專利名稱：確定光學樣品厚度的方法
技術領域：
本發明涉及定量顯微光譜學領域，特別涉及一種用于確定光學顯微樣品的精確厚度的方法。
在科學技術的許多領域，需要確定小樣品中化學物質的濃度。定量顯微光譜學就是一種確定物質濃度的方法。在這種情況下，通過簡單的公式(1)測量與濃度c相聯系的光學吸收A(λ,c)，A(λ,c)=a(λ)cz(1)其中，λ是光波長，a(λ)是同波長相關的吸收系數，z是樣品的厚度。
確定濃度中的誤差通過公式(2)給出dc=(dcdA)dA+(dcda)da+(dcdz)dz---(2)]]>通過使用現代光電子與電子設備，在吸收測量中的誤差可以非常低。對于一種給定物質，吸收系數a(λ)可以通過事先使用厚度在1毫米到10毫米范圍的大樣品加以精確確定。因此，在測量厚度在亞毫米(sub-mm)范圍的小樣品的濃度c中的誤差，主要由在測量樣品厚度中的誤差決定，并由公式(3)給出dcc=dzz---(3)]]>公式(3)表明，以1％的精確度確定厚度在10微米以內的顯微樣品中化學物質的濃度，需要以1％的精確度，即以100納米的精確度，知道樣品的厚度。
制作樣品厚度的精度達到100納米的顯微樣品容器(container)是可能的，但太昂貴了。而且，這種顯微樣品容器在存儲過程中，當超過存儲壽命時會變形，或由于樣品的裝入而變形，很明顯，將樣品裝入容器以后，在使用時確定樣品的確切厚度是切實可行的。因此，需要一種方法與裝置來精確測定薄光學樣品的厚度。
本發明的目的是提供一種方法與裝置，用于在對光學樣品進行吸收測量或其它光譜測量時，精確確定此樣品的厚度。
按照本發明，上面的目的可以通過提供一種樣品容器加以實現，它包括第一和第二光學透明窗口，其中，在第一窗口的內表面具有第一種光學標記(marker)，而在第二窗口的內表面具有第二種光學標記，將樣品容器裝入光學顯微鏡中，移動樣品容器直到第一種光學標記中的一個被分辨出來被定位在視野中，然后移動樣品直到第一種光學標記被準確聚焦，記錄下第一個聚焦位置，然后移動樣品容器直到第二種光學標記中的一個被分辨出來并被定位在視野中，然后移動樣品直到第二種光學標記被準確聚焦，記錄下第二個聚焦位置，最后，計算第一個和第二個聚焦位置之間的差值，考慮進樣品的折射率以后，這個差值可以用于確定樣品的厚度。
在本發明的一個最佳實施例中，顯微鏡裝配有圖像接收器，它同圖像處理器和計算機相連，用以執行圖形分辨程序。顯微鏡樣品臺同樣品臺控制器和計算機相連，用于執行自動聚焦過程。利用這種方法，樣品厚度確定的全過程可以實現自動進行。為了識別和區分的目的，第一種和第二種光學標記是不同的。將標記做成貫穿整個窗口區域的規則圖形是有好處的。許多不同的不標記形狀也是可能的，并且也包含在本發明的范圍之內。這些標記可以具有有限尺寸，比如正方形和三角形，但也可以具有無限尺寸，比如線，方波或其它波形。除此以外，基于吸收、反射、散射或其它光學效應的不同標記類型都可以被使用，并都包含在本發明的范圍中。
圖1是按照本發明的顯微光譜學裝置的示意圖；圖2是通過顯微鏡看到的分別在兩個窗口上的兩種類型的光學標記，這兩種標記相互之間設有重疊圖3是通過顯微鏡看到的分別在兩個窗口上的兩種類型的光學標記，這兩種標記相互之間有重疊圖4是虛線形式的光學標記；圖5是細實線形式的光學標記。
在一個實施例中，本發明的目的在于，當對光學樣品進行吸收測量或其它光譜測量時，一種用于精確確定所述樣品厚度的方法，包括a)提供樣品容器，包括第一和第二光學透明窗口，在第一光學窗口的內表面具有第一種光學標記，而在第二光學窗口的內表面具有第二種光學標記；b)將光學樣品裝入樣品容器；
c)將樣品容器裝入光學顯微鏡；d)移動樣品容器，直到第一種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，然后移動樣品，直到第一種光學標記被準確聚焦，記錄下第一個聚焦位置；e)移動樣品容器，直到第二種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，然后移動樣品，直到第二種光學標記被準確聚焦，記錄下第二個聚焦位置；f)計算第一個和第二個聚焦位置之間的差值；以及g)確定光學樣品的厚度。
在另一個實施例中，本發明涉及一種，當對光學樣品進行吸收測量或其它光譜測量時，用于精確確定所述樣品厚度的裝置，其中所述裝置是一個光學顯微鏡，包括用于裝載樣品的裝置，其中所述裝置具有第一種和第二種光學標記；用于支撐所述裝載樣品裝置的裝置；用于對在所述裝載樣品的裝置中的樣品進行照明的裝置；用于對在所述裝載樣品的裝置中的第一種和第二種光學標記進行自動聚焦的裝置；用于對所述光學樣品執行圖形分辨程序的裝置，其中所述裝置包括同圖像處理器與計算機相連的圖像接收器。
如圖1中所述，按照本發明，提供了用于裝載樣品的樣品容器1，包括第一光學透明窗口2和第二光學透明窗口3，這兩個窗口被壁4所隔開，壁4決定了位于窗口2和3之間的光學樣品的厚度。第一光學窗口2的內表面具有第一種光學標記，第二光學窗口3的內表面具有第二種光學標記。
為了識別和區分的目的，第一種和第二種光學標記是不同的，將標記做成貫穿整個窗口區域的規則圖形是有好處的。許多不同的標記形狀也是可能的并也還包含在本發明的范圍內。這些標記可以具有有限尺寸，比如正方形和三角形，但也可以具有無限尺寸，比如線、方波或其它波形。除此以外，基于吸收、反射、散射或其它光學效應的不同標記類型都可以被使用，并都包括在本發明的范圍之內。為了產生這些光學標記，可以使用對于半導體工業和微型機械制造來說非常普通的各種技術。
作為一個例子，圖2表示通過顯微鏡100看到的位于樣品容器1的兩個窗口上的兩類光學標記。在這種情況下，圓形標記101位于第一窗口2，方形標記102位于第二窗口3。這兩種標記之間沒有重疊。
圖3表示通過顯微鏡200看到的位于兩個窗口上的兩種光學標記，這兩種標記之間有重疊。在這種情況下，空心圓201用作第一種標記，填充方塊202用作第二種標記。這使我們可以設計一種軟件，甚至在兩種標記重疊在一起時也能將它們區分開來。
圖4表示通過顯微鏡300看到的虛線形式的光學標記。沿“東-西”方向的線301位于樣品容器1的第一窗口2，沿“南-北”方向的線302位于樣品容器1的第二窗口3。
圖5表示通過顯微鏡400看到的實線形式的光學標記。沿“東-西”方向的線401位于樣品容器1的第一窗口2，沿“南-北”方向的線402位于樣品容器1的第二窗口3。
如圖1所示，樣品容器1裝在光學顯微鏡8的樣品臺5上。樣品臺5由系統計算機7通過樣品臺控制器單元6在X、Y和Z三個方向加以控制。在圖1中建立了X、Y、Z方向。在顯微鏡領域中，Z方向總是表示在垂直方向的運動。為了在樣品中進行吸收測量，顯微鏡8裝配有光源9。當使用吸收式或散射式標記的時候，也同樣可以使用此光源。樣品溶器1中的樣品也可以使用第二個光源10以及分束器11的裝配方式(epi configuration)所照明。光源10在使用反射式標記時也是可用的。
按照本發明的裝置的最佳實施例也包括圖像接收器12，比如電荷耦合器件(CCD照相機)，它同圖像處理器13和系統計算機7相連。圖像接收器12、圖像處理器13、計算機7、以及樣品臺控制器6的功能組使得我們在將樣品裝入樣品臺5后，可以運行一個圖形分辨率程序。在一個特定的標記被分辨出來以后，這個功能組還使得我們可以運行一個自動聚焦程序。
在操作過程中，光學樣品被裝入樣品容器1中。然后，位于樣品臺5上的樣品容器1在樣品臺控制器6的控制下在X和Y方向運動，直到第一種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，最好靠近中心。接下來，連接于樣品臺5的樣品容器1沿Z方向運動，直到第一種光學標記被準確聚焦。這些完成以后，在計算機中記錄下第一個聚焦位置。然后，樣品容器1在樣品臺控制器6的控制下在X和Y方向運動，直到第二種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，最好靠近中心。樣品容器1在樣品臺控制器6的控制下再次運動，直到第二種光學標記被準確聚焦，然后記錄下第二個聚焦位置。
最后，計算第一個和第二個聚焦位置之間的差值。在考慮進樣品的光學折射率之后，這個值就可以被用來確定樣品的厚度。在大部分實際情況下，樣品濃度對于光學折射率的影響可以忽略。
按照本發明，將標記沉積(deposition)、通過圖形辨認(recognition)的標記識別、以及對于兩種光標記的自動聚焦步驟結合起來，就提供了一種將樣品厚度確定過程自動化的方法。此外，本方法使得可以在與對又薄又小的樣品進行吸收測量的區域幾乎相同的區域確定樣品厚度。因此，可以執行精確的濃度測量。例如，初步可行性實驗表明。原度為200微米的液體的厚度可以在±0.05微米的精度被確定。
按照本發明的方法和裝置可用來確定液體樣品，以及膠狀樣品、氣體或霧狀樣品的厚度。但是，按照本發明的方法和裝置并不僅局限于這樣的樣品。
本發明的方法和裝置也可以用于具有最少2個或2個以上拋光表面的固體光學表明樣品。在本發明的這個方面，不需要樣品容器，因為固體樣品可以直接附著(atrach)或放置在顯微鏡的載玻片上。同樣，光學標記被直接沉積在所感興趣的兩個或兩個以上樣品表面上。因此，本發明的這個方面特別涉及一種，當對透明固體光學樣品進行吸收測量或其它光譜測量時，用于精確確定樣品厚度的方法，包括a)提供顯微鏡玻片；b)將透明固體光學樣品放置在載玻片上，此樣品具有第一表面和第二表面，第一表面具有第一種光學標記，第二表面具有第二種光學標記；c)將顯微鏡載玻片裝入光學顯微鏡；d)移動顯微鏡載玻片，直到第一種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，然后移動樣品，直到第一種光學標記被準確聚焦，記錄下第一個聚焦位置；e)移動顯微鏡載玻片，直到第二種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，移動樣品，直到第二種光學標記被準確聚焦，記錄下第二個聚焦位置；f)計算第一個和第二個聚焦位置之間的差值；
g)確定固體光學樣品的厚度。
因此，使用按照本發明的方法，不僅可以以高精度確定絕對樣品厚度，而且可以確定樣品表面的平行度如何。無論測量液體、膠狀、氣體或固體樣品，只要在顯微鏡中使用適當的物鏡透鏡，就沒有對樣品厚度的限制。
在本發明的一個實施例中，描述了計算機控制的樣品臺和樣品的移動。但是，人工在X、Y和Z方向移動樣品，并且對所發現的光學樣品種類以及聚焦位置進行視覺觀察，同樣包含在本發明的精神中。
權利要求
1．一種在對光學樣品進行吸收測量或其它光譜測量時，用于精確確定所述樣品厚度的方法，包括a)提供包含有第一和第二光學透明窗口的樣品容器，第一窗口的內表面具有第一種光學標記，第二窗口的內表面具有第二種光學標記；b)將光學樣品裝入樣品容器中；c)將樣品容器裝入光學顯微鏡中；d)移動樣品容器，直到第一種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，移動樣品，直到第一種光學標記被準確聚焦，記錄下第一個聚焦位置；e)移動樣品容器，直到第二種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，移動樣品，直到第二種光學標記被準確聚焦，記錄下第二個聚焦位置；f)計算第一個和第二個聚焦位置之間的差值；以及g)確定光學樣品的厚度。
2．按照權利要求1的方法，在所述樣品容器中，所述第一種光學標記均勻分布于第一窗口的整個區域，所述第二種光學標記均勻分布于第二窗口的整個區域。
3．按照權利要求1的方法，其中所述樣品為液體樣品。
4．按照權利要求1的方法，其中所述樣品為膠體樣品。
5．按照權利要求1的方法，其中所述樣品為氣體或霧狀樣品。
6．一種在對透明固體光學樣品進行吸收測量或其它光譜測量時，用于精確確定所述樣品厚度的方法，包括a)提供顯微鏡玻片；b)將具有第一表面和第二表面的透明固體光學樣品放在載玻片上，第一表面具有第一種光學標記，第二表面具有第二種光學標記；c)將顯微鏡載玻片裝入光學顯微鏡中；d)移動顯微鏡載玻片，直到第一種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，移動樣品，直到第一種光學標記被準確聚焦，記錄下第一個聚焦位置；e)移動顯微鏡載玻片，直到第二種光學標記中的一個被分辨出來并被定位于視野中，移動樣品，直到第二種光學標記被準確聚焦，記錄下第二個聚焦位置；f)計算第一個和第二個聚焦位置之間的差值；以及g)確定固體光學樣品的厚度。
7．按照權利要求6的方法，其中在所述固體樣品中，所述第一種光學標記均勻分布在固體樣品的第一表面，所述和二種光學標記均勻分布在固體樣品的第二表面。
全文摘要
本發明涉及確定光學顯微樣品厚度的方法,包括步驟:提供一種包括第一和第二光學透明窗口的樣品容器,其中第一窗口和第二窗口的內表面分別具有第一和第二光學標記;將樣品容器裝入光學顯微鏡;移動樣品容器直到第一光學標記中的一個被分辨出來并定位在視野中,然后移動樣品直到第一光學標記被準確聚焦,記錄第一個聚焦位置;執行同樣過程,記錄下第二個聚焦位置;計算第一和第二聚焦位置之間差值,以確定樣品的厚度。
文檔編號G01B11/06GK1210970SQ98116790
公開日1999年3月17日 申請日期1998年8月3日 優先權日1997年8月29日
發明者克勞斯·W·伯恩特 申請人:貝克頓迪金森公司