專利名稱：連續式高處理量篩選的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用了至少一種多孔基質的連續式高處理量篩選方法(Continuous format high throughput screening，CF-HTS)，該方法使得制藥工業能夠同時對大量生物學或生化活性分布廣泛的化學實體進行篩選。此外，CF-HTS也可用于進行多步驟的檢測實驗。
背景技術：
生物學和生物化學檢測實驗的設計是為了對各種各樣系統的活性進行測試，其中包括從蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小分子-蛋白結合到細胞功能。在“高處理量篩選方法”(HTS)中應用了這些檢測實驗測試大量化學實體以探索這些化學實體先前未知的生物學或生物化學功能。
一步(homogenous)和多步(heterogeneous)檢測實驗所有不同種類的生物學檢測實驗都可歸成兩個大類一步檢測實驗和多步檢測實驗。在一步檢測實驗中，同時加入所有的試劑，并測量或解釋結果而無需另外的操作。例如，在皮氏培養皿中培養的細胞可用化學物質處理。如果化學物質對細胞是毒性的可通過簡單地觀察變清澈的區域而判斷毒性。另一個例子是可以使用表達蛋白的細胞，所有表達蛋白能改變該細胞的顏色。生長于含X-gal瓊脂上的表達β-半乳糖苷酶(β-gal)的細胞這個例子中，根據β-gal蛋白表達量的不同細胞會不同程度地變藍。因此對于任何影響報告基因，如β-半乳糖苷酶基因表達的生物學過程，可設計一個一步檢測實驗。一步檢測實驗的另一例子是利用一種在酶的作用下改變顏色或熒光的底物。最后，如Amersham的鄰近閃爍檢測(Scintillation Proximity Assays，SPA)，這樣的技術能直接測量放射性標記的配基與固定到含閃爍劑小珠上的蛋白或任何配基結合物質的結合。以上所有的例子都是一步檢測實驗的例子，因為它們除了在最后的探測、測量或讀取信號之前加入試劑外不需要任何另外的步驟。
另一方面，多步檢測實驗需要至少兩個不能合并成一步的步驟，因為這些步驟不同程度上固有地不相容。例如，許多多步檢測實驗要求按一定的順序加入試劑(例如一些試劑將影響前面的步驟，但對于完成后面的步驟又是必須的)。這種情況的常見例子包括需要加入信號顯示試劑以間接地報告反應產物的存在或濃度的檢測實驗。在多步檢測實驗中另一常見的步驟是洗滌步驟。在檢測實驗前期步驟中通常需要加入過量檢測試劑，但在隨后的步驟中需要洗去以便隨后進行的實驗不會出現過高的背景信號。例如，在放射性配基結合實驗中，首先將標記的配基與結合到固相表面上的蛋白溫育，但這些配基中只有一小部分真正結合有限的蛋白位點。溫育后，在能準確測量結合的放射性配基之前，必須將過量的未結合配基洗去。洗滌可通過多種供選的方法完成，包括過濾、重復洗滌／倒干、沉淀／分相和／或離心。
許多生物學和生物化學過程只能通過多步檢測方法測量。進而，盡管存在通過調整其他生物學或生物化學過程使之適合一步法的途徑，但使用多步法可使這些其他過程更有效地發揮作用，或可以使用更容易得到的試劑進行操作。給出的多種一步檢測技術的方法和試劑盒如SPA(Amersham)，熒光極化(Jolley公司和其它公司)和時間分辨熒光技術(Packard公司和其它公司)中只有少數是可由商業途徑獲得。而且，使用這些方法總是需要更多的費用和時間。對于多數檢測而言，多步法可以更好地建立，并且更易于快速顯示結果。因此，多步法，如ELISA、過濾結合、RIA、熒光素酶細胞檢測實驗等等的應用仍然很廣泛。下文將就這些方法中的一些做法更為詳細地描述。
高處理量篩選(HTS)多年以來，制藥工業越來越依賴于篩選化合物庫的HTS以發現候選藥物。HTS是指一種平行測試許多離散化合物以便同時或幾乎同時篩選大量測試化合物的生物學活性。目前，使用最廣泛的方法采用了96孔微量滴定板。在這種方式中，在一塊含96個反應孔的8cm×12cm的塑料板上同時進行96個獨立的測試。這些孔要求的檢測容量通常為50-500μl。對于許多一步和多步檢測實驗而言，除了板外，還可從商業途徑獲得多種與這種96孔板方法配套的儀器、材料、移液器、機器人、洗板機、和讀板儀等等。
迄今為止，改進HTS的努力集中于使孔更小(小型化)。因為如果減小孔的大小就可以增加每塊板上孔的數量，從而提供更多的平行測試。進而，通過減小檢測實驗的體積可以減小每次測試的試劑費用。進而，因為可以更小的體積進行更多的平行測試，從而可以同時測試更多化合物以發現候選藥物。目前為止，通過提供384孔(96×4)的方式稍稍改進了96孔技術。參見Comley et alJ．Biomol．Screening，vol．2(3)，pp．171-78(1997)。事實上，密度更大的方式已有報道，包括9600孔的方式。但是，小型化必然會帶來費用和復雜性的問題。
這些費用和復雜性問題與使篩選方式小型化的三個主要部分直接相關。首先，必須能使測試容器(管、孔、凹窩等等)小型化。其次，必須能將所有必需的測試試劑精確地分加到更多且更小的孔中(通常通過液體處理機器人加入到多個孔中而完成)。第三，必須能從高密度的排列“讀取”測試結果。
就平行獨立檢測實驗的要求而言，各種部分都挑戰或限制著多大程度上小型化是可行的，或在費用上是有效的。例如，一種新的更小型的方式可能需要完全不同的分加試劑的方法，或需要分辨率、靈敏度、和工程技術上與新的小型化方式相容的讀數儀器。如果減小了每個孔的大小，那么制造容器陣列、分加更小量試劑和每個測試樣品的讀數變得更困難，更消耗時間并更昂貴。并且，由于分加更小體積的試劑和測量更弱的樣品信號時固有的不準確性，更小的樣品量也將增加樣品與樣品之間的統計可變性。進而，當樣品量減小到一定水平以下時，諸如蒸發和表面張力這樣的因素甚至給實施新的小型化方式增加了更高的費用和更大的復雜性。
對于HTS技術在量上的進步，制藥工業急切需要“自由式檢測實驗”或在樣品之間無物理隔離的可能。這種技術通常被想象為在沒有任何孔的情況下測試小液滴，但真正用常規的離散化合物匯集進行自由式的HTS檢測還未見報道。
組合文庫的篩選-膠滲入方法隨著組合化學的到來，可以在固相支持物(通常為小珠)上迅速生產以百萬計的化學實體。盡管96孔方式正被用于篩選基于小珠的文庫，但是這種方式通常被認為效率不高，因為(1)每個小珠只帶有小量的化學實體；(2)待測試的化合物數量極其大；(3)將小珠加入96孔微孔板的操作很困難。
為了避免用96孔方式篩選組合文庫時固有的問題，有些人報道了可被稱為“自由式”的簡單一步檢測法的應用。舉個例子，Jayawickremeet al在Proc．Nat’l Acad．Sci．(USA)，vol．191，pp．1614-18(March，1994)中報道了在組合肽庫的一個簡單一步檢測中使用了色素細胞(黑色素細胞)。根據作者，他們將細胞放在有蓋培養皿中的瓊脂下，然后將帶有組合化合物的小珠放在瓊脂的表面上，讓化合物從小珠上部分釋放到瓊脂中。活性物質表現為黑色區域，因為當化合物局部擴散到凝膠介質中時，該活性物質使細胞改變顏色。
另一個最近的例子是Daniel Chelsky在Philadephia，PA的生物分子篩選協會第一屆年會(First Annual Conference of The Society forBiomolecular Screening)(1995年11月7-10日)上報道的“組合文庫篩選策略傳統方法和新方法”。Chelsky在瓊脂凝膠中放置了一種檢測羰基脫水酶的簡單一步檢測法，使得凝膠中的這種酶能使整個凝膠變色。隨后，加入通過光敏連接而帶有組合化合物的小珠加入到凝膠中，并通過紫外線部分釋放化合物。抑制酶活性的化合物表現為顏色改變較少的局部抑制區。最后在Molecular Diversity v 2，PP 57-64(1996)中Salmon等人報道了一種類似Jayawickreme等人的方法，其中組合化合物文庫是用于篩選對生長在瓊脂上的癌細胞具有細胞毒效應的化合物。
所有的三個例子都是抗細菌或抗癌物質的久經試驗的凝膠檢測的變體，它們還與熟悉的在凝膠中測量抗原／抗體反應的免疫學檢測實驗類似。盡管這些凝膠滲入檢測實驗非常適合篩選基于小珠的組合文庫，還沒有人報道將這種方式擴展到多步檢測實驗或不基于小珠的文庫。常識阻礙研究者以連續的方式測試樣品，因為這種方式會使樣品混合。在報道的有限種檢測實驗和對以連續方式檢測時多種樣品會混合在一起的關注中，只有基于小珠的文庫檢測測試。由于這些限制，研究者相信96孔方式更適于多步的和不基于小珠的文庫篩選。在自由方式裝置中進行多步檢測將是合乎需要的。進而，在自由方式設置中測試離散化合物將是合乎需要的。
發明概述在此描述的發明，連續式高處理量篩選(CF-H)，成功地補充了任何能在96孔方式中完成的一步或多步檢測實驗的自由方式的概念。此外，CF-HTS還可用于通過多步檢測，而不僅僅是一步檢測，篩選組合文庫。進而，CF-HTS能檢測離散復合物并能同時避免小型化帶來的費用和復雜性問題。化學試劑和測試結果在后續的步驟中可能混在一起的擔心被證明是沒有根據的。
本發明的一個實施例涉及通過以下方法測試樣品的生物學或生物化學活性a)．將多種待測樣品引入到多孔檢測基質中，多孔檢測基質可供選地含有一種或多種檢測組分；b)用至少一種基質引入一種或多種檢測組分進行檢測，其中該基質可以是也可以不是多孔檢測基質；以及c)進行以下步驟ⅰ)．洗滌檢測中使用的任一基質以除去過量的待測樣品、檢測組分或其組合。
ⅱ)．將檢測中使用的任一基質與溶于溶液中或液體形式的另一種試劑接觸。
另一實施例涉及通過將多種待測樣品引入到多孔檢測基質中，多孔檢測基質可供選地含有一種或多種檢測組分，測試樣品的生物學或生物化學活性，并使用至少兩種另外的基質進行檢測實驗。
而另一實施例涉及將96種以上的待測樣品引入到多孔檢測基質中，多孔檢測基質可供選地含有一種或多種檢測組分；同時測試96種以上待測樣品的生物學或生物化學活性。
附圖簡述
圖1示明在非多孔基質上的gELISA待測樣品與含檢測試劑的多孔膠基質的一側接觸，該檢測試劑再順次與含另一種檢測試劑的非多孔基質接觸。
圖2示明除去gELISA測試樣品基質和多孔膠基質，然后通過洗滌和加入液體或溶液形態的試劑以在非多孔基質上形成受體復合物。
圖3示明通過將受體復合物基質與含受體底物的多孔膠基質接觸而顯現gELISA的結果。
圖4示明配基基質是怎樣被施加到濾器上的與帶有細胞一面相對的那一面上。
圖5示明當顯現檢測結果時，帶細胞的濾器表面可能產生的現象。
圖6顯示使用不同濃度的已知劑量依賴性抑制劑檢測VanA時的結果。
圖7示明用不同濃度已知抑制劑檢測EF-3的結果。
圖8示明蛋白-蛋白相互作用的gELISA檢測對照實驗的結果。
圖9示明“抑制”蛋白-蛋白相互作用的gELISA結果。
圖10顯示放射性標記的ITAM對固定的LCK的結合具有劑量依賴性。
圖11將象素值對ITAM濃度作圖顯示出典型的受體-配基結合曲線。
圖12示明放射性標記的IL-8的配基-細胞結合的對照實驗。
圖13示明對IL-8配基-細胞相互作用的“抑制”。
圖14示明一個神經氨酸酶抑制劑的檢測實驗。
圖15示明同時檢測10，080個離散化合物對神經氨酸酶的抑制。
發明詳述在CF-HTS之后的中心思想是將待測樣品置于一個多孔介質的環境中。該方法包括將一種或多種檢測組分放在基質如凝膠、塑料片、濾器或易于操作的其它固體支持物之上或之中或底部。當樣品被引入到多孔基質后，它們的擴散足夠緩慢從而使得可進行檢測實驗而不會導致待測樣品混合在一起。因此，CF-HTS是通過擴散，而不是通過不可滲透的障礙分開樣品。如果檢測實驗進行得太久那么測試樣品和結果最終會混合在一起。然而，如果仔細控制時間的話，CF-HTS允許同時但各自獨立地篩選高密度的化合物而不需往每個單獨的孔或容器里加溶液或檢測組分。進而，通過對帶有反應組分的基質的操作，甚至可以用這種方式進行復雜的多步檢測實驗。通過對基質的操作進行多步檢測實驗是完全沒有先例的，它使得CF-HTS在廣泛的生物學和生物化學過程的篩選中與96孔方式具有同樣的靈活性。進而，CF-HTS達到了小型化所預期的長處而沒有其缺點，并具有獨特的優點。
CF-HTS可應用多種基質和檢測組分。基質包括，但不限于，由瓊脂糖、丙烯酰胺或其它凝膠狀物質組成的凝膠、膜、濾器、塑料等等。基質的材料組成包括，但不限于，聚苯乙烯、聚丙烯、其它塑料、紙纖維、玻璃、玻璃纖維、硅膠、聚碳酸酯、聚酯、聚偏氯乙烯和聚乙烯。基質可以是不滲透的固體、多孔固體如濾器、或凝膠。檢測組分包括，但不限于，大分子如核酸、蛋白、和其它合成或天然大分子；細胞，細胞裂解液、生物抽提物、有機體和其它復雜生物實體和混合物；以及小分子如緩沖劑、鹽、抑制劑、底物、多肽、染料、核苷酸、輔助因子、離子和溶劑。
CF-HTS檢測實驗是指通過擴散而非通過不可滲透的障礙將多個待測樣品或化合物隔離開的檢測實驗。重要的組成步驟是將多個(一個以上)待測樣品引入到供選地含有一種或多種檢測組分的多孔檢測基質之中或之上。含有檢測組分的多孔檢測介質是通過將組分添加、混合、倒入、分配、或浸泡加入基質制備而成的。還可將檢測組分偶聯、覆蓋、結合、固定、連接、交聯、或附接到基質中或基質的表面上而制備多孔基質。進而，可通過在一層細胞、酶或其它固定的檢測組分上形成一層液體或溶液薄膜而制備多孔基質。多孔檢測基質被用于控制組分加入的順序和／或持續時間，以及控制多種組分聯合使用時混合和擴散的程度。
CF-HTS也可使用非多孔基質。非多孔基質是通過將檢測組分或待測樣品偶聯、覆蓋、結合、固定、連接、交聯、或附接到非多孔基質的表面上而制備的。在CF-HTS中，非多孔基質的應用在空間上固定了一種或多種檢測組分。
當將檢測組分引入到基質表面時，檢測組分與經過非衍生化、衍生化或其它預處理以促進檢測組分結合的基質通過共價或非共價的、特異或非特異的相互作用結合在一起。結合后，檢測組分在空間上被固定從而滿足檢測實驗對固定化的需要。在這種情況下或者待測樣品應能擴散通過基質到達檢測組分，以及／或者檢測組分的亞組分或產物應能擴散通過基質到達測試樣品。
至少一種含待測樣品的多孔基質被用于以下步驟中的任何一步或多步。
(1)使多孔基質的表面與至少一種其它(多孔或非多孔)基質接觸，使得樣品和／或一種或多種檢測組分能擴散通過界面。
(2)分開兩種或多種基質以停止組分和／或樣品的反應。
(3)使兩種或多種基質的表面接觸，使得檢測組分能反應。
(4)用緩沖液或其它溶劑洗滌、漂洗或洗脫基質以除去未結合和／或非特異性結合的檢測組分。
(5)將溶液中的檢測組分分配、倒入、加入或浸泡入基質或將上述組分過濾通過基質。
(6)通過顯象、讀數、掃描、探測或其它方法，顯現一種或多種基質中的放射性測定的、熒光的、分光光度法的或電磁的信號。
CF-HTS提供了許多超過先前技術的優點。由于沒有明顯的孔，從而無需同時并準確地將檢測組分或試劑分加入孔中。替代地，檢測組分是通過一步大量處理進行分加和混合的。由于檢測組分是制備成均一大量的溶液或基質，所以樣品之間的統計學差異被減小到最小。與之相比，96孔方式中存在的孔產生了很大的樣品間差異。
進而，CF-HTS提供了大量化合物的極高密度的篩選。盡管觀察到的選中樣品在有限程度上“混合”在一起，但只需要對選中樣品的鄰近樣品進行再次測試。這樣如果能將10，000個測試樣品減少到顯現區域周圍的50個候選樣品，甚至就可通過96孔技術從50種候選樣品中很容易地篩選到活性化合物。
通過在塑料片上將離散化合物分配并干燥成高度密集的排列，然后對其進行CF-HTS，就可致力于所有小型化的關鍵點。這種方式不需要對塑料和其他材料做任何改進就可實現小型化，因為小型化是簡單地通過限制擴散到基質中的樣品量而實現的。這種方式也不需要通過微量流量控制來分加反應試劑，因為整個檢測實驗實質上是在“一個大孔”里進行的，在這里試劑和溶液都是以批量的方式進行操作的。只有待測樣品需要通過微量流量控制分加。而且，這種方式存在的統計誤差也小得多，因為實驗者只需要在均一的基質中尋找出不均一的固定區域。實驗者并不需要讀取和比較不同的孔。除了小型化預期的所有優點外(費用、處理量、試劑用量、待測化合物用量)外，CF-HTS還提供了驚人的長處，如以批量的方式操作檢測實驗的大多數步驟。
CF-HTS的一個中心特點是盡管在基質的界面檢測組分和待測樣品也不會快速地側向擴散。例如，當瓊脂糖凝膠被放在塑料板上時，在凝膠的交界表面上有大量的液體。當需要凝膠上的檢測組分和板上的檢測組分相互作用時(例如在ELISA的例子中)，凝膠中的組分能從凝膠擴散到板上是很關鍵的。但是，CF-HTS要求伴隨的側向擴散相當慢，以使板上的反應發生在凝膠中組分的初始位置附近。同樣的原則也適用于凝膠之間、濾器之間或任何組合形式的表面之間(或任何其它基質)的基質-基質界面。意識到這種擴散行為是可控制的并通常適用于任何基質界面是沒有先例的，并與常識相反。
將待測樣品或化合物引入到基質中(如凝膠或潤濕的濾器)的一種優選方法是將小體積的每種樣品分配到一個表面上，如塑料片的表面上，形成排列并干燥，從而使得沒有兩個樣品混合或重疊，并且每個處于特定的位置。當塑料片被放到基質上時，樣品溶解并擴散到基質中，其位置與它們在初始排列中的預定位置相對應。
將樣品分加到排列中的一種替代方法是將樣品分加到多孔基質如濾器上形成排列，每種樣品的分加體積足夠小以使得樣品不會在基質中重疊。在與另一種含有更多液體的基質接觸后化合物擴散并啟動檢測實驗。
一種將基于小珠的組合化合物引入基質的優選方法是將小珠隨機地分加到一個表面上，如一個塑料片的表面上，或在表面上形成有序排列。如果待測化合物是以不穩定的連接共價吸附到小珠上的話，那么隨后小珠從中釋放(切割)出待測化合物(光切割以及氣-相酸切割)為本領域所熟知。然后每種化合物非共價地結合到其來源小珠所在的區域，然后干的化合物可被引入到基質之中或之上。
一種將離散化合物引入基質的替代方法是通過浸泡或其它方法使每種化合物非共價吸附到小珠之中或之上。利用這種方法可以使大量的化合物在小珠中一次混合同時每個小珠具有單一的化合物。然后可很容易地將小珠分散到一個表面上以引入到基質中。這種方法完全不需對小體積液體進行操作。
在CF-HTS篩選中，引入到基質中的樣品初始排列是高度密集的，以使得特定的活性區域在空間上覆蓋了一種以上樣品的初始區域，然后這些樣品中的每種都是觀察到的活性的潛在來源。對于更高的初始密度而言，每個區域將具有更多的候選樣品，因為在一個特定區域內將具有多種樣品。化合物可能擴散到一起，但它們仍然具有它們自身空間上的梯度，并且數量上不會在任何一個位置混合。因此，區域的中心將仍然與活性化合物在初始排列中的精確位置對應。實際上，被選中的樣品是很稀少的，這足以使得為確保從每個活性區域中鑒定出活性化合物而對多個樣品進行再測試的工作量是微不足道的。
本發明的一個替代實施例是在檢測的基質中引入物理障礙(從而嚴格上說使得此方式不連續)以限制樣品能擴散的距離。例如分別含有一種酶和底物的兩塊凝膠可被分別切成網眼狀(“蛋糕切割器”，cookie-cutter)，使得每塊凝膠被分成離散的區域。然后仍讓這兩塊凝膠接觸，使得酶和底物在分割后的凝膠塊中擴散到一起。然后將待測樣品引入到分割后的凝膠塊中從而使得檢測實驗是完全獨立的，在檢測與檢測之間沒有擴散。由于測試樣品之間引入了統計差異，并且由于固定了體積從而限制了信號的高度密集排列，因而這個實施例明顯地喪失了CF-HTS的一些優點。但是，此實施例仍然具有基于凝膠的多步檢測實驗的優點，它不需要往大量的平行反應容器里分加檢測組分，并且它消除了樣品的部分混合現象。
gELISA酶聯免疫吸附檢測實驗(ELISA)是探測溶液中的配基與固定的受體之間相互作用的多步檢測實驗。ELISA需要多次的混合和洗滌步驟，這些在96孔方式中難以進行，可以想象將96孔方式變成384孔方式時困難更大。發明者將CF-HTS方法應用于檢測對配基和固定的靶受體之間結合的抑制(gELISA)。
受體是能結合另一分子的任一分子。非限制性的例子包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物以及以上例子的復合物。受體被固定到幾種可能的基質中的一種(受體基質)的表面上，包括但不限于具有高靶結合容量的塑料表面(例如有蓋平皿或塑料板(源自Nunc))、膜或濾器(例如硝酸纖維素、尼龍或PVDF(Millipore，Corning Costar，Schleicher&Schuell，BioRad)或衍生的膜如SAM膜(Promega))。多孔配基基質(如瓊脂糖凝膠或多孔膜)的制備，使得固定受體的配基可被加入到基質之中或之上。待測化合物或樣品被直接分加到配基基質上或替代地被加入到待測樣品基質(例如聚苯乙烯(Tekra)、聚偏乙烯(例如源自Dow Brands的)或其它柔性塑料片或膜)上。在適當時間的溫育之后，將配基基質與受體基質接觸，使得配基與樣品通過擴散和受體接觸并發生可能的反應。(圖1示明固定受體R結合生物素標記的配基Lβ)。在溫育中，除非樣品化合物抑制配基／受體的結合，配基將結合到固定的受體上。
在適當時間的溫育之后，將受體基質移開并用適當的緩沖液洗滌以除去未結合的和非特異性結合的配基和樣品。然后將受體基質浸泡在含能與配基反應的檢測試劑的溶液中(例如一種抗體、在生物素標記的配基的情況下的親和素或鏈霉親和素)，從而能直接(例如通過熒光或放射性)或間接(例如辣過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶)地檢測(圖2顯示結合到生物素標記配基上的一種親和素-HRP標記物，AHRP)。在適當的溫育后，從溶液中移開受體配基并洗滌以除去未結合的和非特異性結合的試劑。在直接信號探測中，基質用適當的方法顯象(例如分光光度掃描儀，CCD照相機、膜、磷光顯象儀或閃爍探測裝置)。非直接信號(如HRP或AP)需要另外的反應來顯現信號，這是通過將底物或其它必需的反應組分分加到多孔底物基質之中或之上，并使此基質與受體基質接觸而完成的。然后酶(例如HRP或AP)與底物(圖3)反應。替代地，可將可沉淀的底物引入到溶液中代替基質。通過任何可視方法，受體／配基結合區域將產生可見的反應，而受體／配基結合受抑制的區域將不產生可見的反應。
細胞／配基結合CF-HTS也能用于探測對配基／細胞受體結合的抑制。在傳統檢測實驗中，實驗者在一個容器，如孔中混合待測化合物、放射性標記配基和表達相應受體的細胞。然后提供充分的時間使受體結合配基，如果這樣的結合不被測試化合物抑制的話。任何未結合的或非特異性結合的組分都被從細胞上除去，然后測量與細胞結合的放射性的量。本發明者將采用CF-HTS方法來探測對配基和受體結合的抑制。將表達所需受體的細胞生長在或鋪到基質上(細胞基質)，例如，但不限于，凝膠、濾器或膜(例如Transwell組織培養膜(Corning Costar)或化學向性膜(NeuroProbe))。制備一種多孔基質(如瓊脂糖凝膠或多孔膜)使得受體的標記配基被分配到基質之上或之中(配基基質)。待測化合物或樣品被直接分加到配基或細胞基質之上，或替代地分加到另一基質(例如聚苯乙烯(Tekra)、聚偏乙烯、或其它柔軟塑料片；樣品基質)之上或之中。使樣品基質與配基基質接觸使得樣品擴散到配基基質上。在適當時間的溫育之后，將該配基基質與細胞基質接觸，優選地在無細胞的一側接觸，并使得配基和樣品通過擴散與受體接觸并反應。除非樣品抑制配基／細胞結合，否則在溫育過程中，標記配基將結合到固定的細胞上。
溫育后，將細胞基質從配基基質分開，并用適當的緩沖液洗滌以除去未結合的或非特異性結合的配基和樣品。細胞用恰當的方法顯象(例如分光光度掃描儀，CCD照相機、膜、磷光顯象儀或閃爍探測裝置)(圖5示明在一張膜上顯現檢測結果)。
如上所述，CF-HTS能夠實現“自由方式”檢測實驗預期的全部優點，并能在所有不同類型的方式下，用不同的試劑和裝備，應用于所有不同類型的生物學或生物化學檢測實驗。由于其廣泛的應用性，在以下的實施例中得到了最好的闡明。然而，盡管這些實施例闡明了本發明的優選實施方案，但它們并不限制權利要求或說明書。本領域的普通技術人員很容易理解到，可以在不離開本發明的精神和范圍的前提下對特定的實施例進行變化和修改。最后，所有參考文獻在此引入作為參考。
實施例實施例1用于探測由萬古霉素抗性酶VanA產生的磷酸根的兩步比色法凝膠檢測實驗。
VanA是萬古霉素抗性中的關鍵酶，它催化D-丙氨酸和D-丙氨酸或D-丙氨酸和D-乳酸的連接。通常這種酶是通過使活性酶釋放的磷酸根產生顏色而進行檢測(VanA活性將ATP水解成ADP和磷酸根)。科學家已知D-環絲氨酸以劑量依賴的方式抑制VanA，并將這種抑制劑作為其它潛在抑制劑的陽性對照。
酶凝膠酶凝膠的制備是通過在45℃下往溶于50mM HEPES(N-[2-羥基乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]) 20 mM MgCl2，20mM KCl，pH7．3中的熔融的1％瓊脂糖凝膠中加入VanA至終濃度2μM。然后將這種瓊脂混合物倒入到BioRad凝膠成型裝置中，使之在2-8℃凝固30分鐘。
底物凝膠底物凝膠的制備是通過往熔化的瓊脂中加入ATP、D-丙氨酸、D-乳酸使它們的濃度分別達到1mM，1．5mM和1．75mM，然后按照酶凝膠的方法制備。
樣品基質一系列順序稀釋的5000，2000，1000，500，200，100μM的D-環絲氨酸，一種作為對照的抑制劑，溶于1∶1乙醇-水中，取1μl小樣分加到一片聚偏氯乙烯(PVDC)膜上并干燥10分鐘。
將酶與底物在抑制劑的存在下溫育讓酶凝膠與樣品基質接觸5分鐘。然后將底物凝膠放在酶凝膠的頂部并溫育15-20分鐘。隨后將兩塊凝膠分離開。在溫育過程中，可預期由于該酶催化底物的連接在整塊凝膠中產生磷酸根，只有D-環絲氨酸的濃度足以抑制反應的區域例外。
檢測結果的觀察將由溶于1．33N HCl的0．15％孔雀綠和1．4％鉬銨酸組成的新鮮制備磷酸根檢測試劑倒入，并使之均一地分配到酶和底物凝膠上。這些試劑與磷酸根反應，隨著磷酸根濃度的濃度升高綠色背景加深。顯色5-10分鐘(圖6示明在凝膠上的顯色，其中抑制劑的量為從5納摩爾到0．5納摩爾)。用Stratagene Eagle Eye CCD相機對綠色的凝膠照相。如所預期的那樣，看上去不那么綠的抑制區域與加入的抑制劑的濃度相對應。因此，通過將組合小珠或化合物分加到任何其它表面然后使之與檢測凝膠接觸，這種檢測實驗可用于篩選VanA的抑制劑。
這個檢測實驗還表明凝膠篩選方式可用于多步反應。此特征對于這種方式在廣泛的檢測實驗中的應用是必需的，因為許多檢測實驗需要進行許多步驟。在這個例子中，VanA檢測實驗是在兩步酶活性測試后進行顯色反應。此實驗的一步(單一步驟)法方式是難以實行的，因為顯色的試劑和條件干擾VanA的活性，并且與在瓊脂凝膠中傳送不相容。因此，在空間和溫度上將這兩個步驟分開，首先進行酶凝膠實驗然后進行溶液相的顯色反應是合乎需要的。
實施例2．用于檢測由核糖體激活的啤酒糖酵母延伸因子3的ATP酶活性產生的磷酸根的一種兩步法凝膠實驗當真菌延伸因子3(EF-3)與核糖體相互作用時，磷酸酶活性被激活。本發明的發明者將CF-HTS應用于檢測這種活性。
制備了一種酶凝膠，其中含有EF-3(一種對溫度高度敏感的酶)和溶于EF-3檢測緩沖液中的酵母核糖體。還制備了含有溶于檢測緩沖液的1mM ATP的底物凝膠。兩種凝膠都在低熔點瓊脂糖(Gibco BRL)中含有2％二甲亞砜，兩種凝膠的制備都是在37℃進行并在4℃靜置30分鐘。將聚-L-賴氨酸的系列稀釋液點樣PVDC到膜上并干燥(樣品基質)，一種EF-3抑制劑用作對照樣品。然后如在實施例1中那樣進行檢測實驗，首先將酶凝膠與樣品基質上的抑制劑預溫育。然后將酶凝膠與底物凝膠接觸20分鐘。如在實施例1中那樣，用孔雀綠／鉬酸銨顯色混合物對酶和底物凝膠進行染色。然后用CCD相機對酶凝膠進行拍照。在綠色背景下抑制劑點表現為較清晰的區域。圖7示明抑制劑量在5皮摩爾和200皮摩爾之間時在凝膠上的顯色。結果表明抑制劑的信號是劑量依賴性的，這意味著可以用這種檢測方法篩選化合物以發現新的EF-3抑制劑。實施例2示范了CF-HTS在存在細胞器和其他粗制生物混合物或抽提物的復雜體系中的應用。
實施例3蛋白-蛋白相互作用抑制劑的gELISA間接顏色檢測如上文所討論，ELISA經常用于檢測對配基-受體相互作用的抑制，其中受體是固定在微量滴定孔上的。用于ELISA中的“配基-受體對”可包括從蛋白或其它大分子到小分子的任何結合分子對。這些檢測是復雜的，多步驟的檢測，需要固定受體，將受體與配基溫育，洗滌以除去可能造成高背景信號的非特異性保留的多余配基，使結合顯示試劑(例如，與報告酶標記的對配基特異的抗體)和受體結合的配基結合并通過提供報告酶的底物產生可見信號。顯然，ELISA的復雜性使得HTS工業得出結論，認為ELISA不能被改造成自由方式的檢測實驗。盡管如此，本發明的發明者仍能將這種復雜的多步驟檢測實驗改造成了CF-HTS方式以檢測許多蛋白-蛋白、蛋白-配基以及其它配基結合相互作用。
尿激酶型血漿纖溶酶激活劑(uPA)與其相應受體的結合(uPAR)。uPA／uPAR相互作用已被用于檢測各種類型的癌癥轉移。本發明的發明者已將傳統的uPA／uPAR ELISA改造成了利用純化受體和配基的CF-HTS。
uPAR基質用15毫升溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)(Life Technologies，GrandIsland，NY)的118nM uPAR，在pH7．4和4℃的條件下包被塑料板(7．5cm×11．5 cm；購自Nunc．Naperville，IL)過夜。在塑料板包被過夜后，倒去uPAR溶液，加入15ml含1％(w／v)酪蛋白的PBS(Life Technologies，GrandIsland，NY)，室溫(RT)溫育2小時以封閉塑料板上剩下的結合位點。封閉后倒空封閉液，并用20ml由溶于PBS的0．05％Tween-20(聚氧化乙烯山梨聚糖單月桂酸)組成的洗滌液洗滌5次。洗滌后塑料板在RT干燥10分鐘。這一步需要控制好時間，使得塑料板隨后能立刻用于下述的實驗并避免基質的過分干燥而導致失活。
β-uPA基質為了檢測的目的，使用的uPA用生物素進行標記(uPA)。含有β-uPA的凝膠是通過將β-uPA浸泡入瓊脂以避免高溫(與實施例1和2中將其倒入熔化的瓊脂的方法相反)。制備瓊脂時首先將0．1g的瓊脂(Sigma，St．Louis，MO)與10ml PBS混合，加熱至熔化，然后倒入到8×7×0．075cm3的灌膠裝置中(Bio-Rad，Hercules，CA)。固化后(在室溫或在4℃)，將凝膠在溶于檢測緩沖液的15ml β-uPA中4℃浸泡過夜；上述檢測緩沖液由PBS、0．05％Tween-20和0．1％的酪蛋白(兩者都購自Sigma，St．Louis，MO)組成。在使用前將凝膠RT干燥20分鐘。
樣品基質在針對uPA／uPAR結合的已知小分子抑制劑不存在的條件下，將未用生物素標記的uPA(Pro-uPA)用作抑制uPA／uPAR結合的對照樣品。將溶于檢測緩沖液的0、0．03、0．1、0．3、和3μM pro-uPA的5微升小樣分加到PVDC膜(Dowbrands L．P．Indianapolis，IN)上并在RT干燥2小時。
將uPAR與Pro-uPA和β-uPA溫育將樣品基質置于β-uPA凝膠的一側，使干燥的pro-uPA點與β-uPA凝膠表面接觸。RT溫育10分鐘，使得pro-uPA擴散到凝膠中。然后將β-uPA凝膠的另一側放在塑料板上使得β-uPA(作為配基)和pro-uPA(作為競爭抑制劑)與塑料板表面上的uPAR相互作用。在RT溫育20分鐘進行結合／競爭反應。溫育后，將塑料板從凝膠分離開，迅速用20ml洗滌緩沖液洗4次。將親和素-辣根過氧化物酶(Sigma，St．Louis，MO)用檢測緩沖液1比25，000稀釋以制備親和素-HRP標記物溶液，并將15ml加入到塑料板上。反應在RT溫育10分鐘進行，然后倒空親和素-HRP溶液并如上文所述洗滌塑料板。塑料板干燥20分鐘。
親和素-HRP中的親和素特異性地與生物素結合，使得只有發生“配基／受體”結合的基質區域最終才會顯色。“配基／受體”結合被pro-uPA競爭性抑制的的基質區域將不會顯色。
顯色含有比色測定HRP底物的顯色凝膠(OPD凝膠)是通過將鹽酸2-鄰苯二胺(OPD)藥片溶于7ml稀釋釋液(兩者都來自Abbott kit no．6172-30，Aboot Labs，Abbott Park，IL)并將此溶液與瓊脂糖溶液混合而制備，瓊脂糖溶液是通過用3ml水熔化0．1g瓊脂糖而制備的。將最終的10ml混合物倒入8×7×0．075cm的mini-proteinⅡ凝膠裝置中并在4℃凝固15分鐘。將凝膠從灌膠架的玻璃板上轉移到PVDC膜或柔軟的塑料片上，并在空氣中室溫干燥10分鐘。然后將凝膠轉到另一張PVDC膜或塑料片上使凝膠的另一側干燥10分鐘。然后將OPD凝膠放到塑料板上開始顯色。在OPD溫育的不同時間將塑料板放在440nm濾色鏡上(OmegaOptical，IncBrattleboro，VT)，而上述濾色鏡放在纖維光學散射板上，散射板放在Fiber-Lite光源上(兩者都來自Dolan-Jenner IndustriesLawrence，MA)。得到的圖象用CCD相機獲取(Eagle Eye system，Statagene，La Jolla，CA)。
對照實驗圖8示明實施例3的對照實驗。在圖8A中，瓊脂方塊(1cm2)浸泡在如方塊下方所表示的各種濃度的β-uPA中(除了50nM的溶液是在瓊脂方塊的左邊標明)。在瓊脂方塊與塑料板上固定的uPA溫育后，這些方塊被移開。然后洗滌塑料板，按照上文所述觀察基質上發生β-uPA／uPAR結合的區域。圖8B示明OPD顯色的不同時間中每個方塊的平均象素值(減去背景)(利用NIH圖象檢測軟件檢測CCD相機數字圖象而確定)對每個方塊中β-uPA的濃度作圖從瓊脂方塊中釋放的β-uPA表現出典型的受體-配基結合曲線，半-最大結合(Kd)為2-5nM，這與常規ELISA和其它測量此參數的檢測實驗中此反應的報道值相一致。圖8表明由gELISA產生的間接比色信號定量地依賴于配基-受體相互作用程度。
Pro-upA／β-uPA競爭實驗結果圖9示明Pro-upA對β-uPA／upAR結合的抑制。圖9A中的點顯示β-uPA／upAR結合受抑制的區域。相應地，親和素-HRP在這些區域不結合。因此，HRP不與底物膠中的OPD反應產生顏色。圖9B是顯示同樣的CCD圖象數據的替代方法，這樣增強了人眼觀察定量滴定的能力。
實施例4蛋白-蛋白相互作用抑制劑的直接放射性探測方法T細胞激活是身體免疫應答的一個組成部分。在T細胞激活中為了發生下游事件，p561ck(LCK，一種蛋白)必需與T細胞抗原受體的胞漿內結構域中的ITAM區(基于酪氨酸的免疫球蛋白相關激活片段，immunoglobulin related tyrosine based activation motif)反應。抑制這種蛋白-蛋白相互作用的化合物是潛在的免疫抑制劑。本發明的發明者應用CF-HTS來檢測這種蛋白-蛋白相互作用，其中LCK被固定到膜上。
LCK基質將11cm×2cm的條帶用5ml溶于含5mM DTT(二硫蘇糖醇)的PBS的3μM LCK淹沒，室溫放置10分鐘，將緩沖液除去，從而將生物素標記的LCK固定到生物素捕獲膜上(SAM膜)(Promega CorpWI)。這一步驟要控制好時間，以便SAM膜能隨后立刻(幾分鐘以內)用于下述的檢測實驗中。
ITAM*基質含放射性標記的ITAM(ITAM*)瓊脂凝膠是通過混合0．1g瓊脂糖和10ml水，加熱至熔化，然后倒入8×7×0．1灌膠裝置中而制備的。在灌膠之前加入或在凝固后滲透加入ITAM*，使其終濃度為10nM。
樣品基質待篩選的測試樣品分加到塑料表面上或PVDC膜上并干燥以形成樣品基質。
溫育ITAM*、LCK和待測樣品并顯現結果樣品基質與ITAM*凝膠的一側接觸，使得測試樣品擴散到ITAM*凝膠中。然后將ITAM*凝膠的另一側與固定LCK的SAM膜接觸。溫育15-45分鐘后，移開SAM膜，洗滌，并用磷成像儀或膠片成像。圖象上較低的信號強度對應較低的放射性，這意味著存在ITAM-LCK相互作用的抑制劑。
ITAM*／LCK結合的對照實驗瓊脂凝膠是通過混合0．1g瓊脂糖和10ml水，加熱至熔化，然后倒入8×7×0．1灌膠裝置中而制備的。凝固后從凝膠中打孔取出直徑1cm的凝膠并用400μl 0．1、0．3、1、3、10和20nm125I標記的ITAM(Amersham，Arlington heights，IL)4℃浸泡過夜。從溶液中取出凝膠塊并在RT干燥20分鐘。然后放在固定LCK的膜上并在RT溫育45分鐘。除去凝膠并用緩沖液洗滌4次。SAM膜干燥后用磷成像儀成像。
圖10表明125I-ITAM和固定在SAM膜上的LCK之間的結合是劑量依賴性的。
圖11示明每塊125I-ITAM的凝膠平均象素值(減去背景)(利用Molecular Dynamics的ImageQuant軟件檢測磷成像儀的數字化圖象而得到)對每塊凝膠中125I-ITAM的濃度作圖。從凝膠中釋放到固定的LCK上的125I-ITAM表現出典型的受體-配基結合曲線。
實施例5用凝膠／濾器聯合方式檢測全細胞報告基因用含有融合到熒光酶基因(熒光酶報告基因來自Promega)上的環腺苷酸應答元件(CREB)啟動子的質粒轉染腎細胞，如HEK細胞。當用毛喉素處理轉染細胞時，熒光酶報告基因誘導表達。然后往HEK細胞中加入含有熒光酶底物(甲蟲熒光素，Promega)和適當輔助因子(20mM苜蓿素(Tricine)pH 7．8，0．1mM EDTA，33mM輔酶A，0．5mM ATP，1mM MgCl2)的生物緩沖液，可利用常規的儀器檢測產生的光子發射。發明者將這種檢測實驗改造成了CF-HTS。
細胞基質用胰蛋白酶處理培養基中的細胞，轉移到Corning／CostarTRANSWELLTM膜上(帶有塑料支持圈的3微米聚碳酸酯濾膜)上，并在含5％CO2組織培養基中37℃溫育過夜。然后從膜上除去培養基，并將細胞結合的濾膜在空氣中干燥15分鐘，隨后立刻用于以下的步驟中。
誘導劑基質將12μl 10mM毛喉素(Sigma，儲存于乙醇中)儲存液加入到6ml 1％低熔點瓊脂糖凝膠中制備含有熒光酶表達誘導劑的凝膠。該凝膠在室溫凝固，毛喉素的終濃度為20μM。
樣品基質將可能阻止毛喉素誘導的樣品高密度地分加到PVDC膜上的離散位置。
反應物的溫育和抑制的檢測將PVDC膜的抑制劑側與誘導劑凝膠溫育。然后，將含有毛喉素誘導劑的凝膠放置在上文制備的細胞基質的非細胞側。在37℃，5％CO2的條件下溫育20分鐘。然后除去毛喉素凝膠，在37℃，5％CO2的條件下再溫育4小時使熒光酶構建體最大量地表達。為了探測熒光酶酶學活性(或對其酶學活性的抑制)，將細胞基質濾膜從其塑料支持環上移開并放置在有蓋培養皿中。有蓋培養皿中倒滿溶于生物緩沖液的熒光酶底物(甲蟲熒光素，Promega)和恰當的輔助因子以產生光信號。因為信號是位于表達熒光酶的固定細胞內的，初始誘導步驟的抑制劑將產生低光子發射區域。
實施例6凝膠／濾器CF-HTS直接檢測配基-細胞相互作用的抑制劑細胞表面上的配基／受體結合啟動細胞中的信號通路，最終導致功能性應答(例如，細胞增殖或分泌生物活性物質)。為了調節疾病狀態細胞的生物應答，經常需要抑制配基和細胞表面的結合。評測配基／細胞受體結合抑制劑的一種常規方法為評測抑制劑降低放射性標記的天然配基和細胞結合的能力。這需要將細胞和放射性配基和抑制劑溫育，然后通過洗滌除去未結合的和非特異性結合的放射性配基，然后測量結合的放射性。
白介素-8(IL-8)是一種趨化性的趨化因子，通過和多種細胞的受體結合而參與炎癥反應。本發明的發明者發展了一種CF-HTS配基-受體細胞檢測法來評測這種相互作用的抑制劑。
細胞基質表達IL-8a受體的HEK細胞(ATCC，Bethesda，MD)鋪在75mm直徑的transwell膜濾器上(Corning Costar Corp，Cambridge，MA)，密度為大約2千萬個細胞每板。在含有10mM Hepes(Sigma，St Louis，MO)，pH7．2的緩沖液(RPMI，Life Technologies，Grand Island，NY)37℃過夜使細胞結合到濾器上。細胞和濾器結合后除去培養基，用新鮮的緩沖液洗滌細胞除去任何未結合的細胞。將濾器倒置，使細胞側向下并以一定的角度放置，使得培養基流干，然后干燥20分鐘。這一步驟要控制好時間，使得細胞基質能馬上用于下述的步驟中。
配基基質配基基質的制備是通過將125I標記的IL-8(Amersham，IncArlington heights，IL)浸泡到瓊脂糖凝膠中，瓊脂凝膠是通過混合0．1g瓊脂糖和10ml水，加熱至熔化，然后倒入8×7×0．075灌膠裝置中而制備的。凝膠在室溫浸泡過夜并在旋轉平臺(New Brunswick Scientifc Co，Inc，Edison，NJ)上緩慢地混合。浸泡后，在使用前將凝膠RT干燥20min。這一步要計劃好時間，以便凝膠可馬上被用于以下的檢測中。
樣品基質在沒有結合IL-8／細胞受體的已知抑制劑的情況下，未放射性標記的IL-8(GenzymeCambridge，MA)被用作對照樣品抑制劑，以觀察對125I-IL-8和HEK細胞結合的抑制作用。在塑料片如PVDC上分加1微升濃度為0，0，03，0，1，0，3 1，3，10，和100μM的IL-8并在室溫下真空干燥1小時。
溫育將樣品基質放在配基基質的一側，使得干燥的IL-8點和凝膠表面接觸。翻轉凝膠使得另一側室溫干燥10分鐘并使“抑制劑”擴散到凝膠里。隨后將凝膠放在細胞基質無細胞的一側。然后在室溫溫育45分鐘進行結合反應。此后將凝膠移開，將膜無細胞的一側用緩沖液洗滌4次。在膜完全干燥后將其從塑料支持環上取下。然后用X-光膠片或磷成像儀(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)成像。
圖12示明從瓊脂擴散到細胞基質的125I-IL-8和表達IL-8a受體的HEK細胞結合的劑量反應。將幾個1平方厘米的瓊脂方塊浸泡在圖中所示的各種濃度的125I-IL-8中。隨后浸泡了配基的方塊如上文描述那樣與細胞基質接觸。溫育后，從細胞基質上移走方塊，將膜的無細胞側用緩沖液洗滌。用磷成像儀定位結合125I-IL-8的細胞。結果表明在這種以凝膠為基礎的細胞檢測中直接讀出的放射性值定量地依賴于受體配基結合的程度。圖12還表明結合區域在形狀上是清楚的，確證了信號的側向擴散在本檢測實驗中不是問題。
圖13示明競爭抑制實驗的結果。對125I-IL-8和HEK細胞結合的抑制表現為較亮的點。顯然，未標記IL-8的抑制也是可量化的劑量依賴性的。這些數據表明以此例中未標記IL-8為例子的抑制劑能穿過細胞基質降低125I-IL-8和細胞之間的結合。
實施例7基于濾器的無凝膠功能性細胞檢測實驗細胞功能的改變通常是通過觀察化合物或樣品對構建于細胞中的報告系統的影響而測量的。具體實例包括觀察對細胞內熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)、細胞外蛋白如受體或粘附分子、或特定酶如熒光酶、氯霉素酰基轉移酶或β-半乳糖苷酶(Promega)合成的影響。首先將待測樣品與細胞溫育。然后在適當的時間內(可以是幾分鐘、幾小時或幾天)使細胞表達報告蛋白。然后用直接方法(例如GFP)或間接方法(例如膜結合蛋白的ELISA技術)檢測報告蛋白的水平。進而，在酶的情況下，可破碎細胞提取報告蛋白并檢測酶活性。其它功能性細胞檢測測量受體受刺激后或細胞生理如膜電勢改變后特定分子如顏料或放射性標記的代謝物的行為或位置的變化。
一種測量化合物對細胞間粘附分子1(ICAM-1)的影響的ELISA檢測可如下被改造成CF-HTS方式。將表達ICAM-1的內皮細胞鋪在聚碳酸酯趨化膜(Neuro Probe)上，密度為每mm25，000個細胞。細胞在培養基中溫育過夜。將培養基除去并使膜在室溫部分干燥10分鐘。用于測試對ICAM-1的誘導的樣品或化合物被加到塑料片上干燥并使之與潮濕膜的無細胞側接觸。化合物和細胞在潮濕的小室里37℃反應1小時，隨后細胞用培養基淹沒并在37℃溫育5小時。
在足夠細胞合成誘導蛋白的一段時間之后，將培養基從膜上除去并在含抗ICAM-1抗體的緩沖液中溫育細胞(Genzyme，R&D系統)，抗體用異硫氰酸熒光素或生物素標記或不用之標記。室溫溫育30分鐘后，除去緩沖液并洗滌細胞數次以除去未結合的抗ICAM-1抗體。在FITC標記抗體的情況下，用CCD相機(Stratagene，Imaging Research)在485nm激發520nm發射下對膜成像。由于FITC-抗ICAM-1-抗體的結合，刺激ICAM-1表達的化合物將導致熒光增強的區域。在生物素標記抗體的情況下細胞在含親和素-HRP的緩沖液中室溫溫育10分鐘。除去緩沖液并洗去未結合的親和素-HRP。然后將膜浸泡在含沉降性HRP底物，如四氯二氨基聯苯胺的緩沖液中，并觀察誘導表達ICAM-1的潛在細胞區域的顯色。在未標記的抗ICAM-1抗體的情況下，用標記的抗抗ICAM-1抗體的二抗與細胞反應，然后用標記物的適當底物顯現信號。用CCD相機捕獲圖象。所有的這些變例(FITC、親和素-HRP、和抗抗ICAM-1抗體)都是應達到相同定性結果-即信號增強或減弱的區域能與影響ICAM-1表達的樣品相聯系-的不同報告標記。
值得注意的是此例中連續式基質是膜或塑料片。凝膠對于CF-HTS并不是必需的。
實施例8CF-HTS檢測離散樣品對神經氨酸苷酶的抑制樣品基質利用CF-HTS測試了528種離散的、結構上相關的化合物的文庫。用Packard Multiprobe MP204-DT將化合物從小瓶中稀釋到96孔板并將化合物稀釋和轉移到塑料片上。最初將小瓶中溶于DMSO的40mM化合物用DMSO在96孔板上稀釋到4mM。將兩份1μl樣品轉移到8cm×8cm的塑料片上，樣品間的間隙平均為5mm(BioRad cat#165-2956)，每塊塑料片總共192個樣品。因此，每個1μl的點大約含有200pmol來自上述文庫的一種特定樣品。稀釋一系列2，3-脫氫-2脫氧-N-乙酰基神經氨酸(DANA)，一種已知的神經氨酸苷酶抑制劑(BoehringerMannheim#528544)，手工分加到每塊塑料片上與化合物相鄰的位置，作為對照。在真空爐中干燥塑料片，使得每種化合物在其自身的位置上被干燥到塑料表面上。
酶基質檢測在40℃下前將25％甘油、磷酸鹽緩沖液中的流感病毒神經氨酸苷酶按1500倍稀釋到液態的瓊脂凝膠中，該凝膠中含有1％瓊脂糖、50mM檸檬酸鈉，pH6．0，10mM氯化鈉。灌制8cm×8cm×0．075mm的酶凝膠并將溫度降低到4℃使之凝固。
底物凝膠將DMSO中濃度為3mM的流感病毒神經氨酸苷酶合成底物，2’-4-甲基繖形基(4meththumbelifeyl)-α-D-N-乙酰神經氨酸(Sigmacat#M-8639)，用液化瓊脂糖凝膠稀釋到30μM并以和上文描述的酶凝膠類似的方式灌制。
溫育和檢測酶基質放在樣品基質上所感興趣的化合物被干燥的一側。然后將底物基質迭放在酶基質上。將這些基質RT溫育30分鐘。在這段時間內淬滅熒光底物和酶在兩塊膠之間擴散到一起，然后底物被酶水解，使得熒光強度增加。監測在340nm激發和450nm發射進行。能抑制酶活性的化合物使熒光的增加程度減小。凝膠在大多數部位熒光都增加，但酶抑制劑從塑料片擴散到凝膠的部位熒光較弱、較暗。通過適當的濾光鏡控制發射和激發波長，這樣容易用CCD相機監測。表現出抑制性區域的化合物的成分可通過確定該區域在抑制劑基質上對應的位置而確定。通過比較DANA對照和已知量的各種測試抑制劑的熒光強度可定量地估計每種成分的IC50。
所有的538種化合物都進行了雙份測試。所用的酶凝膠總體積為33ml，或每次測試用31．25μl。進而，所有的化合物都同時測試，與傳統的96孔檢測方法相比檢測條件是恒定的。進而，如圖14所示，該檢測靈敏得足以探測含量少到100μM的抑制劑。每種活性化合物的IC50估計值和用96孔方法觀察到的同一測試化合物的相同，但96孔方法費用更昂貴，每次測試需要200μl。參見定量凝膠檢測結果表。這個實施例表明測試高密度排列的化合物減少了費用和時間。例如，僅僅將間距有5mm減小到2．5mm就能使得每單位體積的測試樣品數量提高4倍。在本實驗中這將使得每種化合物的體積減小到10μl。但是試劑是以批量的形式操作的，不需要小型化篩選中常用的小體積液體操作裝置。
定量凝膠檢測結果樣品# 凝膠實驗得到的近似 從96孔實驗估計的最大Ki(μM) IC50(μM)34100＞1003580 ＞1003680 4237100＞10038100＞10039100＞1004040 3241100＞1004240 5043100＞10044＞200 ＞10045100＞10046100＞1004710 7．548100＞10049100＞10050100＞100用總體積17毫升的酶凝膠通過CF-HTS檢測了10，080種離散化合物(每次檢測小于2μl)，以此為例說明這種小型化的優點。用PackardMultipette分加30μl體積的每種樣品，樣品之間的間隔為1mm。分加的化合物溶于DMSO中，濃度為5mM，使得大約150pmol的每種樣品被分加到塑料表面上。再一次用DANA作為對照。除了象通常那樣在化合物排列的外邊進行對照滴定外還在排列之中包括了對照滴定，作為盲試(bIindtest)；在盲試中對照樣品以和10，080種未知樣品一樣的方式加到塑料表面上。如上文所述，塑料片干燥后用于神經氨酸苷酶檢測。利用這種方法，在不到1個小時內同時篩選了所有的10，080種化合物。除了在將初始的化合物分加到塑料片上時，本實驗再不需要微量流控和／或小體積操作。本實驗中極其高的密度并未干擾對抑制劑的探測。進而，高密度并未使活性化合物的鑒定復雜化，甚至在熒光化合物(在凝膠上為亮點，很容易觀察到)與活性化合物緊鄰時也是如此。參見圖15。
權利要求
1．一種檢測測試樣品的生物學或生物化學活性的方法，該方法包括，a)將多種測試樣品引入到多孔檢測基質之中或之上，檢測基質任選地含有一種或多種檢測組分，b)使用至少一種基質將一種或多種檢測組分引入到檢測中，其中所述基質可以是也可以不是多孔檢測基質，c)進行以下另加步驟，ⅰ)洗滌檢測中用的任一基質以除去多余的測試樣品、檢測組分或兩者；或者ⅱ)使檢測中使用的任一基質和批量溶液或其本身為液體另加試劑接觸。
2．權利要求1中的方法，其中測試樣品是分加到含有配基的多孔檢測基質上的，另一種檢測基質含有固定的受體，并且另一種另加的試劑為顯現溶液(visualizing solution)。
3．權利要求1中的方法，其中另加的試劑可以在一種細胞檢測中探測報告基因的表達。
4．權利要求1中的方法，其中一種多孔檢測基質是在一面帶有全細胞的膜，并且另加的步驟包括加入含有能與報告蛋白交聯的化合物的批量溶液；報告蛋白是由于測試樣品和細胞之間的陽性反應而產生的。
5．權利要求1中的方法，其中另加的試劑是顯現試劑。
6．權利要求1中的方法，其中的洗滌步驟除去多余的用于顯現檢測結果的檢測組分。
7．一種檢測測試樣品生物學或生物化學活性的方法，該方法包括，a)將多種測試樣品引入到多孔檢測基質之中或之上，檢測基質任選地含有一種或多種檢測組分，b)使用至少兩種另加的基質進行檢測。
8．一種檢測離散測試樣品生物學或生物化學活性的方法，該方法包括，a)將96種以上測試樣品引入到多孔檢測基質之中或之上，檢測基質任選地含有一種或多種檢測組分，b)進行檢測。
9．權利要求1，7或8中的方法，還包括分加測試樣品到測試樣品基質的步驟。
10．權利要求1，7或8中的方法，其中多孔檢測基質含有靶大分子。
11．權利要求1，7或8中的方法，其中多孔檢測基質含有酶。
12．權利要求1，7或8中的方法，其中多孔檢測基質含有粗制的生物混合物或抽提物。
13．權利要求1，7或8中的方法，其中多孔檢測基質含有細胞器或細胞。
14．權利要求1，7或8中的方法，其中多孔檢測基質是濾器或膜。
15．權利要求1，7或8中的方法，其中多孔檢測基質是一層覆蓋在固定了的檢測組分上的液體薄膜。
16．權利要求1，7或8中的方法，其中另加基質含有固定的大分子靶。
17．權利要求1，7或8中的方法，其中另加檢測基質含有顯現試劑。
18．同時檢測多種不同物質樣品增強或抑制生物學過程能力的方法，該方法包括，a)96種以上獨特樣品，每種以一小份體積加到含有或帶有均一分布的試劑的平面多孔基質上形成排列，使得每種獨特物質以其自身的獨特位點為中心，并且能根據加樣位點確定每種物質的身份，b)觀察每種物質和所述的檢測試劑的相互作用，并且將這種相互作用與該物質增強或抑制生物學過程的能力相聯系。
19．同時檢測多種不同物質樣品增強或抑制生物學過程能力的方法，該方法包括，a)96種以上獨特樣品，每種以一小份體積加到平面基質上形成排列，使得每種獨特物質以其自身的獨特位點為中心，并且能根據加樣位點確定每種物質的身份，b)使上述基質和含有或帶有均一分布的檢測試劑的多孔基質接觸，并使每種物質各有一部分擴散到上述多孔基質，其擴散的方式可以保證每種擴散物質的位置能與上述平面基質上上述物質最初加樣的位置相關聯，c)進行接觸以測定每種擴散物質增強或減弱上述生物學過程的能力。
20．同時檢測多種不同物質樣品增強或抑制生物學過程能力的方法，該方法包括，a)96種以上獨特樣品，每種以一份小體積加到平面基質上形成排列，使得每種獨特物質以其自身的獨特位點為中心，并且能根據加樣位點確定每種物質的身份，b)使上述基質和含有或帶有均一分布的檢測試劑的第一多孔基質接觸，并使每種物質各有一部分擴散到上述多孔基質，其擴散的方式可以保證每種擴散物質的位置能與上述平面基質上上述物質最初加樣的位置相關聯，c)使上述第一多孔基質和含有或帶有第二種均一分布的檢測試劑的第二多孔基質接觸，并使第二種檢測試劑擴散到第一多孔基質，或使每種物質和第一種試劑擴散到第二多孔基質，在后一種情況下確保擴散的方式使得每種擴散物質在第二基質中的位置能與上述物質在上述平面基質上的最初加樣位置相關聯，以及d)評測每種物質增強或抑制所述生物學過程的能力。
21．同時檢測多種不同物質樣品增強或抑制生物學過程能力的方法，該方法包括，a)96種以上獨特樣品，每種以一份小體積加到含有或帶有均一分布的第一檢測試劑的第一平面多孔基質上形成排列，使得每種獨特物質以其自身的獨特位點為中心，并且能根據加樣位點確定每種物質的身份，b)使上述第一多孔基質和含有或帶有第二種均一分布的檢測試劑的第二平面基質接觸，并使第二種檢測試劑擴散到第一多孔基質，或使每種物質和第一種試劑擴散到第二平面基質，在后一種情況下確保擴散的方式能使每種擴散物質在第二基質之中或之上的位置可與上述物質在上述第一多孔基質上的最初加樣的位置相關聯，以及c)評測每種物質增強或抑制生物學過程的能力。
22．權利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑是有一種大分子。
23．權利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑有一種是酶。
24．權利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑有一種是粗制的生物抽提物。
25．權利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑有一種是細胞器。
26．權利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑有一種是全細胞。
27．權利要求18或19或20或21中的方法，其中均一分布的檢測試劑是平面多孔基質一個表面上攜帶的全細胞。
28．權利要求27中的方法，其中所述的相互作用是通過使上述多孔基質和一種試劑溶液或懸液或含有該試劑的多孔基質接觸，上述試劑在隨便那種情況下都可促進一種蛋白的顯現，上述蛋白在上述全細胞中的表達即是被評測的生物學過程。
29．權利要求21中的方法，其中第一檢測試劑是標記的配基，而第二檢測試劑是針對上述配基的固定后的受體。
30．權利要求29中的方法，其中第二平面基質被洗滌以除去擴散到上述第二平面基質之上或之中但不與上述固定受體結合的任一標記配基。
31．權利要求30中的方法，其中所述第二平面基質與一種試劑的溶液或懸液或含有該試劑的多孔基質接觸，上述試劑在隨便那種情況下都促進未在洗滌中被除去的標記配基的顯現。
全文摘要
本發明涉及應用了至少一種多孔基質的連續式高處理量篩選方法(CF－HTS),該方法使得制藥工業能夠同時對大量生物學或生化活性分布廣泛的化學實體進行篩選。此外,CF－HTS也可用于進行多步驟的檢測實驗。
文檔編號G01N33/543GK1281552SQ98812079
公開日2001年1月24日 申請日期1998年12月11日 優先權日1997年12月12日
發明者B·A·比特爾, M·E·舒達克, M·J·沃二巴斯, D·J·布爾恩斯, M·K·約瑟夫 申請人:艾博特公司