleman，P.M1991，Journal of Molecular Biology221∶473；Bossart-Whitaker，P.等，1993，Journal of MolecularBiology 232∶1069；Burmeister，W.P.等，1992，EMBO Journal11∶49)。結構研究表明NA由6個四鏈反向平行的β片層的對稱折疊圖形組成，所述片層象螺旋槳的漿片那樣排列。結晶學研究揭示出在所有檢測過的流感病毒株中，在活性位點中結合囊壁內層和周圍的氨基酸是高度保守的。
盡管許多研究工作集中于發現流感病毒神經氨酸酶的抑制劑(yon Itzstein，M.等，1993，Nature 363∶418-423；Kim，C.H.等，1997，Journal of the American Chemical Society 119∶681-690；Bischofberger，N.等，美國專利5763483；Kim等人，美國專利5512596；Kim等人，國際專利申請Wo 98/17647；Bischofberger，N.等，國際專利申請W 96/26933；Colman，P.等人，國際專利申請WO 92/06691；Luo，M等人美國專利5453533)，但是，仍沒有一種有效的神經氨酸酶抑制劑可用于治療流感。事實上，目前尚沒有有效的藥物可用于治療流感。目前，治療流感病毒感染的唯一方法是通過接種進行預防。但是，開發一種有效的疫苗需要正確預測下次“流感暴發”特有的流感病毒株。因此，仍然需要可有效抑制流感病毒感染的藥物。
2．3 現有的可用于診斷流感病毒感染的方法現在有許多方法可用于臨床診斷流感病毒感染。傳統上，通過用生物樣品接種細胞培養物，然后用血凝素抑制、ELISA或者免疫熒光檢測來評估病毒的存在來檢測流感病毒。盡管這種方法是高度靈敏和特異性的，但是培養、分離以及鑒定所需的時間為2-10天。由于流感病毒感染一般是自限的，因此，這種方法對于診斷沒有用處。
流感病毒感染可通過免疫學方法檢測和診斷，所述方法可檢測是否存在病毒特異性抗體或病毒特異性抗原。目前有許多免疫學技術可用于檢測病毒特異性抗體和病毒特異性抗原，包括ELISA(酶聯免疫吸附檢測)、固態放射性免疫檢測和免疫熒光檢測。以檢測病毒特異性抗體為基礎的流感病毒感染的臨床診斷需要提高抗體滴度，因為在感染時，大多數個體已具有了抗流感病毒的抗體。另一方面，利用免疫學方法檢測病毒特異性抗原取決于識別流感病毒抗原之抗體的使用，因而，不可能檢測新的病毒株。此外，用于檢測流感病毒的免疫學方法實驗室和具有技術專長的人員來完成檢測。
還可以以神經氨酸酶的酶活性為基礎檢測并診斷流感病毒感染。在文獻(例如，Santer，U.V.等，1978，Biochimica et Biophysica523∶435-442；Potier，M.等，1979，analytical Biochemistry94∶287-296；Yolken，R.H.等，1980，Journal of InfectiousDiseases 142∶516-523；von Itzstein，M.等，1993，Nature363∶418-423；Turner，G.等，國際專利申請WO 91/09975；Turner，G.等，國際專利申請WO 91/09972；Turner，G.等，國際專利申請WO91/10744；Turner，G.等，國際專利申請WO 91/09971；Reece，P.A.等，國際專利申請WO 97/32214；Liav，P.A．等美國專利5719020)中已描述過利用這些方法的各種檢測方法。但是，由于其缺乏敏感性和/或特異性，因此，利用上述神經氨酸酶酶活性依賴的檢測來診斷流感是有問題的。比色和熒光測定檢測系統不靈敏，因此，不足以檢測某些生物樣品中的低濃度神經氨酸酶。盡管盡管熒光測定檢測系統比比色檢測系統更靈敏，但是，生物材料的熒光受高蛋白質水平的影響，高蛋白質水平可以弱化熒光信號。此外，多種生物體均含有神經氨酸酶，包括哺乳動物、細菌(霍亂孤菌，產氣莢膜梭菌、肺炎鏈球菌和Arthrobacter sialophilus)和病毒(副流感病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒、家禽瘟疫病毒和仙臺病毒)，而現有的神經氨酸酶檢測法并未靈敏到可以區分這些病毒的程度。
對于個體或零星的病例來說，通過實驗室檢測來進行臨床診斷一般太貴。另外，用于診斷流感病毒感染的試驗費時并需要實驗室來完成診斷。此外，尚沒有可靠的治療方法來治療患流感感染的個體。因此，帶有流感病毒的個體不得不依賴醫生的揣測性診斷，而且幾乎沒有可靠的治療方法。因此，需要一種可以在醫生辦公室完成的簡單、快速和準確的診斷試劑盒用于診斷流感病毒感染。
3．發明概述本發明涉及可用于檢測和診斷流感病毒感染并可用于鑒定具有抗流感病毒活性之試劑的檢測方法。本發明的檢測方法用流感病毒神經氨酸酶(NA)為靶，并部分以申請人設計的高度敏感和特異性的檢測系統為基礎，所述檢測系統用于檢測流感病毒NA、與流感病毒NA特異性結合的配體或化合物和/或抑制流感病毒NA酶活性的配體或化合物。所述檢測可用于以高通量方式來篩選復雜組合文庫中的大量化合物以鑒定候選的抗病毒藥物或先導化合物，或產生可用作檢測臨床樣品中流感病毒NA的指紋的活性圖。所述檢測系統可制成試劑盒的形式，所述試劑盒可由醫護中心的護理人員或患者使用。
在一個實施方案中，以流感病毒NA或NA酶活性的存在作為檢測臨床樣品中流感病毒的標志。為此，可將可檢測的神經氨酸酶抑制劑(例如標記的神經氨酸酶抑制劑)與臨床樣品接觸--可檢測的神經氨酸酶抑制劑與樣品的結合表明存在NA，由此表明存在流感病毒。或者，可用標記的NA底物來檢測NA的酶活性，當用神經氨酸酶進行酶處理時，所述底物可產生可檢測的信號。至少可采用兩種方法可將樣品與流感病毒NA特異性的標記底物混合--可檢測信號的產生直接表明存在流感病毒NA，由此表明存在流感病毒。或者，在存在和不存在NA特異性抑制劑的條件下使用非特異性標記的底物--在該檢測中可檢測信號的減弱間接地表明存在流感病毒NA，由此表明存在流感病毒。
根據本發明的方法，可以評估大量不同分子的文庫對復雜的生物樣品中存在的潛在結合位點的結合親和性，并產生樣品顯示的結合親和性的圖形，從而提供了該樣品特有的指紋。在本發明的一個實施方案中，可以評估含特異性和非特異性底物和抑制劑的不同分子的文庫與可能存在于生物學樣品中的流感神經氨酸酶的結合親和性，并產生結合親和性圖形以鑒定特定的流感病毒株。
在另一個實施方案中，本發明涉及鑒定新試劑與神經氨酸酶或其他病毒組分相互作用之能力的快速、特異性、高通量的篩選方法。在一個實施方案中，可通過將流感病毒神經氨酸酶與試驗試劑混合并用本發明的組合篩選方法檢測試驗試劑的相互作用來檢測可與神經氨酸酶相互作用的試劑。根據本實施方案，可通過將流感病毒神經氨酸酶的標記的特異性或非特異性底物與流感病毒神經氨酸酶和試劑混合，來檢測可調節流感病毒神經氨酸酶活性的試劑。可減弱底物的酶處理的那些試劑將被認為是流感病毒神經氨酸酶活性的抑制劑。
本發明還包括通過本文所述的篩選檢測方法鑒定的新試劑。本發明涉及用神經氨酸酶為介入靶的用于治療病毒感染的治療模式和藥物組合物。本發明更具體地涉及通過靶向神經氨酸酶來治療流感病毒感染的治療模式和藥物組合物。本發明還涉及本發明鑒定的抗病毒試劑與其他已知抗病毒劑在抑制病毒復制的組合治療中的用途。
本發明部分基于本申請人設計的靈敏、快速、均相的檢測系統，所述檢測系統可以檢測樣品，包括但不限于復雜生物樣品中的NA。本發明的均相檢測系統利用不需要不同的NA檢測步驟的高效檢測系統。優選的檢測系統是熒光偏振和化學發光。
從神經氨酸酶的角度利用實施例描述本發明，但不是為了限制本發明，本發明的組合篩選檢測方法還涉及檢測其他病毒蛋白質，包括血凝素、核外運蛋白、基質蛋白、核蛋白和RNA指導的RNA聚合酶蛋白質的調節劑或抑制劑以鑒定潛在的病毒感染抑制劑。
4．發明的詳細描述本發明涉及基于本發明的組合篩選試驗和檢測方法的用于檢測和診斷病毒感染的新方法，包括將高度多樣化的化合物文庫與生物樣品接觸，產生可以鑒定生物樣品間存在的特定分子差異的指紋。本發明的組合篩選試驗和檢測方法的成功應用至少需要三種組分(1)多樣化的配體文庫(探針)；(2)臨床樣品源(對照和檢測樣品)；和(3)用于檢測配體/受體相互作用的靈敏檢測方法。可將本發明的組合篩選方法設計成用于診斷病毒感染的高度靈敏的檢測方法。在另一實施方案中，將本發明的組合篩選檢測方法用作靈敏的高通量篩選工具以鑒定與神經氨酸酶相互作用的新試劑，并由此鑒定用于治療流感病毒感染的潛在藥物。
本發明涉及以檢測臨床樣品中的流感病毒神經氨酸酶為基礎，用于診斷流感病毒感染的快速、特異性的檢測系統和試劑盒。根據本發明，將與流感病毒神經氨酸酶特異性結合的標記底物與臨床樣品混合，然后通過神經氨酸酶對底物的酶處理產生可檢測的信號。該檢測可直接表明存在流感病毒神經氨酸酶，并由此表明存在流感病毒。或者，將標記的流感病毒神經氨酸酶非特異性底物與臨床樣品和一種神經氨酸酶特異性抑制劑混合。
在該檢測中可檢測信號的減弱間接表明存在流感病毒神經氨酸酶，并由此表明存在流感病毒。另一種檢測方法通過檢測標記的神經氨酸酶特異性抑制劑與流感病毒神經氨酸酶的相互作用來確定在臨床樣品中是否存在流感病毒。在該檢測方法中，只有在臨床樣品中存在流感病毒神經氨酸酶時，才會產生可檢測的信號。
本發明還涉及根據其與神經氨酸酶或某些其他病毒組分相互作用的能力來鑒定新試劑如藥物、配體(天然的或合成的)、配體拮抗劑、肽、小有機分子等的快速、特異性的、高通量篩選檢測方法。所述檢測系統提供了鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用的試劑以及調節流感病毒神經氨酸酶活性之試劑的方法。在本發明的檢測系統中，將含待測樣品的生物樣品與探針文庫接觸，探針文庫包括已知的配體即多種特異性和非特異性底物和抑制劑以及未知的配體，即待測化合物，然后將待測化合物的結合活性與已知化合物進行比較。鑒定調節流感病毒神經氨酸酶活性之新試劑的檢測系統涉及篩選防止流感病毒神經氨酸酶與其底物相互作用的試劑。在本發明的另一實施方案中，可將高效的組合篩選方法用于檢測神經氨酸酶酶活性的高度特異性抑制劑。通過抑制底物的酶處理而減弱可檢測信號的那些試劑將被認為是流感病毒神經氨酸酶活性的抑制劑并可將其用于治療流感病毒感染。
本發明包括含有用本文所述篩選方法鑒定之新試劑的藥物組合物。本發明涉及用神經氨酸酶或某些其他病毒組分作為介入靶的用于治療病毒感染的治療方式和藥物組合物。本發明還涉及將本發明篩選方法鑒定的抗病毒試劑與抑制病毒復制的其他已知抗病毒試劑聯用。
4．1 配體/探針根據本發明的一個實施方案，當將已知的生物樣品如唾液、血液、血清、組織樣品、細胞、病毒、微生物或包括RNA、DNA、肽和蛋白質的小有機分子與一系列已知試劑接觸，產生一組反映結合作用圖的數值時，就建立了“指紋”。根據本發明的神經氨酸酶為基礎的檢測方法，所述多種配體文庫例如可包括特異性神經氨酸酶底物、非特異性神經氨酸酶底物、特異性神經氨酸酶抑制劑、非特異性神經氨酸酶抑制劑、從各種病毒和微生物分離的神經氨酸酶樣品、特異性和非特異性的神經氨酸酶抗體、或上述部分的變體。
本發明的配體或探針包括任何生物分子，包括天然的或合成的，并且可由核酸，包括DNA或RNA、小有機分子、肽、蛋白質、糖蛋白、多糖、糖或無機分子組成。
在所述檢測中可用作底物的神經氨酸酶底物包括，但不限于N-乙酰神經氨酸(NANA)及其衍生物如4，7-二烷氧基-N-乙酰神經氨酸衍生物，包括是流感病毒A和B神經氨酸酶之特異性底物，但不與副流感病毒1、2、3、4病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞體病毒、腺病毒或細菌神經氨酸酶相互作用的4，7-二烷氧基Neu5Ac，在美國專利5719020(該文獻全部引入本文作為參考)中所述的流感病毒A和B神經氨酸酶之非特異性底物的4-烷氧基-Neu5c；WO 91/09972(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的NANA的產色衍生物，包括4-位修飾的NANA；WO 91/10744(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的9-位修飾的NANA；WO 91/09971(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的5-位修飾的NANA；以及WO 91/09945(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的7-或8-修飾的NANA。可用于本發明檢測方法的神經氨酸酶底物包括美國專利5453533(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的NANA的三糖衍生物和NANA的熒光衍生物如4-甲基傘花基(umbelliferyl)-NANA。檢測所用的底物濃度是以滴定試驗的結果為基礎的。將使用可以使對流感病毒神經氨酸酶活性的檢測產生最大靈敏度的底物濃度。
在所述檢測系統中，可以用已知的流感病毒NA特異性和非特異性抑制劑作為探針，包括但不限于天然抑制劑，包括GB 2238049(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的抑制流感病毒A0、A1、A2神經氨酸酶的金黃色葡萄球菌糖脂蛋白；非碳水化合物抑制劑，如在美國專利5453533(該文獻全文引入本文作為參考)中描述的A和B型流感病毒神經氨酸酶抑制劑；WO 98/17647(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的抑制病毒和細菌神經氨酸酶的哌啶化合物；美國專利5512596(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的抑制病毒和細菌神經氨酸酶的芳香化合物；US 5763483(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的抑制病毒和細菌神經氨酸酶的碳環化合物；WO 92/06691(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的具有抗正粘病毒和抗副粘病毒活性的2-脫氧化合物；WO 91/16320(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的2-脫氧-2，3-二脫氫-Na-鯨蠟基神經氨酸衍生物和類似物；WO 96/36628(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的6-甲酰胺二氫吡喃衍生物；以及WO 96/26933(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的抑制病毒和細菌神經氨酸酶的一般抑制劑如哌啶化合物。所述檢測方法利用抑制劑與流感病毒神經氨酸酶結合的這一已知的特定性質。檢測中所用抑制劑的濃度是以滴定試驗的結果為基礎的。在檢測系統中使用對于檢測流感病毒神經氨酸酶可產生最高靈敏度的抑制劑濃度。此外，所述檢測系統中所用的探針可由可以是底物或抑制劑的化合物組成，例如WO 97/32214(該文獻全文引入本文作為參考)中所述的帶有6-位間隔基的神經氨酸類似物，所述類似物在間隔基的末端有一可檢測標記或表面-結合配對物以便在固體表面上濃縮/檢測。
4．1．1 配體/探針的標記本文所述的是用于可檢測標記分子的方法，所述分子能夠與流感病毒神經氨酸酶相互作用。可將在上述檢測系統中所用的神經氨酸酶-相互作用分子、神經氨酸酶底物和抑制劑標記、尾標或者結合以便當所述分子與神經氨酸酶相互作用時產生信號。標記、尾標或結合物包括但不限于，熒光化合物、放射性堿基和化學發光化合物。
可被可檢測地結合到熒光化合物上的探針/配體包括但不僅限于，熒光素(FL)、4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-對稱引達省(s-indacene)-3-丙酸(BO或BODIPY)、4-甲基-2，4-二羥基肉桂酰基、熒光素、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛和fluoroescamine。神經氨酸酶與熒光標記的神經氨酸酶-相互作用劑之間的相互作用可通過分光熒光計或者優選通過熒光偏振分析混合物來檢測。
還可將神經氨酸酶的底物與產色和熒光化合物例如香豆素結合。當將這些化合物與底物結合時，它們是檢測不到的。結合的化合物經流感病毒神經氨酸酶的水解作用產生肉眼可見的顏色或者通過分光熒光計可檢測的熒光化合物。
還可用放射性同位素例如32P、125I或135I標記神經氨酸酶特異性抑制劑。神經氨酸酶與神經氨酸酶特異性抑制劑之間的相互作用可通過使用γ計數器或閃爍計數器或放射自顯影這樣的方法來檢測。
在一個優選的實施方案中，將神經氨酸酶特異性的或非特異性的底物與化學發光化合物如羥苯基二氧雜環丁烷化合物結合。在這種情況下，神經氨酸酶對底物的酶處理將會發射出用光電倍增管或電荷耦合裝置(CCD)照相可檢測的光子。
探針與生物樣品組分間的結合作用還可通過ELISA(酶聯免疫吸附檢測)檢測。可將探針標記或者與類似生物素、鏈霉抗生物素蛋白或者異羥基洋地黃毒苷的分子結合。用這些分子標記的探針可用所述標記特異性的酶結合的抗體來檢測。或者，可將探針用抗體標記，所述抗體是否與酶結合均可。不與酶結合的抗體可通過與酶結合的二級抗體來檢測。酶結合的抗體將與適宜的底物反應，產生例如通過分光光度法、熒光檢測或肉眼可檢測的化合物部分。可用于可檢測標記抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、α甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
4．1．2 配體文庫的合成本發明的方法可以使用按照本發明技術人員已知的任何技術合成的配體文庫。優選，利用常規溶液相反應或固相合成技術合成。可將所研究的有機分子，例如含伯胺或仲胺基或羥基或硫羥的生物活性化合物或醛或酮或羧酸用適宜的熒光分子(染料)溶液標記以得到相應的熒光-標記的配體。這些方法和染料描述于Haugland，R.P.熒光探針和研究化合物手冊(Handbook of Flrorescent Probes andResearch Chemicals)，6thEd1996。在本發明的一個優選的實施方案中，在適宜的極性有機溶劑或溶劑混合物如DMF、DMSO、THF中用稍微過量的染料來完成液相合成以確保完全標記。在有機合成中，通過標準技術如用酸或堿液-液提取、結晶和色譜(薄層或柱)來純化所得的熒光標記的配體。如下文實施例所述，還可以使用其他純化方法，例如用聚合物結合的清除劑進行液-固相提取以除去未反應的染料，接著進行簡單的過濾(參見Obrecht，D and Villalgordw，J.MSolid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis ofSmall-Molecular-Weight Compound Libraries，Pergamon，1998，Chapter 3)。
方案Ⅰ液相反應(通過清除樹脂純化產物)在本發明的一個實施方案，用常規固相技術制備本發明的文庫。參見例如Bodanszky，肽合成原理(Principles of PeptideSynthesis)(Springer-Verlag1984)；Bodanszky，et alThePractice of Peptide Synthesis(Springer-Verlag1984)；Baranyand Merrifield The PeptidesAnalysis，Synthesis and Bioloy Vol.2，Chapter 1(Academic Press1980)；Atherton，etal，Bioorg.Chem.Vol.8(1979)。這是由于固相合成比傳統合成方法有許多優點。例如，可以使用大大過量的試劑或起始材料以啟動單個反應的完成，因為產物附著在固體支持物上，所以通過簡單的過濾和洗滌即可完成純化和分離。此外，樹脂結合的物質的相對定位分離可以抑制許多類型的分子間副反應。
下文描述特別適用于合成本發明文庫的固相合成法。該方法能夠快速有效地形成多種多樣的熒光標記之配體的文庫，包括兩個常規步驟。首先，將熒光染料與固體支持物共價相連。第二步，按照需要可以重復多次，固定的染料與化合物或化合物之混合物反應形成所需的配體混合物。本發明包括利用文庫的檢測方法，所述文庫在制備后與固體支持物相連，或者與不同的支持物相連。但是，優選在第三步中，將配體混合物從支持物上裂解下來。在方案Ⅱ所列的本發明合成方法的優選實施方案中包括所述可有可無的第三步。 其中＆＃60A＆＃62、＆＃60B＆＃62、＆＃60C＆＃62、＆＃60D＆＃62和＆＃60E＆＃62代表適用于形成所需產物或式(b)-(g)所代表的中間產物的反應條件，方括號(即[])代表任選的平行或連續反應、反應物和/或產物。
本發明反應方案Ⅱ選擇下列式(a)的染料分子S-D-Y式(a)其中D是熒光部分，X和Y是功能基，分別獨立地選自鹵素、醇、硝基、硫羥、醚、酯、羧酸、α鹵代羧酸衍生物、胺、酰胺和其保護的和未保護的衍生物。式(a)染料分子的實例包括但不限于熒光素衍生物如二氯三氮基氨基熒光素(dichlorotriazylaminofluorescein，DTAF)、二氯磺基熒光素(DCSF)和硝基熒光素；色氨酸衍生物；香豆素衍生物；萘基衍生物；二吡啶(bpy)衍生物；三吡啶衍生物；菁藍羅丹明和有機金屬復合物如Ru(bpy)3和其衍生物。染料分子的選擇取決于許多因素包括例如大小、溶解度、在固相反應條件下對降解的免疫性、吸收和發射波長、量子產率以及量子產率和發射波長對周圍化學環境的敏感性。從文獻中很容易確定這些因素中的大部分以及這些和其他適宜化合物的合成。參見例如Haugland，R.PHandbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals(6thed.；1996)。
再根據反應方案Ⅱ，選擇式(b)的活潑底物樹脂-L-E式(b)其中樹脂代表任何適用于固相合成的固體支持物；L是與固體支持物相連的銜接物；E是與L結合的離去基團。適宜的固體支持物包括例如聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物和聚乙二醇-PEG-PS-DVB共聚物。連有和不連有銜接物的Wang(聚合物-結合的4-芐氧基苯甲醇)和Rink樹脂可以從Aldrich Chemical CoMilwaukee，WI；Novabiochem，San Diego，CA；和Advanced Chemtech，Louisville，KY得到。
選擇銜接物L-E以便在反應方案Ⅱ＆＃60E＆＃62代表的反應條件下很容易裂解其與固體支持物的鍵。適宜的銜接物是本領域技術人員已知的，包括例如鹵素、硫羥、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷，以及其保護的和未保護的衍生物。所述銜接物與固體支持物的連接可以通過本領域技術人員熟知的方法完成。參見例如Bunin，B.AThe Combinatorial Index，Academic Press，1998。
除上述標準外，選擇銜接物L-E以便它可以在反應條件＆＃60A＆＃62下與式(a)染料分子的熒光部分D形成共價鍵，產生式(c)的固定化染料樹脂-L-D-Y式(c)取決于樹脂L、E和X的適宜反應條件＆＃60A＆＃62是本領域技術人員熟知的，或者是本領域技術人員很容易確定的。通常，它們包括利用引起樹脂膨脹并與X反應的溶劑。適宜的溶劑包括例如二甲基甲酰胺(DMF)，1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，四氫呋喃(THF)，CH2Cl2，和其混合物。反應條件＆＃60A＆＃62還包括一種堿例如二異丙基乙胺(DIPEA)，三乙胺，二甲基氨基吡啶(DMAP)或者N-甲基嗎啉(NMM)以中和反應過程中產生的酸。
式(c)的固定化染料作為形成文庫配體(由反應方案Ⅱ中式(g)表示)的基礎。如果保護活潑部分Y，必須在進行其他反應前將其脫保護。在反應方案Ⅱ＆＃60B＆＃62代表的反應條件下，完成所述任選的脫保護以形成脫保護的部分Y’。隨保護基改變的這些條件是本領域技術人員熟知的。參見，Greene，T.W.and Wuts，P.G.MProtective Groups inOrganic Chemistry(第2版，1991)。
然后在反應條件＆＃60＆＃62下，將固定化的染料與式E1R1G1的化合物反應產生式(d)的化合物樹脂-L-D-R1-G1式(d)其中E1和G1可以相同或不同，E1是離去基團或保護基，G1是R1的末端或者離去基團或者保護基，R1為含至少一個保護或脫保護的活潑部分的任何化學片段，所述活潑部分能夠在適宜的催化和/或脫保護條件下將R1加到熒光部分D上。適宜的活潑部分包括但不限于鹵素、硫羥、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷，以及其保護的和未保護的衍生物。適宜的反應條件＆＃60＆＃62包括已開發出用于固相組合化學法的那些條件。參見例如Brown，rContemporaryOrganic Synthesis，216(1997)；Felder，E.Rand Poppinger，DAdv.Drug Res30∶111(1997)；Balkenhohl，F等，Angew.Chem.Int.Ed.Enl.35∶2288(1996)；Hermkens，P.H.H.等人，Tetrahedron 52∶4527(1996)；Hermkens，P.H.H.等人，Tetrahedron53∶5643(1997)；Thompson，L.A.等人Chem.Rev.96∶555(1996)和Chem.Rev.97(2)(1997)。舉證性的加成反應包括伯胺與醛形成亞胺的反應，亞胺可以與各種不同的部分包括例如β-內酰胺、吡咯烷、噻唑烷酮和酰胺反應。酸也是易變的，并可用于在Ugi多組分縮合條件下例如與醛、胺和異腈反應形成小酰胺或雜環化合物。
如反應方案Ⅱ所示，還可將式(c)的固定化染料分子與化合物的混合物反應，所述每種化合物是不同的，但具有通式E1R1G1；即，E1R1G1+(E1R1G1)’+(E1R1G1)”+…+(E1R1G1)i，其中i是混合物中化合物的數量并且是整數，優選少于約50。在這種情況下，產生式(d)化合物的混合物，每種化合物有不同的R1G1片段，即樹脂-L-G-R1G1+樹脂-L-G-(R1G1)’+樹脂-L-G-(R1G1)”+…+樹脂-L-G-(R1G1)i。但是優選式(c)化合物僅與式E1R1G1的一種化合物反應。
由于許多藥物活性化合物含有活潑部分例如胺和羧酸，所以本發明認為式E1R1G1包括所述化合物，其中可能需要或不需要進一步的反應。但是，如果式(d)化合物的R1部分是活潑部分，則可以在反應方案Ⅱ＆＃60D＆＃62集中所指的反應條件下完成n-1個隨后的加成反應，其中n代表與熒光部分D結合的部分數，并且優選是小于約100的整數。
如上所述，每個隨后的加成反應均可使用式EkRkGk化合物中的一種化合物或化合物的混合物，其中K是2至n-1之間的整數，Rk是與固定化熒光部分D結合的第K部分(經已與D結合的K-1部分)，Ek和Gk相同或不同，Ek是離去基團或保護基，Gk是Rk的末端或離去基團或保護基，Rk代表含至少一個活潑部分的任何化學片段，所述活潑部分能夠將Rk加到固定的化合物上。適宜的反應條件＆＃60C＆＃62包括使用催化劑、脫保護劑以及可促進Rk加至固定的熒光化合物上的條件。
上述反應的完成形成式(f)的固定化化合物樹脂-L-D-Rn式(f)或式(f)固定化化合物的混合物；即樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)+樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)’+樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)”+…+樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)m，其中在有最大數量化合物的EkRkGk混合物中，當i等于化合物數時，m為約1*n的最大值。為了簡單起見，將Gn從式(f)中刪除，因為配體的末端(例如Rn)再沒有加成反應。
在反應方案Ⅱ的最后步驟中，在反應條件＆＃60E＆＃62下從固體支持物上裂解染料-配體化合物，形成式(g)化合物的文庫P-D-Rn式(g)其中應理解式(g)包括由反應方案Ⅱ所示之反應產生的所有可能的化合物和化合物的混合物。適宜的裂解條件＆＃60E＆＃62是本領域技術人員已知的并取決于樹脂和L間的鍵。裂解可以在酸或堿性條件下完成，或者可以是光可誘導的。在文獻中已報道了許多適宜的裂解方法。例如，在反應方案Ⅲ中列出了通過用三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液處理式(f)的改性樹脂而完成的一些裂解反應 其中(j)是Wang樹脂衍生物；(k)是Wang氨基甲酸酯樹脂衍生物；(1)是Wang氨基酸樹脂衍生物；(m)是Rink樹脂衍生物；(n)是Rink氨基酸樹脂衍生物；(o)是三苯甲基或氯三苯甲胺(即X=NH)或醇(即X=0)樹脂衍生物；L1代表在固相反應條件下穩定的任何側鏈或間隔基。適宜側鏈的實例包括但不限于取代的和未取代的烷基、芳香基和芳烷基。
裂解后，優選除去溶劑以分離熒光文庫。然后將文庫溶解在適用于本發明檢測的溶劑如二甲亞砜(DMSO)中。
在反應方案Ⅳ-Ⅷ中列出了反應方案Ⅱ方法的具體實施方案。為了清楚起見，這些反應方案并未列出混合物的反應和形成。但是應理解所列的每個反應均代表有許多可能的平行反應。
在反應方案Ⅳ中列出了反應方案Ⅱ一般方法的特別簡化的實施方案 其中L1是在所示的反應條件下不發生空間位阻或抑制偶聯反應的任何部分；P代表從固體支持物上裂解后L1的末端；R1和R2相同或不同并可以是提供具有優選結構和反應特征之文庫的任何理想的部分。適宜部分的實例包括但不限于取代的和未取代的烷基、芳基和芳烷基。
根據反應方案Ⅳ，將DTAF用氨基甲酸二氨基酯Wang樹脂或氨基酸Rink樹脂或二氨基/氨基醇三苯甲基/氯三苯甲基樹脂固定在固體支持物上。反應優選在室溫下完成。將DTAF與0.5-3倍量堿如DIPEA、三乙胺、DMAP或NMM溶解在適宜的溶劑如DMF、NMP、THF、二氯甲烷或其混合物中。在室溫用過量對稱二胺(優選在約2-約6倍量之間)的DMF或NMP溶液取代三嗪環上的剩余氯可產生用于進一步合成的新反應基團。可將該過程按需要重復許多次，并可用許多不同的反應物重復，然后從反應支持物上裂解熒光化合物或化合物的混合物。
在反應方案Ⅴ中列出了反應方案Ⅱ一般方法的另一實施方案 其中將DCSF經與樹脂結合的仲烷基胺，優選環狀仲胺的氯原子的取代與固體支持物相連。L1因此形成環狀二胺的一部分。適宜的環狀二胺包括但不限于哌嗪、高哌嗪、4，4’-三亞甲基二哌啶、其衍生物和其異構體。如所示，R1還形成環狀二胺的一部分，盡管HNR1NH可由帶有適宜反應基團的任何化合物取代。R2和R3代表適宜摻入本發明文庫之熒光配體內的任何部分，包括但不限于天然氨基酸的側鏈；取代的和未取代的烷基、芳基和芳烷基等。
如反應方案Ⅳ所示，在標準酰胺形成條件(即PyBrOP/DMAP/DMF)下，通過熒光化合物之游離氨基與Fmoc氨基酸的反應，將N-Fmoc保護的氨基酸與熒光樹脂相連。用DMF中的哌啶除去Fmoc基團后，用例如酰基氯、chloroformates或異氰酸酯將氨基酸提供的新氨基衍生化得到各種熒光標記的化合物。在反應方案Ⅵ中提供了適宜異腈化合物的非限制性實施例 如對本領域技術人員顯而易見的，含活潑部分如氨基酸、酰基氯、chloroformate和異氰酸酯的許多其它部分(即R4，R5，…Rn)均可用于形成與DCSF結合的配體。同樣，與反應方案Ⅳ之R2和R3基團相連的化學片段可以由可以使與染料分子結合的鏈延長的任何其它基團取代，只要反應條件是用適宜的方式改變的。
在反應方案Ⅶ中列出了反應方案Ⅱ一般方法的最后一個實施方案 其中將DTAF與Rink氨基酸樹脂結合，然后用上述方法衍生化。L1、R1和R2如上所定義的。
除上述方法外，還可通過一般的固相合成技術(Obrecht，D.andVillalgordo，J.MSolid-Supported Combinatorial andParallel Synthesis of Small-Molecular-Weight CompoundLibraries，Pergamon，1998；and Bunin，B.AThe CombinatorialIndex，Academic Press，1998)制備熒光標記的配體文庫。在本發明的一個優選的實施方案中，按照文獻中描述的方法在固體支持物上合成所需的化合物。從固體支持物上裂解前，將固體支持物上的化合物用適宜的染料處理以便在樹脂上得到熒光標記的配體。然后從樹脂上裂解配體，得到熒光標記的配體。
在一種方法中，通過將固體支持的活潑嵌段與不同的活潑嵌段逐步反應，以線性方式合成配體。然后如反應方案Ⅷ所示，在裂解前最后一步加入染料以得到標記的配體。在該反應方案中，制備熒光標記的N-羥基喹唑啉酮。喹唑啉酮是一種最常見的含雜環的生物活性氮(參見Sinha，S.and Srivastava，M.in Progress in DrugResearch，1994，vol．43，143-238)。它們在人和動物中有廣譜生物和藥理學活性。已將其作用抗驚厥劑、抗菌劑和治療糖尿病藥。因此，熒光標記的喹唑啉應可用于診斷和藥物發現。
在另一種方法中，用多組分縮合反應如Ugi縮合(Tempest，P.A.等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1996，vol.35，640-642)以聚集的方式制備配體。用這種方法，由于將過量的Rink胺樹脂和醛、Fmoc-保護的氨基酸以及異腈加至用MeOH/DCM(1∶2 v/v)膨脹的樹脂中，所以可將胺組分固定在固體支持物上(反應方案Ⅸ)。組合利用不同的醛、酸和異腈，可以合成大量的配體。
4．2 生物樣品本發明提供了得到從各種來源得到的含病毒神經氨酸酶之復雜生物混合物或樣品的指紋的方法。神經氨酸酶可得自患者樣品、由表達神經氨酸酶之病毒感染的細胞、重組表達的神經氨酸酶或者利用標準分子生物學和蛋白質純化技術得到的純化的神經氨酸酶。可用本發明的方法鑒定正常和異常例如未感染的或感染的細胞和/或組織間特異性表型的差異。還可將本發明方法用于鑒定或辨別微生物、病毒、細菌、真菌或寄生蟲物種。
本發明的方法可檢測所有類型的配體/受體相互作用，因此，神經氨酸酶可以是純化的蛋白質、編碼NA的核酸或者NA調節元件，或者能夠代表神經氨酸酶形狀即與神經氨酸酶特異性探針或配體相互作用的任何分子。本文所用靶受體--神經氨酸酶可以指“生物學受體”、“受體”、“生物學靶”、“靶”和“生物樣品組分”。
因此，本發明的一個方面是用于表征流感病毒感染的方法，所述方法包括鑒定生物樣品中存在的神經氨酸酶受體或靶與配體或探針文庫間的結合作用圖，其中所述結合作用圖提供了所述疾病特有的指紋。
根據本發明，“受體”或“靶”是代表或模擬神經氨酸酶結合親和性或酶活性的生物分子，包括但不限于蛋白質，包括酶、抗原、抗體，類脂、核酸包括DNA和RNA，碳水化合物包括植物凝血素，細胞表面蛋白或受體等。
所述方法中所用的生物樣品可以是生物分子源的任何樣品，包括但不限于生物材料例如血清、組織樣品、細胞提取物、體外轉錄和翻譯系統的產物(例如通過king等人的美國專利5654150的方法得到的)等。此外，還可以使用來自含致病生物如細菌、角膜、真菌、病毒、原生動物等的提取物或體液。在這些情況下，與病原體中的蛋白質或其它受體有高度親和性和特異性的配體可揭示新靶并可檢測其對所述病原體的抑制作用。
可用本發明方法篩選的生物樣品可得自各種來源。例如，但不限于生物樣品或混合物可得自患者，包括體液、血液、血清、粘液，包括口腔、直腸或腸粘膜、尿、糞等。此外，生物樣品可包括組織樣品、活檢組織、細胞樣品，包括骨髓細胞、淋巴細胞、免疫細胞、從口腔、直腸或腸粘膜層得到的粘膜細胞等。在另一實施方案中，生物樣品或混合物可以包括細胞溶解產物或其部分、碳水化合物包括植物凝集素；蛋白質包括糖蛋白、細胞表面受體、肽；核酸包括DNA或RNA等。在另一實施方案中，生物樣品可以是或可得自病毒、細菌、微生物或寄生蟲或含所述生物樣品的體液，例如檢測供水系統的微生物含量。
本發明的生物樣品可以得自患因感染病毒、細菌或其它微生物引起的疾病、失調或病理狀態的個體。在另一實施方案中，所述生物樣品可通過將組織、培養中的細胞、細胞提取物等與毒素或致病劑接觸，或者通過遺傳工程方法處理培養中細胞的基因組以編碼已知與任何給定之疾病或失調有關的突變或蛋白質或肽。
可以從醫院或國家研究機構收集生物樣品作為臨床樣品源。
4．3 檢測臨床樣品中流感病毒神經氨酸酶的篩選方法由于某種疾病的臨床材料常常是以有限量提供的，因此，本發明的第三個方面，是靈敏的檢測系統必須能夠檢測在微升樣品中發生的結合作用，另外，必須能夠檢測低于最佳親和性的結合作用。本發明的檢測系統還必須能夠消除或者大大降低配體與樣品中受體的非特異性結合。考慮這些因素，本發明的組合檢測系統和檢測方法對現有的系統例如熒光偏振、閃爍親近檢測(SPA)和酶聯免疫吸附檢測(ELISA)進行了改進。
本發明提供了快速、特異性的用于檢測和診斷流感病毒的檢測方法。更具體地講，本發明提供了檢測流感病毒神經氨酸酶(NA)的方法。
以NA為基礎，至少有三種方法可用于檢測流感病毒感染。一種方法是利用一種標記的流感病毒神經氨酸酶特異性底物，其在酶處理后產生可檢測信號。該方法提供了一種直接表明神經氨酸酶存在，并由此表明存在病毒的方法。另一種方法是利用一種標記的流感病毒NA非特異性底物，在酶處理后產生可檢測信號，但存在流感病毒NA特異性抑制劑的情況下除外。在存在流感病毒NA特異性抑制劑的條件下，所述信號可被減弱。該方法提供一種間接表明神經氨酸酶存在并由此表明存在病毒的方法。第三種方法是利用一種標記的病毒NA特異性抑制劑，所述抑制劑與NA作用后產生可檢測信號。該方法提供了一種直接表明神經氨酸酶存在并由此表明存在病毒方法。
4．3．1 流感病毒感染的診斷通過患流感感染個體的鼻(或咽)棉拭或吸出物來對所述個體進行診斷。然后將所述棉拭或吸出物與少量體積的載體液體混合。在優選的實施方案中，用約0.5毫升載體液體稀釋所述棉拭或吸出物。加入標記的NA特異性或非特異性底物或者在載體液體中含所述底物。NA底物與臨床樣品混合在通過流感病毒NA的酶處理后將產生可檢測信號。為了確保用非特異性底物檢測的酶活性是流感病毒神經氨酸酶的酶活性，應將流感病毒神經氨酸酶特異性的抑制劑加至反應混合物中。將流感病毒神經氨酸酶特異性的抑制劑加入到合流感病毒NA非特異性底物和臨床樣品的混合物中將使可檢測信號減弱。診斷流感病毒感染中所用的這兩種方法利用了流感病毒神經氨酸酶的酶活性。
診斷流感病毒神經氨酸酶的另一種方法是從個體中得到鼻拭或吸出物，然后將其放在載體液體中與標記的神經氨酸酶特異性抑制劑混合。如果在臨床樣品中存在神經氨酸酶，那么神經氨酸酶特異性抑制劑與臨床樣品的混合將產生可檢測信號。在該檢測方法中，能夠檢測出信號將表明存在流感病毒。
在優選的實施方案中，在醫生的辦公室內就可完成這些檢測來診斷流感病毒感染。所述檢測系統給醫生提供了快速、特異性以及準確地診斷流感病毒感染的方法。在另一優選的實施方案中，神經氨酸酶的檢測方法足夠靈敏到可以檢測出約100個或更少的顆粒。
4．4 用于檢測新的調節神經氨酸酶活性之試劑的高通量篩選方法在另一實施方案中，通過高通量檢測系統可以鑒定調節神經氨酸酶活性的新試劑。這些新試劑可以包括但不限于藥物、配體(天然的或合成的)、配體拮抗劑、肽、小有機分子等。用于鑒定新的調節神經氨酸酶活性之新試劑的一種方法是將在含流感病毒或流感病毒神經氨酸酶之載體液體中的試劑與流感病毒NA的底物混合。如果所述試劑不能抑制流感病毒NA活性，將產生可檢測信號。通過試劑減弱流感病毒NA對非特異性或特異性流感病毒NA底物進行酶處理產生信號的能力，可以檢測抑制神經氨酸酶活性的試劑。
4．5 用于鑒定新的與神經氨酸酶相互作用之試劑的高通量篩選方法在另一實施方案中，通過快速、特異性的高通量檢測系統可以鑒定與神經氨酸酶相互作用的新的試劑。這些試劑包括但不限于藥物、配體(天然或合成的)、配體拮抗劑、肽、小有機分子等。鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用之新試劑的一種方法是標記試劑，然后篩選與神經氨酸酶相互作用的那些試劑。另一種方法是標記神經氨酸酶，然后篩選與神經氨酸酶相互作用的試劑。有許多不同的檢測系統可用于檢測試劑與神經氨酸酶間的相互作用，所述檢測系統包括但不限于閃爍親近檢測法(SPA)、DNA阻塞檢測法、熒光偏振檢測法。
4．5．1 閃爍親近檢測法在SPA檢測法中，可將神經氨酸酶或試劑與閃爍體負載的珠結合。在標準的SPA檢測中，可用閃爍體-負載的珠標記神經氨酸酶，然后對放射性標記的試劑溶液進行篩選。但是，顛倒這種順序也是可能的，即將試劑與所述珠結合，然后將神經氨酸酶進行放射性標記。在珠上可合成多種試劑。在所述系統中，將負載閃爍體并用試劑涂覆的珠浸在含放射性標記的神經氨酸酶的液體中。如果標記的神經氨酸酶與標記的試劑有親和性，則二者結合，放射性標記的神經氨酸酶與珠中閃爍體的親近導致閃爍體激活并發出光。如果標記的流感病毒神經氨酸酶對試劑幾乎沒有或沒有親和性，則放射性標記與閃爍體無法足夠接近從而允許放射性衰變后發生能量轉移。由于SPA不需要洗滌步驟，因此，可以檢測相對低親和性的試劑/神經氨酸酶結合作用。在優選的實施方案中，用阻斷劑如白蛋白、洗滌劑或奶粉阻斷珠以阻斷引起非特異性吸附的阻斷位點。
在競爭型篩選方法中可以使用修改的SPA檢測，其中將神經氨酸酶固定在閃爍體-負載的珠上，然后放在含已知與神經氨酸酶相互作用之放射性標記的試劑的溶液中。然后將具有未知的神經氨酸酶親和性的試劑加入到混合物中，與固定受體的已知試劑成功競爭的任何底物都會減弱發出的光量。在Wang，PTarget Identification，Assay Development and High Throughput Screening in DrugDiscovery，in Sino-American Pharmaceutical ProfessionalsAssociation(SAPA)，The 5th Regional Symposium on DrugDiscovery and Development，1997，Kenilworth，NJ中描述了SPA在高通量篩選方法中的用途。
4．5．2 DNA阻塞檢測該系統的原理是基于在DNA構建體上存在或不存在限制酶活性和試劑-受體系統，所述DNA構建體已被合成含有單個限制位點。將所述構建體與神經氨酸酶接觸時，試劑/神經氨酸酶相互作用將阻斷酶與其限制位點的接近，從而在所述位點防止所述構建體的水解。可分離仍完整的構建體并鑒定試劑/神經氨酸酶相互作用。
下面描述DNA限制位點檢測系統。將在5’末端含生物素和在3’末端含異羥基洋地黃毒苷的單鏈DNA寡核苷酸與互補寡核苷酸退火，使退火的雙鏈寡核苷酸含一個位于中央的限制核酸內切酶位點。對互補寡核苷酸進行修飾以便含有帶一末端氨基的接頭。氨基的位置，在這種情況下位于從5’末端開始的第5個A和第6個T之間，不影響所述限制酶對雙鏈寡核苷酸的活性。所得的構建體如下，其中序列 在單鏈寡聚物合成的過程中可完成氨基的衍生，而所述氨基仍與CPG珠相連，然后用堿裂解以便從所述珠上釋放寡聚物，然后將所述寡聚物與互補的生物素-異羥基洋地黃毒苷寡聚物退火。作為連接試劑的另一種方法，可在合成互補寡核苷酸的過程中摻入衍生的堿基。
當按照本領域熟知的方法與限制位點特異性的限制酶保溫時，在所述限制位點水解衍生的構建體以得到如下兩部分 水解的混合物與鏈霉抗生物素蛋白或親和素涂覆的表面反應導致生物素標記的部分被固定，而異羥基洋地黃毒苷標記部分通過洗滌消除。固定的混合物與抗異羥基洋地黃毒苷-過氧化物酶抗體的反應提供陰性結果，因為異羥基洋地黃毒苷標記的部分已通過限制酶水解和隨后的洗滌從混合物中消除。
當將完整的試劑衍生的構建體與流感病毒神經氨酸酶混合時，具有高神經氨酸酶親和性的那些試劑將與之結合。在保溫期后，將反應混合物用適宜的緩沖液稀釋，然后用限制酶處理，接著與鏈霉抗生物素蛋白涂覆的表面保溫以固定生物素分子。試劑與神經氨酸酶間的相互作用將阻斷所述限制酶與其限制位點的接近，從而預防DNA支架的水解。 在試劑與神經氨酸酶沒有相互作用的情況下，所述限制酶將水解DNA支架并釋放所述支架的異羥基洋地黃毒苷-標記的部分。可將用抗-異羥基洋地黃毒苷抗體的標準酶聯免疫吸附檢測(ELISA)用于檢測在鏈霉抗生物素蛋白表面是否存在異羥基洋地黃毒苷。可檢測信號表明試劑與神經氨酸酶間的相互作用阻斷了限制酶與其限制位點的接近。
可以數種方式修改所述的檢測方法。首先，可將神經氨酸酶而不是試劑與DNA支架相連。其次，堿基的缺失可插入在雙鏈DNA支架的一條鏈中并可利用核酸內切酶而不是限制酶。與以前的實施例類似，試劑與神經氨酸酶的相互作用將阻斷核酸內切酶(即綠豆核酸酶或SI核酸酶)接近所述缺口，因此將抑制DNA支架的水解。可改變檢測方法的另一種是用放射性堿基標記DNA支架的3’末端而不是用異羥基洋地黃毒苷。此外，可用由肽或peptoid或任何帶有中央鍵的聚合物組成的骨架代替DNA支架，所述中央鍵可由特定的酶或者其中可通過神經氨酸酶與試劑的相互作用阻斷所述裂解的其他機制裂解。
4．5．3 熒光偏振可用于鑒定具有流感病毒神經氨酸酶親和性之試劑的另一種檢測系統是熒光偏振。熒光偏振檢測是指測量熒光-標記的化合物與未標記的生物分子的結合。以熒光偏振為基礎的檢測方法可利用分子量達約10000的熒光標記的化合物以檢測與流感病毒神經氨酸酶的相互作用。可以使用的熒光標記的化合物類型包括但不限于小有機分子、肽、小蛋白質、核酸、類脂、多糖。如果在激發和發射的過程中不發生旋轉，用平面偏振光激發的熒光分子只在固定的平面內發射光線。發射光的解偏振程度將取決于旋轉的分子數量，這又取決于分子的大小。在分子被激發與分子發射熒光的過程中，小分子比大分子旋轉更多。當標記的化合物比與其結合的未標記的神經氨酸酶小很多時，就是該檢測方法的最佳條件。未結合的小熒光-標記的化合物旋轉迅速，發射的光將被解偏振。流感病毒神經氨酸酶與熒光-標記的化合物間的相互作用將提高熒光-標記的化合物的有效大小，并由此減少所述化合物的旋轉，這將導致發射的光仍是偏振的。發射的偏振光的強度可通過在檢測器前插入可移動的偏振濾光片來檢測。在夾角成90°的平面內測量強度，并通常將強度指定為水平強度和垂直強度。在一些儀器中，激發濾光片是可移動的，而發射濾光片是固定的。在某些其他機器中，可用光纖同時測量水平和垂直強度。三個公司PanVera，BMG Lab Technologies和LJL Biosystems銷售研究級的熒光偏振儀器，而Abott提供臨床實驗室儀器。通過下列方程式確定熒光偏振值 熒光偏振值通常用1000除并表示為毫偏振單位(mP)。
5．實施例5．1 流感病毒感染的診斷5．1．1 用于診斷流感病毒的神經氨酸酶活性檢測方法在醫生的辦公室中可診斷患流感病毒樣癥狀的個體。醫生用棉簽拭個體的鼻通道，然后將棉拭接種在含N-乙酰神經氨酸、流感病毒神經氨酸酶非特異性底物的載體溶液中。臨床樣品中神經氨酸酶的存在將導致結合底物的水解。為了確保結合的非特異性底物的水解是由流感病毒的存在而引起的，將流感病毒神經氨酸酶特異性抑制劑加到所述混合物中。將流感病毒神經氨酸酶特異性抑制劑如GR 217029或GS 4104加到含結合的N-乙酰神經氨酸和臨床樣品的載體溶液中將抑制神經氨酸酶水解所述底物并檢測不到光。因此，通過加入特異性神經氨酸酶抑制劑后，可檢測信號的減弱將表明在臨床樣品中特異性存在流感病毒。
或者，通過流感病毒神經氨酸酶特異性底物診斷臨床樣品中是否存在流感病毒神經氨酸酶。在這種情況下，可改變N-乙酰神經氨酸的甘油基側鏈以提供特異性。在臨床樣品中存在流感病毒神經氨酸酶將導致特異性底物的水解并產生可檢測信號。
可將神經氨酸酶的特異性或非特異性底物與化學發光的化合物如羥苯基二氧雜環丁烷結合。在臨床樣品中存在神經氨酸酶活性的情況下，羥苯基二氧雜環丁烷結合的N-乙酰神經氨酸將裂解羥苯基二氧雜環丁烷的N-乙酰神經氨酸氧鍵，這將使二氧雜環丁烷不穩定并導致光子的發射(反應方案10)。用光電倍增管(發光計)或電子耦合器件(CCD)照相可檢測釋放的光子。為了確保所檢測的酶活性是由流感病毒神經氨酸酶引起的，可將流感病毒神經氨酸酶特異性抑制劑加到所述反應混合物中。流感病毒神經氨酸酶特異性抑制劑的加入將會抑制羥苯基二氧雜環丁烷的N-乙酰神經氨酸氧鍵的裂解并減弱產生的信號(反應方案Ⅹ)。 5．1．2 以流感病毒神經氨酸酶的存在為基礎診斷流感病毒的方法在醫生的辦公室中可診斷患流感樣癥狀的個體。醫生用棉簽拭個體的鼻通道，然后將棉拭接種在含熒光標記的特異性抑制劑如GR217029或GS4104的載體溶液中。將樣品與標記的特異性抑制劑一起保溫一段預定的時間。抑制劑與流感病毒神經氨酸酶間的相互作用將會影響用熒光偏振檢測法檢測的光的偏振。
需要確定臨床樣品的熒光偏振檢測值以評估偏振的顯著性。將臨床樣品的偏振值與由流感病毒神經氨酸酶和熒光標記的特異性抑制劑組成的陽性對照和由香豆素標記的特異性抑制劑組成的陰性對照進行比較。熒光偏振值接近陽性對照將表明所述個體感染了流感病毒。
5．2 用于鑒定新試劑的高通量檢測方法5．2．1 用于鑒定調節流感病毒神經氨酸酶的新試劑的檢測方法通過將試劑與流感病毒神經氨酸酶和標記的神經氨酸酶底物混合，可鑒定調節流感病毒神經氨酸酶活性的新的試劑。所用的底物可以是流感病毒神經氨酸酶非特異性(即N-乙酰神經氨酸)的或特異性的。不存在調節流感病毒神經氨酸酶的試劑將導致所結合底物的水解。而調節神經氨酸酶活性的試劑將會抑制神經氨酸酶水解所述底物并檢測可檢測的信號。
可將神經氨酸酶特異性或非特異性底物與化學發光化合物如羥苯基二氧雜環丁烷結合。存在流感病毒神經氨酸酶活性的情況下，羥苯基二氧雜環丁烷結合的N-乙酰神經氨酸將裂解羥苯基二氧雜環丁烷的N-乙酰神經氨酸氧鍵，這將使二氧雜環丁烷不穩定并導致光子的發射。用光電倍增管(發光計)或電子耦合器件(CCD)照相可檢測釋放的光子。與流感病毒神經氨酸酶的活性位點相互作用或與流感病毒神經氨酸酶非競爭性相互作用的試劑將會抑制羥苯基二氧雜環丁烷的N-乙酰神經氨酸氧鍵的裂解并將減弱所述信號。
5．2．2 用于鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用的新試劑的檢測方法通過將熒光結合的流感病毒神經氨酸酶與試劑混合，可鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用的新試劑。將所述試劑與熒光標記的神經氨酸酶一起保溫一段預定的時間。所述試劑與流感病毒神經氨酸酶間的相互作用將會影響用熒光偏振檢測法檢測到的光的偏振作用。
需要確定檢測到的所述試劑的熒光偏振值以評估偏振作用的顯著性。將所述試劑的偏振值與由流感病毒神經氨酸酶和與神經氨酸酶相互作用的已知試劑組成的陽性對照和由熒光標記的流感病毒神經氨酸酶組成的陰性對照進行比較。與陽性對照接近的熒光偏振值將表明所述試劑可與流感病毒神經氨酸酶相互作用。還可用與熒光染料結合的試劑完成該檢測，不同于與熒光染料結合的流感病毒神經氨酸酶。
可利用其他檢測系統例如DNA支架阻塞檢測確定流感病毒神經氨酸酶與試劑間的相互作用。此外，在這些檢測系統中，可將試劑或流感病毒神經氨酸酶與放射性堿基或化學發光化合物結合。流感病毒神經氨酸苷酶或試劑與放射性堿基結合時，通過γ計數器或閃爍計數器可檢測它們之間的相互作用。此外，當用化學發光化合物標記一種或另一種時，可用發光計檢測試劑與神經氨酸酶間的相互作用。
本發明不限于所述具體實施方案的范圍，所述實施方案只是作為本發明每個方面的單個說明。實際上，除本文所列和所述的那些外，參照前文描述和附圖
，本發明的各種修改對于本領域技術人員是顯而易見的。所述修改也在本發明范圍內。
本文所引入的參考文獻均全文引入本文作為參考。
權利要求
1．檢測和/或診斷流感病毒感染的方法，包括(a)將生物樣品與化學發光標記的流感病毒神經氨酸酶特異性底物接觸；和(b)通過化學發光信號的產生檢測底物的酶處理，其中信號的產生表明流感病毒的存在。
2．檢測和/或診斷流感病毒感染的方法，包括(a)將生物樣品與化學發光標記的流感病毒神經氨酸酶非特異性底物接觸；(b)將流感病毒神經氨酸酶特異性抑制劑加到反應混合物中；和(c)通過化學發光信號的產生檢測底物的酶處理，其中信號的減弱表明存在流感病毒。
3．檢測和/或診斷流感病毒感染的方法，包括(a)將生物樣品與化學發光標記的流感病毒神經氨酸酶非特異性底物和流感病毒神經氨酸酶的特異性抑制劑接觸；和(b)通過化學發光信號的產生檢測底物的酶處理，其中信號的減弱表明存在流感病毒。
4．檢測和/或診斷流感病毒感染的方法，包括(a)將生物樣品與熒光標記的流感病毒神經氨酸酶特異性抑制劑接觸；和(b)通過熒光信號的產生檢測神經氨酸酶的存在，其中信號的產生表明存在流感病毒。
5．權利要求4的方法，其中信號的產生通過熒光偏振檢測。
6．權利要求1、2、3或4的方法，其中通過用棉拭子揩擦或抽吸個體的鼻通道或咽來得到樣品。
7．權利要求1、2、3或6的方法，其中在檢測中使用適宜的陽性和陰性對照。
8．權利要求1、2或3的方法，其中將底物與化學發光化合物的前體結合。
9．權利要求2、3或4的方法，其中神經氨酸酶特異性抑制劑是藥物、配體(天然或合成的)、肽、糖蛋白、蛋白質、多糖、糖或無機分子。
10．權利要求1、2、3或4的方法，其中所述生物樣品是從表現出流感病毒感染癥狀的個體中得到的臨床樣品。
11．權利要求4的方法，其中熒光化合物是4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-對稱引達省-3-丙酸、熒光素、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二醛、fluoroescamine或香豆素。
12．用于鑒定調節流感病毒神經氨酸酶活性的新試劑的高通量檢測方法，包括(a)在存在待測試劑的條件下，將化學發光標記的流感病毒神經氨酸酶底物與流感病毒神經氨酸酶接觸；和(b)通過化學發光信號的產生檢測底物的酶處理，其中所述信號的減弱表明所述試劑是流感病毒神經氨酸酶的抑制劑。
13．用于鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用的新試劑的高通量檢測方法，包括(a)將化學發光標記的待測試劑與流感病毒神經氨酸酶接觸；和(b)通過化學發光信號的產生檢測神經氨酸酶與試劑的相互作用。
14．用于鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用的試劑的高通量檢測方法，包括(a)將化學發光標記的待測試劑與流感病毒神經氨酸酶接觸；和(b)通過化學發光信號的產生檢測神經氨酸酶與試劑的相互作用。
15．權利要求14的檢測方法，其中信號的產生通過熒光偏振檢測。
16．權利要求12、13或14的檢測方法，其中標記待測試劑而不是流感病毒神經氨酸酶。
17．權利要求12、13或14的檢測方法，其中所述試劑是藥物、配體(天然或合成的)、肽、糖蛋白、蛋白質、多糖、糖或無機分子。
18．權利要求12、13或14的檢測方法，其中所述底物是流感病毒神經氨酸酶特異性或非特異性的。
19．權利要求12、13或14的檢測方法，其中使用純化的流感病毒或純化的流感病毒神經氨酸酶。
20．權利要求12、13或14的檢測方法，其中檢測系統包括(a)將帶有可裂解位點的支架與流感病毒神經氨酸酶接觸，其中試劑與神經氨酸酶間的相互作用將阻斷所述支架的可裂解位點以便產生可檢測信號；和(b)將特異性催化劑加到混合物中，其中不存在相互作用將導致所述支架的裂解以致不產生可檢測信號；和(c)基于可檢測信號的產生，鑒定流感病毒神經氨酸酶與試劑間的相互作用。
21．權利要求20的檢測方法，其中所述支架是雙鏈DNA、多肽或任何聚合物。
22．權利要求21的檢測方法，其中DNA支架中的可裂解位點是由核酸內切酶或限制酶位點識別的。
23．用于檢測和/或診斷樣品中流感病毒神經氨酸酶之存在的試劑盒，包括(a)化學發光標記的神經氨酸酶底物或抑制劑；和(b)用于檢測神經氨酸酶與樣品中底物結合的裝置。
24．權利要求23的試劑盒，其中所述底物是神經氨酸酶特異性的底物。
25．權利要求24的試劑盒，其中所述抑制劑是神經氨酸酶特異性的。
26．藥物組合物，含有在可藥用載體中的用權利要求12、13或14所述的檢測方法鑒定的抑制流感病毒神經氨酸酶活性的試劑。
27．藥物組合物，含有在可藥用載體中的用權利要求12、13或14所述的檢測方法鑒定的與流感病毒神經氨酸酶相互作用的試劑。
28．權利要求26的藥物組合物，其中所述試劑是藥物、配體(天然的或合成的)、肽、糖蛋白、蛋白質、多糖、糖或無機分子。
29．施用權利要求27的藥物組合物用于治療因流感病毒感染導致的疾病。
全文摘要
本發明包括通過評估流感病毒神經氨酸酶的存在來檢測和診斷流感病毒感染的快速、特異性的檢測系統。本發明還包括用于鑒定調節流感病毒神經氨酸酶活性的新試劑的快速、特異性的高通量檢測系統。本發明還包括用于鑒定與流感病毒神經氨酸酶相互作用的新試劑的快速、特異性的高通量檢測系統。
文檔編號G01N33/566GK1285003SQ98813706
公開日2001年2月21日 申請日期1998年12月18日 優先權日1997年12月18日
發明者D·L·赫夫納, C·M·澤普, P·D·魯斌 申請人:塞普拉科有限公司