造血干細胞表面的蛋白質sm1的制作方法

專利名稱：造血干細胞表面的蛋白質sm1的制作方法
背景技術：
本發明涉及一種在此被稱為SM1的蛋白質，它基本上是以不含有其它蛋白質的純化形式存在。借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE測定的分子量是大約230 KDa，SM1存在于人和小鼠的造血干細胞及原始前身細胞的表面，但是不存在于其它細胞的表面，包括FDC-P1髓樣前身細胞，EL4 T-細胞，WEHI-3骨髓單核細胞，以及70 Z/3前-B淋巴樣細胞，或者也不存在于人臍帶血(Cord blood)或小鼠骨髓中已分化的造血干細胞表面。本發明還進一步涉及應用抗-SM1抗體產生富含造血干細胞群的方法。
所有循環中的血細胞都由多能性干細胞通過造血過程形成。造血干細胞是能夠自我更新的未分化細胞，并能分化成髓樣血細胞系，紅細胞樣血細胞系，巨核血細胞系，以及淋巴樣血細胞系的定型前身細胞。透徹地分析造血干細胞，對充分地理解血淋巴系統的發育生物學是十分重要的。但是，關于造血干細胞所知尚少。
功能上，對于致死性輻射接受者，在體內造血干細胞能夠長期重建血淋巴系統。Spangrude & Johnson，PNAS 877433-7437(1990)；Spangrude et al.，血液781395-1402(1991)。它們還可以分化成為短期造血干細胞，被稱為12天脾集落形成單位(CFU-S)，可在體內脾病灶形成試驗中觀察到。Spangrude et al，科學24158-62(1988)；Molineux et al.，實驗血液學14710(1986)；Nakahata & Ogawa，PNAS 793843-3847(1982)。此外，造血干細胞的另一個特性是當體外粘附于基質細胞層時，呈現出“鵝卵石”的形態。Wong et al.，免疫1571-583(1994)。
試圖更詳細地描述造血干細胞特征的努力受到了阻礙，主要是因為與所有的細胞相比較，造血干細胞的含量都較微小(小于0.01％)，甚至在血細胞形成器官如骨髓或胎兒肝臟中也是如此。Li &Johnson，血液851472-1479(1995)。因此，為了產生富集的干細胞群，作為一種手段，闡明造血干細胞特有的物理學特征也是所希望的。例如，可參閱Spangrude et al.，Blood 781395-1402(1991)。所有已知的造血干細胞富集方案都涉及主要基于選擇細胞表面標志的細胞分離法，或者其它的物理學方法，如密度梯度離心法，對流離心淘洗法，以及基于光散射特征的細胞分選法。Bertoncello etal.，實驗血液學13999-1006(1985)；Mulder & Visser，實驗血液學1599-106(1987)；Ploemacher & Brons，實驗血液學17263-271(1989)；Szilvassy et al，PNAS 868798-8802(1989)。雖然已有人描述了一些獲得富集的造血干細胞群的方法，但是，缺乏專一的標志阻礙了對明確的純造血干細胞群的分離。
某些造血干細胞表達細胞表面分化抗原(Thy-1)和干細胞抗原-1(Sca-1)。但是，它們不表達B細胞(B220)粒細胞(Gr-1)，髓單核細胞(Mac-1)和T細胞(CD4，CD8)的譜系(Lin)標志。Spangrude et al同上。已報導的最廣泛應用的造血干細胞富集方案包括使用抗Thy-1和Sca-1單克隆抗體。Orlic et al.，同上。但是，只是Thy-1+，Sca-1+和Lin-細胞的亞群能夠使受致死性輻射的對象長期恢復繁殖。Smith et al，PNAS 882788-2792(1991)。因此，基于Thy-1和Sca-1表達的選擇不能產生純的造血干細胞群。類似地，其它一些造血干細胞富集技術，例如那些涉及使用抗-蛋白酪氨酸激酶，如W座位基因產物，C-kit，和胎肝激酶-2(flk-2)單克隆抗體的技術，顯然不能夠區分造血干細胞和前身細胞。見例如Matthews et al.，細胞651143-1152(1991)。
與造血干細胞有關的細胞表面標志的另一個例子是CD34。膜磷酸糖蛋白CD34存在于如下的細胞上造血干細胞，所有造血細胞系的定型的祖先細胞，早期多能性造血祖先細胞，以及內皮細胞。Krause etal.，血液871(1996)。經估算CD34+細胞占總骨髓細胞的大約2.5％，Osewa et al.，科學273-242(1996)，而在人和狒狒是1-4％，Civin et al.，免疫學雜志；Civin et al.，實驗血液學1510(1987)；Berenson et al.，臨床研究雜志81951(1988)。
經估算，造血干細胞不到總骨髓細胞的0.1％。因此，僅僅基于CD34的選擇法不能獲得真正純的造血干細胞群。使CD34同其它細胞表面標志一起，共同定向干細胞的純化。這些標志包括所謂的譜系特異性抗原，如HLA-DR，Thy-1，CD33，MDR-1，c-kit，CD45和CD38。Sutherland et al.，血液741563(1989)；Sutherlandet al.，血液78666(1991)；Lansdorp et al.，實驗醫學雜志172363(1990)；Baum et al.，PNAS 892804(1992)；Briddell et al.，血液793159(1992)；Drach et al血液7830(1992)；Gore et al，血液771681(1991)；Griffin et al，血液6030(1982)；Verfillie et al，實驗醫學172509(1990)；Terstappen et al，血液771218(1991)；Huang & Terstappen，自然360709(1992)；Huang & Terstappen，血液831515(1994)；Cardoso et al.，PNAS 908707(1993)；Issaad etal，血液812916(1993)；Srour et al，免疫學雜志148815(1992)。應用這種組合標志，發現CD34+/CD38+細胞的含量小于人骨髓細胞總數的0.1％，Civin et al，血液884102(1996)，而CD34+Thy-1+Lin-細胞的含量占人胎兒骨髓細胞的0.05％-0.1％，Baum et al，PNAS 892804(1992)。
已發現，僅僅通過CD34，或者結合其它標志選擇而富集的CD34+細胞組分，都顯示具有原始前身細胞或干細胞的功能。為了試驗CD34-富集的細胞具有作為造血干細胞是定義性特征的長期重建能力，Wong等(同上)，對小鼠進行了體外試驗研究。對于人細胞。為了測定真正造血干細胞的典型特征，已應用了多種體外試驗法。這些試驗包括，檢測原始的多譜系造血前身細胞/干細胞，Brand et al，血液831507(1994)，Rusten et al，血液841473(1994)，檢測潛在的高度增殖性細胞，Muench et al，血液833170(1994)，檢測未成熟的集落形成細胞，Leary & Ogane血液69953-956(1987)，檢測鵝卵石形成細胞，Henschler et al，血液842898(1994)，以及檢測長期培養起始細胞(LTC-IC)，Lemieux etal，血液861339(1995)；Verfaillie & Miller，loc cit 841442(1994)。雖然這些原始細胞確實顯示出某些與造血干細胞有關的特性，例如高度的增殖能力和能夠分化成多種造血細胞的譜系，但是，有爭議的是CD34-富集的細胞不能構成真正純的造血干細胞群。Lord& Dexter實驗血液學231237(1995)。然而已發現CD34-富集的細胞群具有很高的臨床價值，Emerson，同上。
最近報導已從致死性輻射接受者小鼠確立了一個細胞系，此小鼠是用先前以重新配置的反轉錄病毒基因組轉導的胎肝細胞重建的，Wonget al，同上，BL3細胞顯示有功能性造血干細胞的所有特點，即它們可以長期重建致死性輻射的接受者，它們可產生前-CFU-S和集落形成細胞，以及它們在與基質細胞結合時會形成“鵝卵石”形。除了是Thy-1+，Sca-1+和Lin-之外，BL3細胞還表達一個已知是在造血干細胞表達的轉錄因子GATA-1，Sposi et al.，PNAS 896353-6357(1992)。而且，BL3細胞是從12天齡小鼠胚胎肝細胞得到的胚胎來源性細胞。因此，BL3細胞可能具有不同于成熟造血干細胞的細胞表面標志，Jordan et al，同上，Spangrude et al同上。
上述論述突出地表明，需要有對造血干細胞作標志的其它細胞表面標志物，更具體地是，使之能夠產生較高富集的造血干細胞群，并且普遍地促進對未成熟血細胞生長和分化的更深認識。
發明概述因此，本發明的目的之一是鑒別和分離出一個標志物，它存在于人和小鼠造血干細胞和原始前身細胞表面，但是不存在于定型的前身細胞或成熟細胞的表面。本發明還有一個目的是提供這樣一種標志在鑒定假定的造血干細胞調節因子中的應用。本發明的另一目的是提供一種針對來自人或小鼠造血干細胞，或者原始前身細胞的細胞表面標志物的抗體，此抗體可用于產生富集的造血干細胞群。
為達到這一些和其它一些目的，本發明者提供了基本上不含有其它蛋白質的SM1蛋白，借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE測定時，SM1具有大約230 KDa的分子量，SM1存在于人和小鼠的造血干細胞原始前身細胞的表面，但是不存在于其它細胞的表面，例如FDC-P1髓樣前身細胞，EL4 T-細胞，WEHI-3骨髓單核細胞，以及70Z/3前-B淋巴樣細胞，或者也不存在于人臍帶血或小鼠骨髓中已分化的造血細胞表面。還可借助于抗SM1抗體并應用此抗體富集造血干細胞達到目的。
按照其中一個實施方案，是將抗SM1抗體用于制備本發明富含造血干細胞的組合物。本發明的方法包括如下步驟(a)提供結合SM1的抗體，(b)將此抗體固定化在某種支持載體上，使此抗體保持其結合SM1的能力，然后(c)使假定含有造血干細胞的混合細胞群與此抗體接觸，致使干細胞附著在支持載體上，(d)除去未附著的細胞，從而，富含造血干細胞的細胞群仍然附著在支持載體上。
本發明的另一個實施方案是一個用于制備富含造血干細胞組合物的試劑盒，包括(i)可結合SM1的抗體和(ii)使用此試劑盒的文字說明，用于指導進行抗體促進的高純度造血干細胞富集，這種造血干細胞能夠實現長期的造血重建過程。為了純化造血干細胞用于病人的治療，例如在移植時，可先從HLA相同或幾乎相同的供者取得骨髓。然后使骨髓細胞同試劑盒的抗體接觸。按這種方式分離的細胞可經受生長因子和細胞因子的作用，變成適合于對病人移植的足夠純的造血干細胞群。
在本發明另外的一個實施方案中，一個用于檢測樣品中結合SM1的造血因子的方法包括(a)使懷疑含有此生長因子的樣品同標記的SM1接觸，和(b)檢測此造血因子同標記SM1的結合。
本發明的另一個實施方案是關于一種用于檢測結合SM1的造血因子的試劑盒，包括標記的SM1，以及另外還包括使用這種試劑盒的文字說明。
本發明的另一個實施方案包括在體外擴增或擴展人SM1細胞的方法。為了在液體培養系統中生長，可使SM1細胞懸浮在含有補充的生長因子和細胞因子的液體培養基中。在一種基質共培養系統中，可使SM1細胞在含有或不含有補充的生長因子和細胞因子的情況下，生長在混合基質細胞制品粘附層的上面或在其內部。
本發明此外還有另一個實施方案，提供了一個編碼SM1的分離出的DNA分子。本發明的一個特定實施方案提供了一個包括如下核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的分離DNA分子GGAATTCCGN CAGCAAGTTC TTATTCTGCC TAAGAATTTT GTGATTCAGCACAAAGAGGG GAAAGCAGTT GAAAAAGAGA TAGCAGCACC TCAGCAGAAAGGCCCAGAGC ATTGCTCACC TGGCCCACAG ACAAGCGCTA CGTGTTCCTTAGTGTCTGTT CCTGTCACCT CTGTGTCTAC CCAACTGCCT AATACAGTTCTCAGTAAGAC AAGTACACCT TCATCAAATG TGAGTGCTAG ATCACAGCCTTTGTCTCCTG TAGCCTCTGT AAGTAATGCA TTAACATCAC CAGTTAAGACTAGCCAAAGT GAAGCAGGAA AAGTCAAGAG TACCGCTTCA TCCACCACACTCCCCCAGCC TCACACTTCA CCTACCATTT CATCAACAGT TCAGCCTCTCTTGCCAGCAA CAACACTAAA TGAATCTACA GATCCTGGCA GTTCCATCCCCTGTTTTTCA CAGCAAACTG TTGATTCTTC TGAGGCAAAG CAAGAACTAAAAACTGTATG TATACGAGAT TCACAGTCAA TTCTTGTTAG GACTCCAGGTGGGAACACTG GAGTTGTAAA AGTACAAACT AATCCGGAAC AAAATTCACCCAACAGTTTA TCTTCAAGTT CTGTTTTCAC CTTTACACCT CAATTTCAGGCATTTCTTGT GCCAAAATCA ACATCATGCT CTGCTTCCTC ACAAGTAGCCGGAGTGACTA CTACATCTAG TCTACCATCT TTCAGCCAAG CAATCTACGTNTGTGTNGCT TCATCCACCC ATGGGAAAAA TCTCAAATCT ACACAAGGCCAAACCTTGAG CAGTGGTATG TAGGCCCCAT GATAGAAAAA ACGTCATACATGCCCTCTTC ACCCTTGAAG CCTTCTGTTT CTTCCAGCTC ACTGCTACCATCAACAACAA ATAGTTCAGT GAGTGTAATT AGCATATCAA CAGGAAATNNNGGGCAAACC AATACAAATG TTATTCATAC ATCAACTAAA CCACAACAAGTAGATTGTAT CACNAAAAGT TACCCAGTTA CAAGATCAGA AGCAACAACAGCAGTAAATG GTGATGTGCT CGGTGAGACT CCAGGTCAGA AACTGATGCTGGTGTCAGCT CCATCTGGTC TCCCTTCTGG CAGTGTACCT TCAGTTAACACGGCACCAGA ACCGACATCT GCAGGTGTGT CTACCCAGAA GGTAGTTTTTATTAATGCTC CAGTTCCTGG TGGCGCTTCA TCCTCAGCTA TTGTTGCAGAATCATTAAGA CAGTCACTTC CTTCTCCCAC AAATACTGTA TTACTAGTGTGCTTGTAGTA GTTAACTCCA CCATCTTTGT AAGCTAATGA AATTGTGAGTCACCCATTTA TATCTTAATT TTTAATCATG TCAGTTCTTG AATGGGTATCTCCTTAGCCT GCTGATTTCT TTTTCTTTCT AAAGAAAGTG GGTGGAGAAATTAATTTAGA CGTTTGTTTG CAATAAAAAG AATTC本發明的另一個特定實施方案提供了一個包括如下核苷酸序列(SEQID NO.2)的分離DNA分子GAATTCTTTT TATTGCAAAC AAACGTCTAA ATTAATTTCT CCACCCACTTTCTTTAGAAA GAAAAAGAAA TCAGCAGGCT AAGGAGATAC CCATTCAAGAACTGACATGA TTAAAAATTA AGATATAAAT NGGTGACTCA CAATTTCATTAGCTTACAAA GATGGTGGAG TTAACTACTA CAAGCACACT AGTTATACAGTATTTTGTGG GAGAAGGGCA TACAGACATG GCTAACTTCA TATAGATCCCATTAGACAAC TGGATTTACA ACAAGTTTTT TTAATAAGAA ATGGGCAAAGCAGCTTTCTT TTCAGAATCA AAATGCAGAA CAAATGGAAA AATTATGGTATTAACCTTCA CAAGTTTGAG CCTCCACAAA TAATGCAACC AAGTTTTACATTTTTAACAG CCCTTCTACA TACACTCCAT CTTCTCTATC TTAGTTCCAAGTTTTAGTTT TCAATCCCAA TTATACCAAT TCCATTGTTA TTTTAAGAAAAAACCTTCCC AGTTATTGTC AGAAACTATG ATTTAGCTTA CCCCCTCCACTACNNAGCAA ACTACAGAGA GGATGGAGTG TAATATGAGC AGTACAGTATCTTAATGCAA TTCATGAGGA CCACTTAGTC CTTACATGAA TCTGGTTGCTAACATTTCTA TTATATTGTG ACAATGACTC CCGACTGTTA TTCTCTGTGAGAAATGGGGG GAGTAAATTC TTAATAAAAG ACACCAGGTA CAAAGCAACATTTTACTTCT GTTGTGATAA AAAAAAAAAA AGGTCACATT TTCAGATAAAATGTGGAACC CTGAAATCTG ACACATTCTC TTATCGTGCC ACCAATGCTGAGGTTCTCTT ACGATTCACT TTTAAACTGC AATTAAAAAT GTACAAAAAAGAAAAGAAAA AAANTCAACC CACAAAGCTT CTAAAAAAGG AACCCGCAGGCACTTCCTCT TGTGGAATGT TTAAAAAGTT AGCCTACTAA AGAAAACAGTCGACTTCTTG TGAAGGTTTT GGAGAAATAT GTATCAGTTC GTTTTATTTGGGTATTCAAT AATATCCTTG GTGATAATGC TGACTCCATG GCTTCTGACCCCAGAATTGA CCCTGCTGCC ACTGGTTGTA GCCCTGAGAT TGATTTTTGTAGCCACGATT GTTTCCTCGT CCTCTGAAGT TCTGGTTGTA GTTCCCTCTGTTGGGCATTC CACCTCTGTT GTAGTTCCCT CTGTTTGAGT AACTACCACGGCCAGGAAAA ACAGGGGCAC GAGGGTATGG ATAGCCGATT CCACCACTTCCTCCACCGCC ACCACCTCTC TGTGGCATGT TGCCCTCCTA TTATATCCGCCACGATTCCC AGGGGCTCCT CCTCTGAAAT TTCCACCACG CATATTGAATCCTCCACGTC TCTATGGCCA CCACCTCTGT TAAACTGGTT CTTGCCACTCTTATTTTTAT TGCTTTTCTT TGAGCCAGTG TTCTGTTTCT TTTCTGGTGGAAGAGCCTTT TTGCTTTCTT CCTTATATTG CTCCAAGAGT TTTTGGGCTTCTTCCTTCTG AAGGGCAACA TAGGTTATTT CATCAAAGCA CTCAGCTACCTCTGGGAGGG TAAAGTTTCC TTTCATTT通過下面的詳述，將對本發明的其它目的，特點和優越性作進一步說明。但是，應該理解到，這些詳述和特定的實施例，盡管指明了本發明的優選實施方案，但僅僅是以說明的方式提出，因為對于本領域的技術人員，根據此詳述，在本發明的精髓和范圍之內，提出各種變化和修改的形式將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1，小鼠SM1基因的DNA序列。
圖2，SM1表面蛋白在BL3細胞上的免疫沉淀反應。35S-甲硫氨酸標記的細胞與SM1抗體的免疫沉淀反應表明，待測樣品中，只有BL3細胞在細胞表面表達SM1蛋白。
圖3，對來自接受100和1000個SM1+細胞的受體小鼠CFU-SDNA的DNA印跡試驗分析。初步估計小鼠骨髓中SM1+細胞大約是10％。為了探索造血干細胞是否存在于SM1+細胞的亞群中，排除了對譜系特異性標志陽性的細胞，即CD4(T輔助細胞)，CD8(T殺傷細胞)，Gr-1(粒細胞)，TER119(紅細胞樣細胞)，Mac-1(巨噬細胞)和B220(前-B細胞)。可將這些Lin-細胞(對譜系陰性的)進一步分為SM1+和SM1-細胞。通過應用針對所有的譜系特異性標志的PE(聚赤蘚素)標記的抗體和FITC-標記的SM1抗體，對小鼠骨髓細胞進行了FACS分析。圖6顯示了這種雙顯色的分析結果。
圖4，對小鼠骨髓細胞的雙顯色-熒光激活細胞分選(FACS)分析。初步估計來自小鼠骨髓的SM1+細胞是大約10％。為了探索造血干細胞是否存在于SM1+細胞的亞群中，我們排除了具有譜系特異性標志陽性的細胞，即CD4(T輔助細胞)，CD8(T殺傷細胞)，Gr-1(粒細胞)，TER119(紅細胞樣細胞)，Mac-1(巨噬細胞)和B220(前-B細胞)。可將這些Lin-細胞(對譜系陰性的)進一步分為SM1+和SM1-細胞。通過應用針對所有的譜系特異性標志的PE(聚赤蘚素)標記的抗體對小鼠骨髓細胞進行了FACS分析。
圖5，人SM1基因的核苷酸序列圖6，對人臍帶血細胞的FACS分析，以PE-標記的譜系特異性抗體和FITC-標記的抗-SM1抗體作雙染色。
優選實施方案詳述發現了一種蛋白質(SM1)，并且隨后被純化使之基本不含其它蛋白質。借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE測定時，它具有大約230 KDa分子量。SM1存在于人和小鼠的造血干細胞和原始前身細胞的表面，但是不存在于包括如下的其它種細胞表面FDC-P1髓樣前身細胞，EL4 T-細胞，WEHI-3骨髓單核細胞，和70Z/3前-B淋巴樣細胞，或者不存在于人臍帶血或小鼠骨髓的已分化的造血細胞表面。抗SM1抗體在一個實施方案中，本發明涉及抗SM1抗體。除了將它們用于富集造血干細胞之外，這種抗體還可能在研究造血因子和開發抗體結合的治療劑中，提供研究和診斷的工具。此外，含有抗SM1抗體的藥劑組合物還可能提供有效的治療作用。本發明的抗體包括多克隆抗體，單克隆抗體，以及多克隆和單克隆抗體的片段。
多克隆抗體的制備對于本領域的技術人員是熟知的，參見例如Green et al.，多克隆抗體的生產，在“免疫化學方案”中(Mansoned)P1-5(Humana Press 1992)；Coligan et al，用家兔，大鼠，小鼠和倉鼠生產多克隆抗血清，在“免疫學中的通用方案”中，第2.4.1部分(1992)，在此均被引入作為參考。
單克隆抗體的制備同樣也是按常規法進行，參見例如Kohler &Milstein，自然256495(1975)；Coligan et al，2.5.1-2.6.7部分；和Harlow et al，抗體實驗室手冊，P726(Cold SpringHarboor Pub.1988)，在此均被引入作為參考。簡單地說，可通過如下步驟獲得單克隆抗體以含有某一抗原的組合物注射小鼠，通過采取血清樣品證實存在產生的抗體，取出脾臟，以便獲得B淋巴細胞，使B淋巴細胞同骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤，克隆雜交瘤，挑選出能產生針對此抗原抗體的陽性克隆，以及從雜交瘤培養物中分離出抗體。可借助于多種成熟的技術從雜交瘤培養物中分離和純化單克隆抗體。這類分離技術包括以蛋白-A瓊脂糖的親和層析，大小排阻層析和離子交換層析，參見例如Coligan et al 2.7.1-2.7.12部分和2.9.1-2.9.3部分；Barnes et al，免疫球蛋白(IgG)的純化，在“分子生物學方法”中，Vol.10 P79-104(Humana Press 1992)。在體外和體內增殖單克隆抗體的方法，對于本領域的技術人員也是熟知的。
體外增殖可以在適當的培養基中進行，例如Dulbecco′s改進的Eagle培養基或RPMI 1640培養基，可任選地補充哺乳動物血清如胎牛血清，或微量成分和維持生長的添加物如正常小鼠的腹膜滲出細胞，脾細胞，骨髓巨噬細胞。體外生產可提供比較純的抗體制劑，并可能按此例擴大，產生大量所需的抗體。雜交瘤的大規模培養可通過均相懸浮培養來實現，可在空氣升液反應器內，在持續攪拌的反應器內，或者在固相化的，或被捕獲的細胞培養物內進行。體內增殖可通過將細胞克隆注射進入與其親代細胞組織相容的哺乳動物中來實現，例如注射給同源性小鼠，導致生長出產生抗體的腫瘤。任選地可在注射之前用碳氫化合物，特別是油是如降植烷(四甲基十五烯)“致敏”動物。注射后1-3周，可從動物的體液中回收所需的單克隆抗體。
對于本發明抗體的治療應用是可想而知的。例如，本發明的抗體也可以是來自亞人類的靈長類動物抗體。例如，可在如下文獻中找到用于從狒狒產生有治療價值抗體的一般技術Goldenberg et al，國際專利公開WO 91/11465(1991)，和Losman et al，國際癌癥雜志46310(1990)，特此將它們的有關內容引入作為參考。
按另一種方法，還可能從“人源化”的單克隆抗體得到有治療價值的抗-SM1抗體。可通過下述步驟產生人源化的單克隆抗體先將來自小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區的互補決定區轉移進入人免疫球蛋白的可變區，然后取代鼠對應部分結構區中人的殘基。使用來自人源化的單克隆抗體的抗體成分，可避免與鼠恒定區免疫原性有關的潛在性問題。例如，Orland et al.PNAS 863833(1989)描述了用于克隆鼠免疫球蛋白可變區的一般技術，特此將此文獻全部引入作為參考。例如在下列文獻中描述了用于產生人源化單克隆抗體的技術Joneset al，自然321522(1986)；Riechmann et al，自然332323(1988)；Verhoeyan et al，科學2391534(1988)；Carter etal PNAS 894285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotecn.12437(1992)；及Singer et al.免疫學雜志1502844(1993)，特此將這些文獻的有關內容引入作為參考。
本發明的抗體還可能來自從組合的免疫球蛋白文庫中分離出的人抗體片段。參見例如，Barbas et al方法酶學方法手冊，Vol.2.p119(1991)；Winter et al，免疫學年評，12433(1994)，均特此引入作為參考。用于產生人免疫球蛋白噬菌體文庫的克隆和表達載體，可以從例如STRATAGENE克隆系統(La Jolla.CA)獲得。
此外，本發明的抗體還可能從人單克隆抗體獲得。這種抗體可從轉基因小鼠得到，此小鼠已被“工程構建”，在對抗原刺激的反應中產生了特異性的人抗體。在此技術中，是將人重鏈和輕鏈基因座成分導入來自胚胎干細胞系的小鼠品系中，此干細胞系包含有內源性重鏈和輕鏈基因座的定向斷裂片段。此轉基因小鼠可以合成對人抗原特異性的人抗體，并且可以應用這種小鼠產生分泌人抗體的雜交瘤。如下文獻中描述了從轉基因小鼠獲得人抗體的方法Green et al，Nature Genet.713(1994)；Lonberg et al，自然368956(1994)，和Toylor et al，國際免疫學6579(1994)，特此均被引入作為參考。
本發明的抗體片段可以通過對該抗體的蛋白水解作用，或者通過在E.Coli中表達編碼該片段的DNA來制備。借助于常規的方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗體，可以獲得抗體片段。例如，通過用胃蛋白酶酶促斷開抗體可以產生抗體片段，提供以符號F(ab′)2表示的5S片段。還可以應用硫醇還原劑并任選地應用巰基封閉基，導致二硫鍵斷開而進一步切開此片段，產生3.5S Fab′單價片斷。另一種方式是應用胃蛋白酶的酶促斷開，直接產生二個單價的Fab′片段和一個Fc片段。在例如Goldenberg的美國專利No.4,036,945和No.4,331,647，以及其中包含的參考文獻中，描述了這些方法。特此將這些專利全部引入作為參考。還可參閱Nisonhoff et al，生物化學和生物物理檔案89230(1960)；Porter，生物化學雜志73119(1959)；Edelmanet al，酶學方法，Vol.1，p422(Academic Press 1967)；以及Coliganet al，第2.8.1-2.8.10節，和2.10.1-2.10.4節。
還可應用其它斷開抗體的方法，例如分開重鏈形成單價的輕-重鏈片段，進一步斷開這些片段，或者其它的酶促、化學或遺傳技術，只要這些片段可同被該完整抗體所識別的抗原相結合。
例如，Fv片段包括VH和VL鏈的結合。如在Inbar et al，PNAS692659(1972)中所述，這種結合可能是非共價的結合。另外，可變鏈的連接還可以通過分子間的二硫鍵，或者借助于化學試劑如戊二醛交連。參見例如Sandhu，同上。優選地，此Fv片段含有通過肽鍵連接的VH和VL鏈。可通過構建一個結構基因來制備這種單鏈抗原結合蛋白(sFv)，此結構基因含有編碼由寡核苷酸連接的VH和VL功能區的DNA序列。將此結構基因插入一個表達載體，隨后將此載體導入宿主細胞如E.Coli。此重組的宿主細胞可合成具有連接二個V功能區的連接肽的多肽單鏈。例如在下面的文獻中描述了產生sFvs的方法Whitlow et al，方法酶學方法手冊，Vol 2，p97(1991)；Bird etal，科學242423-426(1988)；Ladner et al，美國專利No.4,946,778；Pack et al，生物/技術學111271-77(1993)，和Sandhu，同上。
抗體片段的另一種形式是編碼單一互補決定區(CDR)的肽。可以通過構建編碼所需抗體CDR的基因來獲得CDR肽(“最小的識別單位”)。例如可應用聚合酶鏈反應，從抗體產生細胞的RNA合成此可變區來制備這種基因，參閱例如Larrick et al，方法酶學方法手冊Vol.2p 106(1991)。
通過建立抗SM1單克隆抗體實現了分離和鑒定SM1蛋白的目的。在Harlow & Lan，抗體實驗室手冊(冷泉港實驗室1988)中描述的一般程序可用于制備特異性單克隆抗體，特此被引入作為參考。對3只雄性Lew/hsd大鼠(Fox Chase癌癥研究所動物中心，Philadelphia，PA)，通過皮下注射懸浮在與完全性福氐佐劑混合的0.5mlPBS中的5×107BL3細胞進行免疫。在注射之前采集免疫前的血清。三周之后以1×108BL3細胞的劑量作皮下注射加強免疫。隨后每隔2周共進行了三次加強注射。在第二次和第三次加強注射之后采集免疫抗血清，并通過活細胞酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫沉淀法進行檢測。檢測表明所有的血清對BL3細胞顯示陽性，對EL4細胞(一個T細胞系)顯示陰性。抗血清的滴度范圍在1∶1000-1∶10000。
在進行融合前的三天，給一只陽性大鼠靜脈內注射無佐劑的另外1億個BL3細胞。在第三天，通過CO2窒息法殺此大鼠，取出脾臟，在Dulbecco′s改進的Eagle培養基(DMEM)+2％胎牛血清(FCS)中制備單細胞懸液。以10∶1的比率混合脾細胞和yB 2/0骨髓細胞，在50％聚乙二醇(PEG)的存在下進行融合。通過在HAT選擇性培養基中培養此混合細胞，而選擇出雜交瘤細胞克隆。
大約二周之后，對此雜交瘤進行篩選，篩選出產生對BL3細胞特異性抗體的雜交瘤。應用間接免疫熒光標記法，通過本領域熟知的標準程序進行篩選。將1百萬個洗過的BL3細胞或其它對照細胞如EL4，FDC-P1和WEH-3細胞，與80μl雜交瘤上清液在4℃共孵育30分鐘，洗2次之后在同樣條件下以FITC結合的羊抗-大鼠IgG+M第二抗體作進一步標記。洗過之后，通過光學顯微鏡檢查對每個細胞克隆進行篩選。以抗血清作陽性對照，以免疫前的血清或某些雜交瘤上清液作陰性對照。來自170個雜交瘤中的3個細胞顯示出對BL3細胞具有特異性。這3個細胞中，一個可識別被命為SM1的分子。借助于標準的免疫擴散試驗，顯示此SM1單克隆抗體是免疫球蛋白IgM的同種異型。SM1 DNA的分離可通過首先構建Lambda gtll cDNA噬菌體表達文庫來實現對SM1 cDNA的分離。構建此cDNA文庫的步驟如下。為了分離聚腺苷酸RNA，可應用苯酚/氮仿/胍基硫氰酸鹽法提取總RNA，Sambrook etal，分子克隆，第二版(冷泉港實驗室出版1989)。在10ml 4M GTC溶液(25mM檸檬酸鈉，85mM月桂基肌氨酸鈉，4M胍基硫氰酸鹽和0.1M 2-巰基乙醇)中使細胞(5×108-10×108)裂解。使之通過20號針頭而對DNA進行剪切。通過加入10ml 4M GTC溶液而使體積增加至20ml。加入2ml 4M NaAc(pH4.0)，充分混合均勻，然后加入等體積DEPC-H2O飽和的苯酚。徹底混勻此混合物之后，加入最后體積為10％的氯仿，再次強力混勻。將此混合物在冰浴上放置15分鐘，然后以2500g離心20分鐘(在Sorvall RC-5B離心機中，用Sorvall SA600轉子，轉速5000rpm)。將含有RNA的上層水相轉移至另一干凈的試管中。使用等體積異丙醇，在-20℃下沉淀RNA 1小時。以2500g離心20分鐘后得到RNA沉淀物，將它溶解于0.4ml 4M GTC溶液中。用10μl 1M HAc和300μl乙醇再次沉淀此RNA。將最后得到的RNA沉淀物溶解于0.5ml 1mM EDTA/0.05％SDS中，貯存于-70℃。為選擇聚腺苷酸RNA，使之二次通過從Collaborative Research得到的寡脫氧胸苷酸-纖維素柱，Maniatiset al，分子克隆-實驗室手冊(冷泉港實驗室，1982)。1×結合緩沖液是由20mM磷酸鈉和0.5M NaCl組成。被選出的聚腺苷酸RNA的含量大約是所使用總RNA的5％，O.D260/O.D280的比率為2.0。將此聚腺苷酸RNA小份分裝，同1/10體積的3M NaAc和3倍體積的乙醇混合，貯存在-70℃。
為了啟動第一條cDNA鏈的合成，可按照BRL的說明書，以寡脫氧胸苷酸(dT)和隨機六聚體作引物，借助于逆轉錄酶Superscript II(GibcobPL)，將20μg BL3或HL60(用于構建人cDNA文庫的)聚腺苷酸RNA逆轉錄成為cDNA。大約有30％聚腺苷酸RNA被轉變成為cDNA。使所合成的cDNARNA雜合體通過瓊脂糖CL-4B柱(Pharmacia)進行大小-分級分離，以便除去小片段cDNA。
將3μg第一條cDNARNA雜合體鏈用于合成第二條cDNA鏈，通過使用RNA酶H，DNA聚合酶I，E.Coli DNA連接酶，以及T4DNA聚合酶(BMB)，以DNA鏈取代了RNA鏈。借助于EcoRI甲基化酶(Promega)將雙鏈DNA中的EcoRI識別位點甲基化，以便防止在后面的步驟中發生被EcoRI消化，將3個不同的EcoRI接頭(8聚體，10聚體和12聚體)，按接頭cDNA為100∶1克分子的比率與雙鏈cDNA連接，以便產生3個不同的讀框，用于翻譯文庫中的任何一種cDNA。連接之后，進行EcoRI消化，以便在每個cDNA分子中產生EcoRI粘性末端。使之通過瓊脂糖CL-4B柱進行大小-分級分離，除去剩余的EcoRI接頭。
下一步是，為了與噬菌體載體連接，并包裝進入噬菌體顆粒，應用噬菌體包裝提取物(Stratagene)，按照廠商的說明書，使具有EcoRI位點的雙鏈cDNA與λgtll/EcoRI載體(Stratagene)相連接，并被包裝進入噬菌體顆粒。可通過滴定此包裝混合物來確定cDNA文庫的大小，即以稀釋的包裝混合物感染細菌y 1088。將總共2μgλgtll/EcoRI載體和0.45μg雙鏈cDNA用于連接。對于HL60樣品，使用了5個包裝提取物。λgtll-HL60 cDNA文庫的大小是1.35×106噬斑單位(pfu)。為了構建BL3文庫，使用了四個包裝提取物。λgtll-BL3 cDNA文庫的大小是1.5×107pfu。通過感染細菌y1088將這些文庫擴增了-次。為了確定文庫中cDNA的平均大小，隨機挑取了18個噬菌體克隆進行分析。提取出噬菌體DNA，并用EcoRI消化，以便釋放cDNA插入片段。通過以來自所有18個噬菌體DNA樣品的EcoRI片段的總大小除以18，得到了cDNA的平均大小為1.4kb。
為了篩選此噬菌體cDNA文庫，通過將系列稀釋的抗體上清液，以及YB 2/0骨髓瘤細胞系的上清液(陰性對照)，與BL3細胞的裂解物共同溫育，同時以E.Coli裂解物作對照，對將要用于基因篩選的第一抗體SM1單克隆抗體(MAb)的適當用量進行了預先測定。借助于本領域熟知的免疫擴散法，已表明SM1單克隆抗體是IgM形式。同樣地，對堿性磷酸酶標記的第二抗體的最佳用量也進行了預測定。對于來自Sigma的堿性磷酸酶標記的抗-大鼠輕鏈(k和λ)單克隆抗體，和來自Rockland的堿性磷酸酶標記的抗-大鼠IgM(μ-鏈特異性的)抗體，測定了它們與SM1 MAb的特異性相互作用。將大鼠IgM(來自Rockland)和E.Coli噬菌體裂解物(來自Stratagene)用作陰性對照。以封閉液對每種蛋白質作5倍系列稀釋，從起始濃度10μg/ml稀釋至2μg/ml，再稀釋至，0.4μg/ml，最后稀釋至0.08μg/ml。以每種溶液1μl在尼龍膜上點樣。作四片相同的膜，將它們的每一片用于以不同稀釋度的不同抗體點樣。將這些膜片在封閉液中，在室溫下振蕩1小時。在不同的第二抗體溶液中，即1∶2000和1∶10000稀釋的抗(k和λ)及抗μ抗體中溫育每個膜片。與用相同稀釋度(1∶10000)的抗k和λ輕鏈單克隆抗體相比較，抗IgM μ鏈特異性抗體對12A6 IgM抗體具有更高的特異性，更強的信號和較低的背景干擾。因此，將1∶10000稀釋度的抗-IgMμ鏈特異性抗體用于抗體篩選試驗。
然后以抗-SM1抗體，按照廠商的說明書(Stratagene，La Jolla，CA)在最佳條件下對cDNA文庫進行了篩選。取一接種環生長在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板中的Y1090R菌，接種于以0.2％麥芽糖和10mM MgSO4補充的15ml LB中。將此培養物在37℃振蕩培養直至O.D600達到0.5-1.0。使細胞沉淀后，再懸浮于10mM MgSO4中使成0.5 O.D600/ml。取0.6ml細菌，與含有50000pfu的λgtll-BL3文庫噬菌體貯備液混合，在37℃溫育15分鐘。對此混合物加入8ml頂層瓊脂(在NZCYM中的0.7％瓊脂糖)，在150mm NZCYM板上鋪平板。制備20塊這種平板，在42℃溫育3.5-4小時，直到形成清晰的噬菌斑。將以10mM IPTG預處理過的干尼龍膜(來自MSI)復蓋于此平板上，并在37℃溫育此平板3.5小時，以及使此噬斑轉移至膜上。從平板上揭下此膜，在TBST(20mM Tris.Cl pH7.5/150mMNaCl/0.05％ Tween 20)中漂洗膜4次，每次15分鐘。在封閉液(溶于TBS(20mM Tris.Cl pH7.5/150mM NaCl)中的1％ BSA)中將它們進一步封閉至少1小時，以便消除非特異性信號。此后，將10倍稀釋的SM1單克隆抗體培養物上清液加到封閉液中，每片膜8ml，在室溫下振蕩培育3小時。下一步是在TBST中漂洗此膜5次，每次5分鐘，并在含有以堿性磷酸酶標記的第二抗體(Rockland，抗-大鼠IgM(μ)-AP，1∶10000稀釋)的新鮮封閉液中，室溫下緩慢振蕩溫育3小時。最后，在TBST中漂洗此膜片，在顯色液(以0.1M Tris.ClpH9.5/50mM MgCl2/0.1M NaCl150稀釋的NBT/BCIP貯備液，來自BMB)中，黑暗環境下溫育5-10分鐘，并記錄實驗結果。
從被篩選的大約1千萬個噬斑中，鑒別出了10個強陽性克隆。作基因排列圖和雜交研究顯示，其中6個克隆是相同的，二個不含有插入的DNA，另外2個沒有充分地分析。對6個強陽性克隆中2個的DNA進行了測序。
對表達SM1的陽性克隆的序列分析揭示了部分核苷酸序列，顯示在圖1中。應用國家生物技術信息中心(NCBI)的BLAST網絡服務，在基因庫中搜索，以及從非冗余的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列的數據庫中搜索，表明在SM1 DNA序列與任何其它長度小于100堿基對的序列之間，沒有任何同源性。在轉變成為氨基酸序列之后，一個讀框翻譯成與如下其它已知的蛋白質具有小于30％序列同源性的蛋白質酵母葡糖淀粉酶前體(檢索號#p08640)，糖蛋白X前體(檢索號#p28968)，酵母α-凝集素吸附亞單前體(檢索號#p32323)，孢子外殼蛋白sp96(檢索號#1103869)，牛皰疹病毒gp80(檢索號#z84818，e300478)，皮膚粘蛋白C.1(Q05049)，或微絲蚴鞘蛋白(檢索號#1163086，U43510)。SM1基因的表達在RNA水平和蛋白質水平檢測了小鼠SM1基因的表達。應用購自Clontech(Palo Alto，CA)的RNA印跡試驗濾器，對來自小鼠多種器官的樣品進行了RNA印跡分析。用SM1的1.5kb EcoRI片段或γ-肌動蛋白DNA作探針。按照廠商的建議所確定的標準程序進行雜交和隨后的漂洗。對X-射線膠片曝光3天之后，在大多數組織觀察到與此SM1探針雜交的7.5kb特異性片段。在以γ-肌動蛋白探針的感光帶校正之后，可見睪丸中感光帶的密度最高，在脾和肺中密度最低。因此，似乎普遍存在SM1基因在RNA水平的表達。對于從包括BL3，EL4，WEHI-3和70 Z/3的不同細胞系提取的RNA，得到了類似的結果，顯示存在相同的7.5kb SM1 RNA感光帶(未公布的資料)。
借助于免疫沉淀法，按照如下的程序對SM1蛋白的特征進行了鑒定。獲得2千萬個BL3細胞，用P2緩沖液(PBS加2％ FCS)洗2次。用0.5ml P2緩沖液再懸浮此細胞沉淀，同10μg IgG在4℃共培育2小時。用P2洗細胞2次，并用與所述用于蛋白質印跡試驗相同的裂解緩沖液使細胞溶胞。將細胞裂解物在冰浴上放置30分鐘，離心，將上清液轉移至裝有40μl蛋白A-瓊脂糖懸液(50％體積膨脹的瓊脂糖，BMB)的試管內。在4℃，將它們再培育2小時。收集抗原-抗體-蛋白A-瓊脂糖復合物，用裂解緩沖液洗3次。用40μl 2X樣品緩沖液再懸浮此沉淀物，煮沸3分鐘，在室溫下離心2分鐘。收集上清液，借助于7％ SDS-PAGE進行分離。
35S-甲硫氨酸標記的細胞與SM1抗體的免疫沉淀反應表明，只有BL3細胞在細胞表面表達SM1蛋白，而表達SM1 RNA的其它細胞系不表達SM1蛋白。見圖2。
如上面所指出的，本發明一方面是關于基本上不含有其它蛋白質的SM1蛋白，借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE測定時它具有大約230KDa的分子量，并且SM1蛋白存在于人和小鼠的造血干細胞及原始前身細胞的表面，但是不存在于包括FDC-P1髓樣前身細胞，EL4 T-細胞，WEHI-3骨髓單核細胞，以及70 Z/3前-B淋巴細胞的其它細胞表面，或者也不存在于人臍帶血或小鼠骨髓中已分化的造血細胞表面。本發明還包括SM1的肽片段。在對造血干細胞發育的研究中，這些肽片段可能提供研究和診斷的工具。此外，含有分離和純化的SM1肽片段的藥劑組合物，還可能對多種疾病如獲得性免疫缺損綜合癥(艾滋病)提供有效的治療作用。
應用SM1 DNA序列在基因庫中的搜索表明，它與編碼一種受體分子的序列具有微弱的序列同源性。最近，有人將人免疫缺損病毒(HIV)的感染過程與趨化因子/細胞因子的受體分子相關連，并認為HIV病毒的進入需要不只1個受體分子。Cocchi et al，科學2701811(1995)Paxton et al，Nature Med.2412(1996)；Dragic et al，自然381661(1996)；Simmons et al，科學276276(1997)。由于細胞因子或趨化因子與它們的對應受體相結合，可達到阻止病毒進入目的。SM1也可能是一種新型受體，以致使通過與其配體的結合可能阻止HIV病毒的進入，因此，使靶細胞對HIV感染具有抗性。
本發明不僅涉及天然存在的SM1片段，而且還涉及SM1突變體和SM1的化學合成衍生物。例如，本發明考慮到SM1的氨基酸序列發生改變的情況。可通過改變編碼SM1蛋白質的DNA來修改SM1。優選地，應用具有相同或類似特點的氨基酸，只嘗試改變保守的氨基酸。例證性的氨基酸取代包括丙氨酸變成絲氨酸，精氨酸變成賴氨酸，天冬酰胺變成谷氨酰胺或組氨酸，天冬氨酸變成谷氨酸，半胱氨酸變成絲氨酸，谷氨酰胺變成天冬酰胺，谷氨酸變成天冬氨酸，甘氨酸變成脯氨酸，組氨酸變成天冬酰胺或谷氨酰胺，異亮氨酸變成亮氨酸或纈氨酸，亮氨酸變成纈氨酸或異亮氨酸，賴氨酸變成精氨酸，谷氨酰胺或谷氨酸，甲硫氨酸變成亮氨酸或異亮氨酸，苯丙氨酸變成酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸，絲氨酸變成蘇氨酸，蘇氨酸變成絲氨酸，色氨酸變成酪氨酸，酪氨酸變成色氨酸或苯丙氨酸，纈氨酸變成異亮氨酸或亮氨酸。
此外，其它的SM1變異體和片段也可以用于本發明。變異體包括SM 1的相似物，同源物，衍生物，突變蛋白和擬態物。SM1的片段指的是SM1的部分氨基酸序列。可通過化學修飾，蛋白水解酶消化，或者它們的組合處理，從SM1本身直接產生這種變異體和片段。此外還可以應用遺傳工程技術，以及從氨基酸殘基直接合成多肽的方法。
通過在Saragovi et al，科學253792-95(1991)中所概述的方法，可以產生模擬SM1的結合和功能的非肽化合物(“擬態物”)。擬態物是可模擬蛋白質二級結構要素的分子，參閱例如Johnsonet al“肽與擬態物”(“Peptide Turn Mimetics”)，在“生物技術學和藥學”中，Pezzuto et al，Eds(Chapman and Hall，NewYork 1993)。使用肽擬態物的基本理由是，蛋白質肽骨干的存在主要是為了以這樣一種方式定向氨基酸側鏈，以便于分子的相互作用。對于本發明的目的，可以把適當的擬態物認為是SM1本身的等價物。
還可以應用基因組或cDNA克隆法，通過重組技術產生變異體和片段。可應用位點特異性誘變和區域定向誘變技術。參閱現代分子生物學方案第一卷，第8章(Ausubel et al，eds.，J.Wiley & Sons 1989& Supp.1990-93)；“蛋白質工程”(Oxender & Fox eds.，A.Liss，Inc.1987)。此外，還可以將接頭分區技術和PCR-介導技術用于誘變，參閱“PCR技術”(Erlich ed.，Stockton Press 1989)；“現代分子生物學方案”Vol1和2，同上。在“蛋白質工程”(同上)和“現代分子生物學方案”第一和第二卷(同上)中，公開了應用上述任何一種技術的蛋白質測序，構建和仿造手段。應用抗-SM1抗體富集造血干細胞CFU-S-形成細胞是多能性造血前身細胞能夠短期重建受致死性輻射的小鼠。如在Wong et al，(1994)，(同上)中所述，應用供體成熟的骨髓細胞進行CFU-S-脾-病灶試驗(spleen-focusassays)。供體小鼠是近交的雄性C57BL/6J小鼠(Jackson實驗室，Bar Harbor，ME)，受體小鼠是同品系的雌性小鼠。為了制備標記的骨髓細胞，用頸脫臼法處死雄性小鼠，按照我們以前所述的方法(Wonget al，(1994)同上)制備骨髓細胞。通過以5∶3的體積比率(細胞LSM)，將全骨髓(BM)細胞群覆蓋在淋巴細胞分離培養基(LSM)上，在25℃以1600rpm的速度離心20分鐘，分離出單核細胞(MNC)。用P5(以5％ FCS和0.02％疊氨鈉補充的磷酸緩沖鹽水(PBS))洗2次之后，將此細胞與FITC-標記的抗體(Ab)，按照每毫升10×106個細胞/10μg Ab的濃度混合，并在冰浴上培育30分鐘。將Ab-標記的細胞洗3次，按5×106個細胞/ml的濃度再懸浮于P5中，用于FACS分析和細胞分選。最初的分析提示，應用間接免疫熒光試驗可能有1-5％骨髓細胞與SM1雜交瘤細胞上清液為染色陽性，因為在骨髓中僅含有少量原始干細胞或前身細胞，所以只分選了用SM1清晰染色的0.1％BM細胞。將這些分選的雄性小鼠細胞用作供體細胞的來源。
對于受體雌性小鼠，在輸入SM1分選的細胞之前，對每只小鼠以9.5Gy的劑量照射。用銫源Mark 1(30-1型)輻射源(JL Shepherd& Associates，San Fernando，CA)實驗照射。隨后將不同數量分選的SM1細胞懸浮于0.5ml R2培養基中，靜脈內輸入受照射的受體雌性小鼠，12天之后，從接受供體小鼠100-1000個SM1分選細胞的，雄性小鼠對照未分選骨髓細胞的，或者雌性輔助細胞的受體小鼠，分別解剖取出CFU-S脾病灶。然后從其中的每個病灶中提取出DNA。
為了提取DNA，將每個解剖出的CFU-S病灶置于含有0.5mlPBS的Eppendorf小試管內，通過反復吸吹制備成單細胞懸液。用PBS洗細胞一次，并在DNA提取緩沖液中使細胞溶胞。隨后用100μg/mlRNA酶在37℃處理1小時，并在56℃用100μg/ml蛋白酶K處理3小時。然后用苯酚/氯仿提取DNA2次，并用2M乙酸銨和2X體積無水乙醇使之沉淀。此后再將DNA溶解于0.4ml TE緩沖液中，并測定DNA的濃度。為了檢測此病灶是否起源于供體小鼠SM1+細胞，使用了pY2探針。此探針顯示出對雄性細胞中Y染色體具有相對特異性，Lamer& Palmer細胞37171(1984)。因為此探針對于雄性染色體的特異性不是絕對的，所以應作二步分析首先對全部樣品進行斑點印跡分析，隨之對斑點印跡試驗的陽性樣品進行DNA印跡分析。
為了作斑點印跡分析，將每個樣品的5μg DNA與0.1體積的3MNaOH混合在65℃溫育30分鐘，以便使DNA變性，并破壞RNA。然后用0.1體積pH7.0的2M乙酸銨使之中和，并在NYTRAN尼龍濾膜上點樣。將4/5的樣品用于與pY2探針雜交，1/5的樣品與GAPDH探針雜交。然后，應用pY2 DNA片段作探針，將陽性樣品用于DNA印跡分析，以便證實存在Y-特異性帶。為了進行DNA印跡分析，一般是將10μg DNA用BamHI限制性酶消化，消化的DNA經處理后，轉移至尼龍濾膜并與隨機引物標記的pY2探針雜交。
來自100 SM1+細胞受體小鼠的某些CFU-S病灶的DNA，顯示出與pY2雄性特異性探針雜交陽性(圖3)。那些雜交陰性的DNA推測是來源于內源性短期CFU-S形成細胞。這些CFU-S病灶的每一個都顯示出含有已分化的紅細胞樣細胞和髓樣細胞。為了從斑點印跡分析或DNA印跡分析得到陽性信號，大約需要150萬個細胞，產生15μg雄性-特異性DNA。因此，這些結果表明，某些供體的SM1+細胞是多潛能性短期造血干細胞。
估計小鼠骨髓中SM1-細胞大約是1-5％。為了探索造血干細胞是否存在于SM1+細胞的亞群中，排除了具有譜系特異性標志陽性的細胞，即CD4細胞(T輔助細胞)，CD8細胞(T殺傷細胞)，Gr-1細胞(粒細胞)，TER119細胞(紅細胞樣細胞)，Mac-1細胞(巨噬細胞)和B220細胞(前B細胞)，可將這些Lin-細胞(對譜系陰性的)進一步分為SM1+細胞和SM1-細胞。通過應用針對所有的譜系特異性標志的PE(聚赤蘚素)標記抗體和FITC-標記的SM1抗體，對小鼠骨髓細胞進行了FACS分析。圖4顯示了這種雙顯色的分析結果。
為了檢測原始干細胞/前身細胞的存在，將SM1+/Lin-分選的細胞，在本領域技術人員熟悉的半固體甲基纖維素基因克隆培養基上作平板接種。Han et al，PNAS，9211014(1995)中詳細地描述了此測定法，特此引入作為參考。是通過分選出SM1+/Lin-細胞來進行這次實驗，此細胞由0.06％小鼠單核細胞群組成(0.3％×0.2％[面積A的百分數]＝0.06％)。在美洲商陸-分裂素刺激的脾細胞條件化培養基(SCM)，或者BL3條件化培養基(BLCM)存在的條件下，在每個平皿上平板接種了大約1000個細胞。7-12天之后，記錄造血細胞集落的數目和類型。
在沒有條件化培養基作為生長因子的來源時，不能看到有集落。在SCM存在的條件下，由不同類型晚期分化細胞組成的多譜系混合型集落，以顯著的頻率存在(表1)。比此多譜系集落更早的是未成熟細胞集落，這種集落在開始培養后12天較為明顯。未成熟細胞集落中的細胞已顯示出具有CFU-S形成的能力，因此，其中的一些細胞至少是處于CFU-S形成細胞，即短期造血干細胞的階段。值得注意的是，存在新型的緊密集落。這些集落是未分化細胞的緊密凝集，只是當培養物中在存SCM或BL3CM時才能發現。以前就發現了BL3CM含有獨特的干細胞活性，但是缺乏許多已知的造血生長因子，Wong et al(1994)同上。也已發現BL3的這種干細胞活性存在于SCM中。因此，緊密集落中的細胞甚至可能比存在于未成熟細胞集落中的細胞更早。
培養12天之后，在僅有BL3CM存在的實驗條件下，已不再觀察到緊密的集落(表1)。在培養7天之后，發現這些集落正在瓦解。這也與此活性是干細胞特異性的，并且它只刺激干細胞自我更新的觀察是一致的，但是，為了集落能進一步發育，并擴大體積，則需要例如SCM中的輔助生長因子。表1.骨髓來源的SM1+/Lin-細胞的集落形成能力。
每個平皿上每1000個細胞集落的數目和類型第7天 第12天緊密型分散型 混合型 未成熟型 緊密型 混合型 未成熟型 CFU-C1 無GF 0 00 0 000 02 SCM6，5，11 7，6，6 0，1，0 5，3，4 4，5，4 3，2，3 4，4，53 BL3CM 5，8，4 00 0 000 0在開始培養之后的第7天和第12天，記錄集落的數目和類型。每個試驗點平行制備三個平皿。在所有的平皿中都未觀察到集落的試驗點以一個數字“0”表示。除了新型的緊密集落之外，其余的集落類型按照Han et al(1995)，(同上)中報導的確定。緊密型集落是未分化的細胞顯示緊密凝集的集落，估計其平均大小為50-200個細胞。對人SM1 DNA的特征鑒定為了分離出SM1基因的人對應物，用HL60細胞系的mRNA構建了λgtll cDNA文庫，此HL60細胞系是人骨髓單核細胞白血病細胞系，它表達對小鼠SM1 DNA特異性的三種mRNA。如已描述的，HL60cDNA文庫的構建法類似于構建BL3λgtll cDNA文庫的方法。將1.5kb的EcoRI小鼠SM1片段用于篩選HL60 cDNA文庫。獲得了幾個陽性克隆。對二個克隆的DNA進行了測序，并且，如在圖5中所顯示的，它發現帶有此序列的一個區域是二種DNA樣品共有的。在基因庫的EST文庫中的搜索表明，此序列與人cDNA(例如檢索號H98251)是同源的；甚至對此cDNA的已知功能尚無報導。人SM1基因的表達為了檢測人SM1基因是否被表達，對來自不同人器官(Clontech，La Jolla)和人細胞系的RNA樣品進行了RNA印跡試驗分析。雖然在BL3 RNA中只存在單一的7.5kd預期帶，但是，在HL60骨髓單核細胞系的RNA中存在三個帶(9.0kb，7.5kb和4.0kb)，而在K562細胞的RNA中僅存在4.0kb帶。在對來自人器官RNA的RNA印跡試驗分析時，在絕大多數樣品都觀察到所有的三個帶，4.0kb帶最顯著，在睪丸和卵巢中9.7kb帶和7.5kb帶最豐富，特別是在以γ-肌動蛋白對信號強度進行校正之后。
人細胞中有三種mRNA與小鼠SM1探針顯示雜交陽性。在這三種mRNA中，可能只有一種對人SM1蛋白質的細胞表面表達負責。考慮到這幾種mRNA中都具有共同的RNA序列的事實，說明這三種mRNA可能是通過有差異的剪接方式相關聯。按另一種方式，這三種mRNA可能代表作為單基因家族成員的三種不同基因的產物。
對于人細胞中存在三種mRNA的生物學意義尚不了解，是否它們是三種不同但相關的SM1基因的產物，或者是有差異剪接的結果也不清楚。值得注意的是，CD34基因轉錄產生二種mRNA，并且這是由于有差異剪接的結果，Sude et al，血液792288(1992)；Nakamura et al實驗血液學21236(1993)。從造血干細胞富集的角度，有可能不是所有幾種SM1 RNA都將導致產生SM1蛋白質。因此，重要的是指出，在睪丸和卵巢中9kb帶和7.5kb帶是豐富的，類似于在小鼠睪丸中SM 17.5kb RNA的情況。此結果也與在CD34中，全長度而不是截短的CD34可抑制造血細胞分化的發現相一致，Fackler et al，血液，853040(1995)。
對不同的人細胞系的分析表明，表達全部三種SM1 mRNA的HL60細胞，在它們的細胞表面也表達SM1；而僅表達4kb種類RNA的K562細胞，在它們的表面不表達SM1蛋白。在另一個細胞系J45也微弱地檢測出SM1蛋白。
將不同細胞系的裂解物與SM1抗體進行免疫沉淀反應，并借助于SDS-PAGE對免疫沉淀物進行分辨。用BL3細胞裂解物作陽性對照。用35S-甲硫氨酸(0.25mCi)對每個樣品的5百萬個細胞標記1小時，然后在4℃與20μg SM1抗體免疫沉淀反應2小時。用PBS洗細胞之后，在0.5ml IP緩沖液(130mM NaCl，10mM Tris.Cl pH7.5，5mM EDTA，1％Triton X-100和蛋白酶抑制劑)中溶胞。通過離心使裂解物澄清。然后對每個樣品加入4μg羊抗大鼠IgM抗體，并將此樣品在4℃溫育過夜。用蛋白G-瓊脂糖將蛋白質-抗體復合物拉出后，將樣品煮沸，并在5％ SDS-PAGE上進行分辨。然后用25％異丙醇和10％乙酸固定此凝膠30分鐘，并用增強液(Enlightaning，DuPont)再處理30分鐘。此后，使凝膠干燥，并對X-射線膠片曝光。應用SM 1抗體富集人造血干細胞SM1單克隆抗體也可以識別人造血細胞(圖6)。因此可進行熒光激活細胞分類(FACS)分析，以便測定在其細胞表面表達SM1分子的細胞比例。為此，首先對來自人臍帶血的1百萬個單核細胞以一種抗體混合物染色，此抗體混合物包含大鼠抗-CD38，大鼠-抗-血型糖蛋白A和/或抗-CD33和抗-HLA-DR以及PE標記的抗-大鼠抗體。這些抗體可檢測譜系特異性抗原，具有這些抗原的細胞被稱為Lin+細胞。洗2次之后，將這些細胞與100μl抗-SM1雜交瘤上清液在冰浴上共孵育30分鐘。然后再洗這些細胞，并進一步用FITC標記的抗-大鼠IgM第二抗體染色。基于右角和前向散射，對淋巴樣細胞群啟動FACS分析，然后根據熒光強度進行分析。在左面的A區顯示出淋巴細胞和小細胞的分布，在此細胞群中已知存在造血干細胞。如圖6右面所示，對A區再分析和再繪圖表明，SM1+Lin-細胞構成整個臍帶血單核細胞樣品的大約0.3％(在區域4中顯示為0.4％)。單獨應用SM1抗體時，發現1％人臍帶血單核細胞攜帶SM1抗原。已經發現在人臍帶血中造血干細胞以非常高的頻率存在，Xiao et al，血液20455(1994)。相比之下，也被Haylock et al，血液801405(1992)用于造血干細胞富集的CD34抗原，已顯示存在于大約2％臍帶血細胞上，Broxmeyer et al，PNAS 863828(1989)，存在于大約2％骨髓細胞和0.2％外周血細胞上，Bender et al，血液772591-2596(1991)。
為了檢測造血干細胞活性的一個方面，借助于基因克隆試驗，對構成總臍帶血單核細胞群0.3％的SM1+/Lin-富集的臍帶血細胞進行了檢測。將1千個分選的細胞在甲基纖維素培養基中作平板接種，在存在或不存在條件培養基的情況下培養，此條件培養基(CM)是來自由患有膀胱癌病人產生的5367細胞，已知含有多種能夠刺激原始造血干細胞和前身細胞生長的生長因子，Broxmeyer et al，同上。在10％5367CM存在下培育10天之后，可觀察到含有分散細胞的未成熟細胞的集落(表2)。不存在5376CM時，未發現有集落。這些資料表明，SM1+/Lin-富集的細胞群中含有原始的造血干細胞和前身細胞。
表2.由人臍帶血SM1+/Lin-細胞形成未成熟細胞集落每個平皿中每1000個細胞形成的未成熟細胞集落數目1.不存在5367CM 02.存在5367CM 3，2，3在本發明的一個實施方案中，將抗-SM1抗體用于制備一種富含造血干細胞的組合物。通過提供結合SM1的抗體可達到此目的；將抗-SM1抗體固定化在一種支持載體上，使些抗體保留了它結合SM1的能力，然后使一個混合細胞群與此抗體接觸，當此混合細胞群都含有造血干細胞時，致使干細胞會粘附于支持載體，除去未粘附的細胞，以致使富含造血干細胞的細胞群仍然粘附在支持載體上。“支持載體”意指任何一種固體支持物，如小珠，空心纖維膜，樹脂，塑料Petri氏平皿，或者是一種針對抗-SM1抗體的抗體。
可使此抗體與標記物結合，使之容易分離出這種特殊的細胞類型，例如可同磁性微珠結合，使之可能直接分離，與生物素結合，用結合于載體的親和素或鏈霉親和素可以將它分離出，與熒光染料結合，可用于熒光激活細胞分選法，或者其它的標記物。任何不會過分地損害所保留細胞生命力的技術都可以應用。
通常是在對人移植時，用抗-CD34抗體和生物素化的第二抗體，使之通過親合素柱，以便除去乳腺癌細胞，Bensinger et al，J.Clin.Aphersis 574-76(1990)；Berenson et al，Blood 76509-515(1986)。優選的分離方法包括柱層析法，熒光激活細胞分選法，磁性微珠分離法，以及直接免疫吸附法。
在另一個實施方案中，本發明涉及一個試劑盒，用于檢測結合于SM1的造血因子。“造血因子”意指與血細胞生成有關的任何一種蛋白質。此試劑盒包括本發明的抗體，還可以包括一種可檢測的標記物，以及一套使用此試劑盒的文字說明。這種試盒還可能包括一個被分隔成小室的小盒，以便裝入一個或幾個容器如小藥瓶，小試管等，這些容器內裝有本發明的不同成分。
在再一個實施方案中，是將SM1用于一個檢測方法，檢測樣品中能結合SM1的造血因子。這種方法可用于檢測和評價與造血細胞的再生，分化和成熟有關的因子。可將SM1，以及SM1+細胞用于測定培養基如條件培養基活性的試驗法，并可用于評價液體對細胞生長的活性，包括對特定譜系細胞的貢獻等。在體外這種試驗法包括，使懷疑含有結合SM1的造血因子的樣品與可檢測標記的SM1相接觸。然后檢測造血因子。“樣品”意指任何細胞培養物的培養基，或者任何體液或組織，包括血，尿，唾液，脊髓液，精液，膜液，以及來自身體任何部分的組織。這種試驗法可能包括將SM1結合于固體表面。本領域已知有許多方法可用于將生物分子固定化在固體表面。例如，固體表面可能是一種膜(如硝酸纖維素膜)，微量滴定板，或小珠。結合的分子可能通過非特異性結合，共價或非共價地附著。對于將廣泛不同的化合物連接于各種表面的方法已充分了解，在文獻中也有充分的報導。參閱例如，Chibata，免疫酶，Halsted Press(1978)，和Cuatvecasos，生物化學雜志2453059(1970)，特此將它們的有關內容引入作為參考。
在本發明的測定法中，為了檢測結合SM1的造血因子，可通過本領域熟知的方法標記SM1。通用的方法包括使用放射性同位素如3H，125I，35S，14C或32P。檢測可通過放射自顯影法實現。非放射性標記包括將生物素共價結合于本發明的化合物。然后使生物素與一種抗-配體如鏈霉親和素結合，這種抗-配體或者具有內在性標記，或者結合于一個信號系統，如可檢測的酶，熒光化合物或化學發光化合物。
在另外的一個實施方案中，可將SM1+細胞應用于促進更好地描述參與SM1自我-更新和從其中衍生的細胞群分化的調節的分子機制和細胞相互作用的特征。例如，這種機制可能包括，與SM1介導的信號-轉導相關的，或干擾這種信號轉導的，造血的或非造血的任何一種分子或因子。
還可以將按照本發明純化的造血細胞用于基因治療法中。這種方法可能包含幾種基因構建物，包括通過病毒(例如反轉錄病毒，腺病毒，腺相關病毒，E-B病毒，肝炎病毒，慢病毒)介導的方法，以及非病毒介導的方法，例如將基因轉移進入純細胞。反轉錄病毒介導的基因轉移法是本領域熟悉的，Bodine et al，PNAS 868897-8901(1989)，但是迄今為止，尚不可能應用這種具有SM1的同源細胞群作為轉染的細胞。然后可以將這種轉染的細胞用于治療應用。
遺傳性疾病的治療可通過對SM1細胞進行遺傳修飾，以便矯正其遺傳缺損。例如，幾種疾病如B-地中海貧血癥，鐮狀細胞貧血癥，腺苷脫氨酶缺乏癥等，可能通過將野生型基因導入SM1細胞而給予矯正。基因治療的其它方式包括導入病毒或細菌抗性基因，反義序列或核酶，以便阻止病原體在SM1造血細胞中繁殖。另一種情況是，某些疾病與特殊分泌產物如激素，酶等的過度產生有關，也可將核酶，反義序列或其它抑制因子插入SM1造血細胞，以便抑制這種特殊的疾病。
可以相信，借助于上面的描述，不必進一步精心改進，本領域的技術人員就可以最充分地應用本發明。
權利要求
1.一種基本上不含其它蛋白質的純蛋白質，借助于免疫沉淀法和SDS-PAGE測定時，它具有大約230 KDa的分子量，此蛋白質存在于人或小鼠造血干細胞和原始前身細胞的表面，但是它不存于選自如下的細胞的表面FDC-P1髓樣前身細胞，EL4 T-細胞，WEHI-3骨髓單核細胞，和70 Z/3前-B淋巴樣細胞，以及分化的人臍帶血造血細胞和分化的小鼠骨髓造血細胞。
2.一種抗權利要求1蛋白質的抗體。
3.權利要求2的抗體，它是一種單克隆抗體。
4.一種用于制備富含造血干細胞組合物的方法，包括步驟(a)提供結合SM1的抗體，(b)將此抗體固定化在支持載體上，使此抗體保持其結合SM1的能力，然后(c)使一個混合細胞群與此抗體接觸，其中該混合細胞群含有造血干細胞，致使干細胞附著在支持載體上，(d)除去未附著的細胞，從而，富含造血干細胞的細胞群仍然附著在支持載體上。
5.一種用于制備富含造血干細胞組合物的試劑盒，包含抗權利要求1的蛋白質的抗體。
6.權利要求6的試劑盒，另外還包含有使用此試劑盒的文字說明。
7.一種用于檢測樣品中結合權利要求1蛋白質的造血因子的方法，包括(a)使懷疑含有此生長因子的樣品同權利要求1的蛋白質相接觸，其中該蛋白質具有可檢測的標記，以及(b)檢測該生長因子同可檢測標記的蛋白質的結合。
8.一種用于檢測樣品中造血因子的試劑盒，包含權利要求1的蛋白質。
9.權利要求8的試劑盒，另外還包含一種選自以下的可檢測性標記物熒光標記物，放射性標記物，和酶標記物。
10.權利要求8的試劑盒，另外還包含使用此試劑盒的文字說明。
11.一種分離的DNA分子，它編碼相當于權利要求1蛋白質的蛋白質。
12.權利要求11的分離的DNA分子，包含如下的核苷酸序列GGAATTCCGN CAGCAAGTTC TTATTCTGCC TAAGAATTTT GTGATTCAGCACAAAGAGGG GAAAGCAGTT GAAAAAGAGA TAGCAGCACC TCAGCAGAAAGGCCCAGAGC ATTGCTCACC TGGCCCACAG ACAAGCGCTA CGTGTTCCTTAGTGTCTGTT CCTGTCACCT CTGTGTCTAC CCAACTGCCT AATACAGTTCTCAGTAAGAC AAGTACACCT TCATCAAATG TGAGTGCTAG ATCACAGCCTTTGTCTCCTG TAGCCTCTGT AAGTAATGCA TTAACATCAC CAGTTAAGACTAGCCAAAGT GAAGCAGGAA AAGTCAAGAG TACCGCTTCA TCCACCACACTCCCCCAGCC TCACACTTCA CCTACCATTT CATCAACAGT TCAGCCTCTCTTGCCAGCAA CAACACTAAA TGAATCTACA GATCCTGGCA GTTCCATCCCCTGTTTTTCA CAGCAAACTG TTGATTCTTC TGAGGCAAAG CAAGAACTAAAAACTGTATG TATACGAGAT TCACAGTCAA TTCTTGTTAG GACTCCAGGT-GGGAACACTG GAGTTGTAAA AGTACAAACT AATCCGGAAC AAAATTCACCCAACAGTTTA TCTTCAAGTT CTGTTTTCAC CTTTACACCT CAATTTCAGGCATTTCTTGT GCCAAAATCA ACATCATGCT CTGCTTCCTC ACAAGTAGCCGGAGTGACTA CTACATCTAG TCTACCATCT TTCAGCCAAG CAATCTACGTNTGTGTNGCT TCATCCACCC ATGGGAAAAA TCTCAAATCT ACACAAGGCCAAACCTTGAG CAGTGGTATG TAGGCCCCAT GATAGAAAAA ACGTCATACATGCCCTCTTC ACCCTTGAAG CCTTCTGTTT CTTCCAGCTC ACTGCTACCATCAACAACAA ATAGTTCAGT GAGTGTAATT AGCATATCAA CAGGAAATNNNGGGCAAACC AATACAAATG TTATTCATAC ATCAACTAAA CCACAACAAGTAGATTGTAT CACNAAAAGT TACCCAGTTA CAAGATCAGA AGCAACAACAGCAGTAAATG GTGATGTGCT CGGTGAGACT CCAGGTCAGA AACTGATGCTGGTGTCAGCT CCATCTGGTC TCCCTTCTGG CAGTGTACCT TCAGTTAACACGGCACCAGA ACCGACATCT GCAGGTGTGT CTACCCAGAA GGTAGTTTTTATTAATGCTC CAGTTCCTGG TGGCGCTTCA TCCTCAGCTA TTGTTGCAGAATCATTAAGA CAGTCACTTC CTTCTCCCAC AAATACTGTA TTACTAGTGTGCTTGTAGTA GTTAACTCCA CCATCTTTGT AAGCTAATGA AATTGTGAGTCACCCATTTA TATCTTAATT TTTAATCATG TCAGTTCTTG AATGGGTATCTCCTTAGCCT GCTGATTTCT TTTTCTTTCT AAAGAAAGTG GGTGGAGAAATTAATTTAGA CGTTTGTTTG CAATAAAAAG AATTC
13.權利要求11的分離的DNA分子，包含如下的核苷酸序列GAATTCTTTT TATTGCAAAC AAACGTCTAA ATTAATTTCT CCACCCACTTTCTTTAGAAA GAAAAAGAAA TCAGCAGGCT AAGGAGATAC CCATTCAAGAACTGACATGA TTAAAAATTA AGATATAAAT NGGTGACTCA CAATTTCATTAGCTTACAAA GATGGTGGAG TTAACTACTA CAAGCACACT AGTTATACAGTATTTTGTGG GAGAAGGGCA TACAGACATG GCTAACTTCA TATAGATCCCATTAGACAAC TGGATTTACA ACAAGTTTTT TTAATAAGAA ATGGGCAAAGCAGCTTTCTT TTCAGAATCA AAATGCAGAA CAAATGGAAA AATTATGGTATTAACCTTCA CAAGTTTGAG CCTCCACAAA TAATGCAACC AAGTTTTACATTTTTAACAG CCCTTCTACA TACACTCCAT CTTCTCTATC TTAGTTCCAAGTTTTAGTTT TCAATCCCAA TTATACCAAT TCCATTGTTA TTTTAAGAAAAAACCTTCCC AGTTATTGTC AGAAACTATG ATTTAGCTTA CCCCCTCCACTACNNAGCAA ACTACAGAGA GGATGGAGTG TAATATGAGC AGTACAGAGTCTTAATGCAA TTCATGAGGA CCACTTAGTC CTTACATGAA TCTGGTTGCTAACATTTCTA TTATATTGTG ACAATGACTC CCGACTGTTA TTCTCTGTGAGAAATGGGGG GAGTAAATTC TTAATAAAAG ACACCAGGTA CAAAGCAACATTTTACTTCT GTTGTGATAA AAAAAAAAAA AGGTCACATT TTCAGATAAAATGTGGAACC CTGAAATCTG ACACATTCTC TTATCGTGCC ACCAATGCTGAGGTTCTCTT ACGATTCACT TTTAAACTGC AATTAAAAAT GTACAAAAAAGAAAAGAAAA AAANTCAACC CACAAAGCTT CTAAAAAAGG AACCCGCAGGCACTTCCTCT TGTGGAATGT TTAAAAAGTT AGCCTACTAA AGAAAACAGTCGACTTCTTG TGAAGGTTTT GGAGAAATAT GTATCAGTTC GTTTTATTTGGGTATTCAAT AATATCCTTG GTGATAATGC TGACTCCATG GCTTCTGACCCCAGAATTGA CCCTGCTGCC ACTGGTTGTA GCCCTGAGAT TGATTTTTGTAGCCACGATT GTTTCCTCGT CCTCTGAAGT TCTGGTTGTA GTTCCCTCTGTTGGGCATTC CACCTCTGTT GTAGTTCCCT CTGTTTGAGT AACTACCACGGCCAGGAAAA ACAGGGGCAC GAGGGTATGG ATAGCCGATT CCACCACTTCCTCCACCGCC ACCACCTCTC TGTGGCATGT TGCCCTCCTA TTATATCCGCCACGATTCCC AGGGGCTCCT CCTCTGAAAT TTCCACCACG CATATTGAATCCTCCACGTC TCTATGGCCA CCACCTCTGT TAAACTGGTT CTTGCCACTCTTATTTTTAT TGCTTTTCTT TGAGCCAGTG TTCTGTTTCT TTTCTGGTGGAAGAGCCTTT TTGCTTTCTT CCTTATATTG CTCCAAGAGT TTTTGGGCTTCTTCCTTCTG AAGGGCAACA TAGGTTATTT CATCAAAGCA CTCAGCTACCTCTGGGAGGG TAAAGTTTCC TTTCATTT
全文摘要
一種被稱為“SM1”的蛋白質,借助于免疫沉淀法和SDS－PAGE測定時,具有大約230KDa的分子量。SM1蛋白質分別存在于人和小鼠造血干細胞的表面,以及原始前身細胞的表面,但是不存在于其它細胞的表面,如FDC－P1髓樣前身細胞,EL4T－細胞,WEHI－3骨髓單核細胞,和70Z/3前－B淋巴細胞,或者也不存在于人臍帶血或小鼠骨髓的分化造血細胞的表面。可將抗－SM1抗體用于制備一種富含造血干細胞的制劑。
文檔編號G01N33/68GK1261897SQ98806926
公開日2000年8月2日 申請日期1998年5月1日 優先權日1997年5月6日
發明者P·M·C·王, S－W·鐘, X·韓, H·陳 申請人:干細胞治療公司