發光特異性結合檢測法的制作方法

專利名稱：發光特異性結合檢測法的制作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及用于完成特異性結合檢測的方法和試劑盒。更具體地說，本發明涉及特異性結合檢測法，其中用發光物質，優選光蛋白(photoprotein)，水母發光蛋白作為標記。本發明的發光特異性結合檢測法用于確定全血中各種分析物的存在。
背景技術：
描述特異性結合檢測法可用于定量和定性確定各種物質(本文統稱為“分析物”)。這些物質可以是大的復合分子，如蛋白質、病毒、病毒抗原、細菌細胞、細胞表面受體、酶、激素、多糖、糖蛋白、脂蛋白等，或小的半抗原分子，如肽、一些的激素、治療性藥物、濫用藥物等。
這些檢測法利用了生物分子間發生的特異性結合反應。最常用的特異性結合反應即發生在抗體和抗原之間。在這種情況下，將所述特異性結合檢測法稱為免疫檢測法。也可以使用在其他結合對之間發生的反應。例如，已將在酶與底物之間、激素與受體之間以及核酸互補鏈之間的相互作用用于該目的。也已將其他結合反應，如抗生物素蛋白和生物素之間和免疫球蛋白與免疫球蛋白結合蛋白(如A蛋白和G蛋白)之間的反應用于特異性結合檢測。
可以以各種形式將特異性結合檢測具體化。例如，所述檢測可以是競爭性或夾心檢測。它們可以是同源或異源的，它們可以是順次的或同時的。在最特異性結合檢測中，參與特異性結合反應的結合對中的至少一個成員被標記。所述標記提供了用于檢測和定量分析反應產物的方法。放射性免疫檢測使用含放射性同位素的結合對(如抗原)。在酶免疫檢測中，將結合對成員之一用酶標記。這樣所述酶與產生可檢測信號如顏色變化的底物反應。
發光特異性結合檢測可使用各種化學發光和生物發光標記。一種所述檢測利用稱為水母發光蛋白的光蛋白作為標記。水母發光蛋白是使水母(Aequorea victoria)產生生物發光的一種高親和性鈣離子結合蛋白。天然水母發光蛋白是由一個MW21000道爾頓的多肽鏈組成的光蛋白，含有各一摩爾緊密結合的腔腸動物熒光素和氧。該復合物在沒有鈣離子的條件下是穩定的，但在每摩爾水母發光蛋白結合3摩爾鈣離子后開始光的發射。在存在鈣離子的條件下，水母發光蛋白催化熒光素向氧化熒光素的氧化作用，同時發出保持約10秒的藍光(λ最大=469nm)。參見，Stults,N.L.等，生物化學，31,1433-42(1992)，該文獻作為本文的參考文獻。
可從多管水母屬的組織中分離水母發光蛋白。另外，還可用重組DNA技術生產。參見Cormier,M.J.，美國專利5162227和Zenno,S等，美國專利5288623。還用重組DNA方法生產了生物發光特性改善了的脫輔基水母發光蛋白(apoaequorin)的修飾形式。參見Prasher,D.,美國專利5360728。本文所用術語“水母發光蛋白”包括所述光蛋白的天然和重組形式，以及在前述Prasher專利中所述的修飾形式。
可在特異性結合檢測中用作標記物的其他光蛋白是已知的。所述光蛋白包括obeln、mnemiopsin、berovin、pholasin、熒光素酶和從游水母屬(Pelagia)、海螢屬(Cypridina)和介形類甲殼動物(ostracod)分離的光蛋白。
設計最特異性的結合檢測用于分析生物液，如血液或尿，用于生物學意義的分析物。當特異性結合檢測的目的是為了確定全血中一種物質的存在時，通常必須將樣品預處理以除去可能干擾檢測的細胞組分和血紅蛋白。通常是用全血的血清組分完成特異性結合檢測。或者，已經設計了在特異性結合檢測前加入過濾或吸收步驟，從而使來自細胞組分和血紅蛋白的干擾降到最小的全血檢測。參見，如Chen,F.M.，美國專利5096809。本文中術語“血液”和“全血”可相互替換，并將其定義為指通過身體心血管通道循環的、未經過分離其組分的處理的均一液體，這些組分主要含有細胞、血漿、血清和血纖蛋白。
通常非常需要直接用全血完成特異性結合檢測。直接用全血完成的檢測只需要較少的樣品，因此避免了因預處理步驟而引起樣品損失。此外，如果取消預處理步驟，就可使完成檢測所需的時間最短。在急診室和手術室環境，特別是涉及兒科患者的情況下，這些因素是特別重要的。
發明綜述根據本發明，發光特異性結合檢測法包括步驟(a)得到含有或懷疑含有分析物的全血樣品，(b)將所述樣品與能夠與所述分析物結合的第一結合試劑混合，所述第一結合試劑用發光分子標記，(c)將所述樣品與能夠與所述分析物結合并與分析物或與第一結合試劑結合的分析物形成復合物的第二結合試劑接觸，所述第二結合試劑被固定在固體支持物上；(d)從樣品中分離固體支持物以便從樣品中取出第一結合試劑、分析物和第二結合試劑的復合物；(e)激活在無固體支持物樣品中的發光標記或與固體支持物結合的發光標記，和(f)通過檢測從激活的發光標記發出的光來確定樣品中分析物的存在。
特異性結合檢測法的另一種方法利用了競爭性檢測形式，其中不使用第一結合試劑。在該實施方案中，將全血樣品與已知量的已用發光標記物標記過的標記分析物混合。標記的和未標記的分析物與固定的第二結合試劑競爭，由第二結合試劑捕獲的標記分析物的量與樣品未標記分析物的量成反比。
在具體的實施方案中，本發明的特異性結合檢測利用水母發光蛋白作為發光標記物，并用磁性顆粒作為固體支持物。
在另一實施方案中，本發明涉及發光檢測試劑盒，所述試劑盒含有在本文所述檢測法中所用的試劑。
附圖描述

圖1描述了根據本發明檢測法而得到的校正曲線，說明光發射是無全血標準溶液中和全血條件下的TSH濃度的函數。
發明詳述本發明的發光結合檢測法用于需預處理步驟就確定全血樣品中的分析物。該檢測是靈敏的，并可提供迅速準確的結果，甚至當樣品很少時也可做到。
發光特異性結合檢測是可用夾心或競爭性形式完成的多相檢測(hereogenous assay)。在夾心形式中，它使用了用發光物質標記過的第一結合試劑，如抗體，和作為捕獲試劑的第二結合試劑，如第二抗體。在夾心形式中，第一和第二結合試劑同時能夠與待測分析物結合。所述第二結合試劑被固定在固體支持物上。所述固定可通過將所述第二結合試劑直接或通過固定在固體支持物上的第三結合試劑與所述固體支持物結合來完成。若使用后一種實施方案，第一和第二結合試劑與分析物的反應可以發生在將固體支持物引入樣品之前，在這種情況下，那些反應基本上按照溶液反應動力學發生。或者將所有組分同時加入，這時結合反應同時發生。
將通過第一和第二結合試劑與分析物的反應而形成的復合物經固體支持物與樣品混合物的分離而與未標記的結合試劑分開。在本發明的優選實施方案中，將第二結合試劑直接或經固定的第三結合試劑間接固定在磁性顆粒上。分離步驟包括從樣品中除去顆粒或將所述顆粒定位于樣品內以便檢測發光。
分離固定的復合物后，激活發光標記以引起發光。從樣品或從固定在固體支持物或這兩者上檢測光的發射。
通過將發光標記物與結合試劑偶聯來制備標記的第一結合試劑。所述結合試劑，例如可以是多克隆、單克隆或互補決定區-移植的抗體或其結合片段，如Fab,Fab’或F(ab’)片段或合成的單鏈抗體。或者所述結合試劑可以是核酸(RNA或DNA)鏈或其他參與特異性結合特異性結合反應的分子，如激素、受體、酶、結合蛋白如葉酸結合蛋白或內因子、底物、免疫球蛋白結合蛋白如A蛋白或G蛋白等。所述第一結合試劑與待測分析物有結合親和性。
在競爭檢測形式中，不使用第一結合試劑。將能夠與待測分析物結合的固定的第二結合試劑與樣品或校正標準物以及已經用發光分子標記過的固定量的分析物混合。在樣品或標準物中未標記的分析物與標記的分析物競爭固定的結合試劑。與固定的結合試劑結合的標記分析物的量與樣品或標準物中的分析物量成反比。與在夾心形式中一樣，所述第二結合試劑直接與固體支持物結合或如上述能夠與固定在固體支持物上的第三結合試劑結合。
與第一結合試劑(或分析物，在競爭檢測形式的情況下)偶聯的發光標記可以是當與結合試劑結合時，保持其發光能力的任何發光化合物。優選的發光標記物是水母發光蛋白。當與鈣離子接觸時，水母發光蛋白在全血的吸收值相當低的波長發射高量子產額的藍光。水母發光蛋白作為發光標記物的用途使得可以設計靈敏的全血檢測。
本發明中所用的水母發光蛋白可以是從水母組織中分離的天然水母發光蛋白或者可以是重組(合成的)水母發光蛋白。另外，它可以是生物發光特性改善了的修飾的水母發光蛋白。
可將水母發光蛋白與抗體、核酸、各種分析物以及基本上不干擾所述化合物發光特性的其他結合試劑偶聯。用于將水母發光蛋白和有關光蛋白與結合試劑偶聯的方法由Stults M.L.，美國專利5486455作了描述，該文獻引入本文作為參考。也可以使用本領域已知的其他偶聯方法。
除水母發光蛋白外，在本發明發光特異性結合檢測中可以使用的其他發光標記物包括其他光蛋白、如obeln、mnemiopsin、berovin、pholasin、熒光素酶和從游水母屬、海螢屬和介形類甲殼動物分離的光蛋白，以及非蛋白質類(nonproteinaceous)發光化合物，如2,3-二氫-1,4-phthalayinediones、acridinium酯、acridiniumsulfonalamide、熒光素、魯米諾、1-2-dioxetanes、環酰肼類、銪螯合物和酚衍生物。
如上所述，在夾心或競爭形式中，可將第二結合試劑通過一直接鍵或通過與固定的第三結合試劑的親和性來固定在固體支持物上。在后一種實施方案中，第二結合試劑與第三結合試劑的親和性可采用各種形式。例如，如果第二結合試劑是免疫球蛋白，固定的第三結合試劑可以是免疫球蛋白結合蛋白，如A蛋白或G蛋白或抗免疫球蛋白抗體。或者可用抗原或半抗原標記第二結合試劑，所述第三結合試劑可以是所述抗原或半抗原的抗體。例如，可將第二結合試劑生物素化，在這種情況下，固定的第三結合試劑是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素。相反，可將第二結合試劑與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素偶聯，在這種情況下，固定的第三結合試劑是生物素。生物素與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素形成強的非共價鍵。用于生物素化抗體、蛋白質和核酸的方法是本領域熟知的。參見如Huber E等，美國專利5521319和Carrico,R.J.，美國專利5200313，所述文獻公開的內容引入本文作為參考。
第二結合試劑所固定于其上的固體支持物可以是已知用于多相免疫檢測的任何固體支持物。優選將微顆粒用作固體支持物，因為它們很大的表面積提高了捕獲步驟的效力和動力學。由Craig等美國專利4401765公開的膠乳顆粒和如可從Bangs Laboratories,Inc.,Fishers,IN,46038-2886,USA得到的那些磁性顆粒是優選的。在另外的實施方案中可以使用可從Cortex Biochem,San Leandro,CA得到的Cortex顆粒。也可使用在美國專利4661408(1987年4月28日申請，引入本文作為參考)描述的二氧化鉻顆粒。Obzansky,D.M.,美國專利5369006(引入本文作為參考)中描述了這些顆粒和其在免疫檢測中的用途。Obzansky專利描述了用于將結合試劑如鏈霉抗生物素固定在二氧化鉻顆粒表面的方法。
磁性顆粒是本發明實施優選的，因為用強磁場可以很方便和迅速地完成混合和分離步驟。例如，發現當通過交變地施加磁場使磁性顆粒來回地“游”過反應容器到達容器的另一側時，本發明的檢測有特別好的功能。從溶液中分離復合物后，激活發光標記，然后檢測光發射。可測量固定在固體支持物上的或固體支持物所分離自的溶液的發光標記的發光。通過將發光水平與標準校正曲線進行比較可以定量分析樣品中分析物的量。
盡管本發明的特異性結合檢測可以各種不同的方式安排，但在優選的實施方案中，第一結合試劑是能夠與分析物結合的水母發光蛋白-標記的單克隆抗體。第二結合試劑是能夠與分析物結合的生物素化的單克隆抗體。優選固體支持物是鏈霉抗生物素-包被的超磁微球，如可從Bangs Laboratories,Inc.,Fishers,IN,46038-2886 USA以C0008200RN庫存號得到的那些。可用容器如試驗試管或微滴定孔完成反應。通過將全血樣品或校正物與適量第一結合試劑和第二結合試劑在適宜緩沖液中混合來開始反應。將樣品保溫足夠長的時間以確保免疫反應的發生。然后將鏈霉抗生物素-包被的磁性顆粒加到樣品中，然后將混合物攪拌并保溫以使免疫復合物與磁性顆粒結合。用磁場分離顆粒，然后洗滌并重懸。加入足夠的鈣離子以使發光水母發光蛋白標記發光。用發光檢測器檢測發出的光，通過與校正曲線比較，讀數與分析物的濃度有關。
本領域專業人員可以理解，本發明的特異性結合檢測可以手工完成，或很容易適用于自動化裝置。試劑加入的順序不重要，只要保證各種結合反應在按需要可得到的定性或定量測量前發射即可。
用下列實施例進一步說明本發明，所述實施例不是為了限制。
實施例1用于TSH的生物發光檢測在室溫用磷酸鹽緩沖液(PBS)組成的緩沖液將苯乙烯微滴定板預浸過夜，所述PBS含有140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，加入10mM氯化鎂的10mM磷酸鈉，pH7.4,10mMEGTA,0.1％疊氮化鈉和5％牛血清白蛋白(BSA)。使用前，將微滴定板瀝干并空氣干燥。將下列物質混合加入到微滴定孔中在209μl緩沖液(1M氯化鉀，10mM Tris，Ph7.5,10mM氯化鎂,10mMEGTA,0.1％疊氮化鈉并含0.1％BSA)中的0.1ML TSH校正物，含有21mIU/L TSH,50ng生物素化的TSH小鼠單克隆抗體(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN,USA,cat.No.1367976(顆粒A8TSH))和9ng水母發光蛋白標記的TSH單克隆抗體(從SeaLite Sciences,Inc.Norcross,GA,USA,lot.no.46-145,通過將水母發光蛋白與從克隆057-11003產生的TSH小鼠單克隆抗體偶聯而制備的，所述克隆057-11003是從OEMConcepts Inc.,(Toms River,N.J.)得到的)。將該溶液在37℃保溫15分鐘。將加有0.1％BSA和0.1％Triton X-100的20μl(22.5微克)鏈霉抗生物素包被的超磁微球(Bangs Laboratories,Inc.,Fishers,IN,46038-2886 USA,庫存號C0008200RN)在PBS中的懸液加到溶液中混合。將混合物在37℃保溫5分鐘。然后四極磁場分離顆粒。用100微升洗滌緩沖液將顆粒洗滌4次，所述緩沖液含有PBSpH7.4,10mM氯化鎂,10mMEGTA,0.1％疊氮化鈉和0.05％吐溫20。將顆粒重懸在100微升同樣的洗滌緩沖液中。將100微升0.1M CaCl2注射到顆粒懸浮液中混合。用Dynatech ML 3000發光檢測器測量10秒發光。
再用校正溶液、全血和用濃度為1、5和21mIU/L加了(spiked)TSH的增強了的(spiked)全血重復前述過程。對TSH濃度標作出從發光檢測器讀出的讀數，發現在所檢測的范圍內，反應是線性的。數據列于下文表Ⅰ，圖1說明了所得的校正曲線，其中水母發光蛋白反應是全血中TSH濃度和校正物的函數。校正物和增強了的全血值之間的差異歸因于1.3mIU/L全血樣品中的內源正常TSH。
表1TSHμIU/mL0 1 5 21發光計數校正物193428141 101307 390408
22121 383248121534498617962771689634310261平均值19413139490719348552Std.Dev. 176 6005 1008940192％CV 9.1 19.1 11.1 11.5全血 37643 65008113649 30601837933 635629867443589642230 59760119011 376953平均值39269 62777110445 37956Std.Dev. 25682710 1054065031％CV 6.5 4.3 9.5 17.4實施例2肌酸激酶，MB同工酶(CKMB)的生物發光檢測用與實施例1相似的方法，在室溫用磷酸鹽緩沖液(PBS)組成的緩沖液將苯乙烯微滴定板預浸過夜，所述PBS含有120mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，加入10mM氯化鎂的10mM磷酸鈉，pH7.4,10mMEGTA,0.1％疊氮化鈉和5％牛血清白蛋白(BSA)。使用前，將微滴定板瀝干并空氣干燥。將下列物質混合加入到微滴定孔中在20μl緩沖液(1M氯化鉀，10mM Tris,Ph7.5,10mM氯化鎂,10mMEGTA,0.1％疊氮化鈉并含0.1％BSA以及加有10mM氯化鎂,10mMEGTA和0.05％吐溫20的80mLPBS)中的25μl CKMB校正物，其含有329ng/ml CKMB,100ng生物素化的CKMB小鼠單克隆抗體(Dade Chemistry SystemsInc.part號735322.312)和20ng水母發光蛋白標記的CKMB單克隆抗體的F(ab’)2片段(Dade Chemistry Systems Inc.part號735322.305)。將該溶液在37℃保溫15分鐘。將20μl(22.5微克)鏈霉抗生物素包被的超磁微球(Bangs Laboratories,Inc.,Fishers,IN,46038-2886 USA,庫存號C0008200RN)在加有0.1％BSA和0.05％Triton X-100的PBS中的懸液加到溶液中混合。將混合物在37℃保溫5分鐘。然后四極磁場分離顆粒。用100微升洗滌緩沖液將顆粒洗滌4次，所述緩沖液含有PBS pH7.4,10mM氯化鎂，10mM EGTA,0.1％疊氮化鈉和0.05％吐溫20。將顆粒重懸在100微升同樣的洗滌緩沖液中。將100微升0.1M CaCl2注射到顆粒懸浮液中混合。用Dynatech ML 3000發光檢測器測量10秒發光。加入25微升全血(在含EDTA的真空收集試管中收集的)重復前述過程。再加入含0ng/mlCKMB，加有或不加上述全血重復所述過程，數據列于下表2。
表2MCKMB ng/ml 0 329發光計數校正物 263133514321132782836117215平均值 473127837Std.Dev. 3159205％CV 66.6 7.2全血 591126315475120287298107301平均值 591126315Std.Dev. 1479716％CV 32.5 8.權利要求
1．全血的多相發光特異性結合檢測法，該方法包括(a)得到含有或懷疑含有分析物的全血樣品；(b)將所述樣品與能夠與所述分析物結合的第一結合試劑混合，所述第一結合試劑激活時發光的發光分子標記；(c)將所述樣品與能夠與所述分析物結合的第二結合試劑接觸，所述第二結合試劑被固定在固體支持物上；(d)在產生復合物的結合條件下，使所述第一和第二結合試劑與樣品中的分析物反應；(e)通過將固體支持物與樣品分開而從樣品中分離出復合物；(f)激活在無固體支持物的樣品中的或與固體支持物結合的復合物中的發光光蛋白標記；和(g)通過檢測從激活的發光標記發出的光來確定樣品中分析物的存在。
2．全血的多相特異性結合檢測法，該方法包括(a)得到含有或懷疑含有分析物的全血樣品；(b)將所述樣品與已知量的分析物混合，所述分析物用激活時發光的發光分子標記；(c)將所述樣品與能夠與所述分析物結合的第二結合試劑接觸，所述結合試劑被固定在固體支持物上；(d)使所述第二結合試劑與標記的和未標記的分析物結合以產生復合物；(e)通過將固體支持物與樣品分開而從樣品中分離出復合物；(f)激活在無固體支持物的樣品中的或與固體支持物結合的復合物中的發光光蛋白標記；和(g)將樣品中分析物的存在與樣品中發出的光相換算(correlating)。
3．權利要求1或2的方法，其中所述第二結合試劑直接與固體支持物結合。
4．權利要求1或2的方法，其中所述第二結合試劑有能力結合分析物和固定在固體支持物上的第三結合試劑，所述檢測方法還包括將所述樣品與已固定有第三結合試劑的固體支持物接觸。
5．權利要求1或2的方法，其中所述發光光蛋白是水母發光蛋白。
6．權利要求4的方法，其中所述光蛋白是水母發光蛋白。
7．權利要求6的方法，其中通過加入激活量的鈣離子將所述水母發光蛋白標記激活以發光。
8．權利要求6的方法，其中所述固體支持物包含磁性微顆粒。
9．權利要求8的方法，其中在步驟(e)中定義的分離是通過施加磁場達到的，然后將分離的磁性顆粒重懸在溶液中，激活顆粒懸浮液中的發光標記，檢測發射的光。
10．權利要求6的方法，其中所述第一和第二結合試劑之每一是抗體或其免疫反應性片段。
11．權利要求6的方法，其中所述第一和第二結合試劑之每一是單克隆抗體。
12．權利要求6的方法，其中所述第一和第二結合試劑之每一是核酸。
13．權利要求6的方法，其中所述第二結合試劑是生物素化的，所述第三結合試劑是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素。
14．權利要求10的方法，其中所述第二結合試劑是生物素化的，所述第三結合試劑是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素。
15．權利要求12的方法，其中所述第二結合試劑是生物素化的，所述第三結合試劑是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素。
16．完成用于全血中分析物的特異性結合檢測的試劑盒，所述試劑盒含有(a)能夠與分析物特異性結合的第一結合試劑，所述第一結合試劑用光蛋白，水母發光蛋白標記；(b)能夠與分析物特異性結合并能夠與固定在固體支持物上的第三結合試劑結合的第二結合試劑；(c)其上固定有能夠與第二結合試劑結合的第三結合試劑的固體顆粒。
17．完成用于全血中分析物的特異性結合檢測的試劑盒，所述試劑盒含有(a)已用發光光蛋白，水母發光蛋白標記的分析物；(b)能夠與分析物特異性結合并能夠與固定在固體支持物上的第三結合試劑結合的第二結合試劑；(c)其上固定有能夠與第二結合試劑結合的第三結合試劑的固體顆粒。
18．權利要求16或17的試劑盒，其中所述第一和第二結合試劑之每一是抗體或其免疫反應性片段。
19．權利要求18的試劑盒，其中抗體中的至少一個是單克隆抗體。
20．權利要求16或17的試劑盒，其中所述第一和第二結合試劑之每一是核酸。
21．權利要求16或17的試劑盒，其中所述第二結合試劑是生物素化的，所述第三結合試劑是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素。
22．權利要求16或17的試劑盒，其中所述固體顆粒是磁性顆粒。
23．權利要求21的試劑盒，其中所述固體顆粒是磁性顆粒。
全文摘要
用于檢測全血中之分析物的發光的特異性結合檢測法。所述檢測法是多相夾心或競爭檢測法,其中用發光光蛋白質標記第一結合試劑,固定的第二結合試劑作為捕獲試劑。發光光蛋白質在激活后,發射出用發光檢測器可檢測的光。該檢測迅速、靈敏,并用小體積樣品即可完成。
文檔編號G01N33/543GK1216112SQ98800017
公開日1999年5月5日 申請日期1998年1月8日 優先權日1997年1月8日
發明者T·J·潘克拉茨, R·W·斯陶特 申請人:達德貝林格公司