專利名稱：多環醌類化合物的光敏作用殺滅血制品中艾滋病毒的方法
技術領域：
本發明是屬于殺滅血制品中艾滋病毒的藥物及方法(包括最佳條件)。
本發明是關于利用多環醌類化合物的光敏作用殺滅血制品中艾滋病毒的方法和最佳條件。本發明屬系列發明之一，是本發明人以前專利申請“檢測艾滋病毒的光譜方法”(中國專利申請號97116856.3)和“抗艾滋病毒藥物和特征檢測的光譜方法”(中國專利申請號97116858.X)的繼續和發展。
人類免疫缺損病毒(HIV)主要通過性接觸，接觸血和血液制品以及在產期從母親到嬰兒傳染的。世界上每年因輸血感染艾滋病而造成其它危重病人死亡及經濟賠償的悲劇也震撼著我們的心。因此，有效地殺滅血制品中的艾滋病毒已或為當前刻不容緩的重要任務。
光敏作用殺滅血制品中艾滋病毒的方法是指選擇專門的染料(大多是植物色素)使艾滋病毒吸收，然后，用一定波長的激光照射以便達到殺滅該病毒的目的，多環醌類化合物主要包括金絲桃蒽酮素(HC)和竹紅菌素及其衍生物(竹紅菌甲素，竹紅菌乙素，5-溴代竹紅乙素，竹紅菌乙素修飾物(-乙醇胺)，簡稱HA，HB，5-Br-HB，HB-E)，已有資料表明它們都有抗艾滋病毒HIV的活性，并且經比較，它們殺滅HIV的能力大小排列如下HC＞HB＞HA。上述多環醌類化合物的分離、提取、純化及其抗病毒的機理已被廣泛地研究，為本發明方法提供了充分的理論依據。本發明經過一系列的試驗和研究獲得醌類化合物之一-金絲桃蒽酮素，殺滅艾滋病毒的最佳條件范圍并用Raman光譜從分子水平給予闡明。即讓多環醌類合化合物與含艾滋病毒的血液制品混合使它們在激光照射下，經過一段時間便可使其中的艾滋病毒殺滅。此后還可用我們的方法(專利號97116858.X)檢測其殺滅HIV的結果。現已建立該方法，尚屬世界首創，無國外協作。本發明的目的是(1)將多環醌類化合物的光敏作用應用于殺滅血制品中的艾滋病毒并尋找出低毒，有效的最佳劑量條件范圍；(2)用發明專利(971168858.X)檢驗殺滅的效果。上述HIV即為“人類免疫缺損病毒”的英文術語縮寫。
為了實驗取得精確無誤的結果，本發明所用材料是來自美國、德國著名公司的標準樣品，即強陽性的人血清(含HIV1-HIV2)，它們來自美國V-TECH公司，金絲桃蒽酮素(Hypericin)由德國Carl Roth公司制造。據說國內已有廉價的金絲桃蒽酮素來源。
實驗方法分為以下三個步驟1、試樣制備向標準含HIV血樣中加入不同濃度的金絲桃蒽酮素光敏劑。將15μl的含HIV1-HIV2的人血清分別與金絲桃蒽酮素的溶液相混合(緩沖液(pH7)由0.01mol/L二甲砷酸鈉和0.001mol/L EDTA配制)，金絲桃蒽酮素的終濃度為2μmol/L，4μmol/L和8μmol/L，。從而我們可以通過Raman光譜觀察到在上述濃度下，殺滅HIV的效果。
2、對艾滋病毒殺滅程度的檢測將含有和受到金絲桃蒽酮素光敏作用的帶HIV的血樣，用一定波長和功率的激光或其它光源照射、殺滅血樣中的艾滋病毒。本發明中優選的光敏作用的條件是，光源是美國光譜物理公司(spectra-physics co.)生產的氬離子激光器，照射HIV使用的波長是514.5nm，功率500mw。如果使用付里葉轉換拉曼光譜(FT-Raman)，激光波長是1064nm，功率可增大至700-800mw。
3、用光譜學方法檢測血樣中艾滋病毒被上述金絲桃蒽酮素光敏藥物殺滅的情況。本發明是利用激光拉曼光譜檢測金絲桃蒽酮素(HC)引起的人血清中艾滋病毒(HIV1-HIV2)的光敏損傷，即在分子水平上提供病毒RNA、蛋白質、碳水化合物及脂類的結構變化信息。通過使用藥物金絲桃蒽酮素之前和之后的光譜圖差別比較，便可了解血樣中艾滋病毒中的生物大分子結構的損壞程度。本發明的光譜學檢測法，已在先前的系列專利申請(中國專利號97116858.X)中詳細披露。
本發明的最主要的技術內容是利用光譜方法，尤其是拉曼光譜法，優選出了殺滅人血制品中艾滋病毒的金絲桃蒽酮素的高效、低毒的實用濃度(終濃度為4μmol/L)，將現有技術上尚屬定性(僅知HC對艾滋病毒有殺滅作用)認識，推進到有效定量實用階段。更進一步的貢獻是提供了一套有關金絲桃蒽酮素不同劑量(用量)對艾滋病毒殺滅效果程度的一般參考(標準)拉曼光譜圖，尤其4μmol/L的HC殺滅艾滋病毒的實用參照譜圖。
本發明光譜測定不同濃度金絲桃蒽酮素殺滅艾滋病毒的結果如下艾滋病毒的光譜圖及其結構信息詳見附圖1-5和表1。艾滋病毒在光敏藥物金絲桃蒽酮素(HC)光敏損傷后的結構如圖6-12所示。圖1-10及表1已在本發明先前的專利申請(中國專利申請號97116858.X)中披露。
圖1是陰性人血清的拉曼光譜圖(A)和人血清中艾滋病毒(HIV1-HIV2)的拉曼光譜圖(B)，選用的光譜區域為450-3100cm-1。實驗條件激光線波長514.5nm；功率500mw；三單器的四個狹縫寬度分別為700，800，800，700μm，光譜分辨率4cm-1，步長1cm-1；積分時間和信號平均分別為0.1和7次掃描(在450-1750cm-1)，0.2和5次掃描(2500-2600cm-1)及0.2和2次掃描(2800-3100cm-1)，室溫18±2℃。
圖2是陰性人血清的拉曼光譜圖(450-1750cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖3是人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(450-1100cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖4是人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(1100-1750cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖5A是陰性人血清和B是人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(2800-3100cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖2-5是圖1的局部放大圖。
圖6中A是在金絲桃蒽酮素(HC)光敏損傷前人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(450-3100cm-1)和B是被2μmol/L的HC損傷后人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(450-3100cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖7是金絲桃蒽酮素光敏損傷后人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(450-1100cm-1)，實驗條件與圖1相同。
圖8是金絲桃蒽酮素光敏損傷后人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(1100-1750cm-1)，實驗條件同圖1。
圖9是金絲桃蒽酮素光敏損傷后人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(2800-3100cm-1)，實驗條件同圖1。
圖7-9是圖6的局部放大圖。
圖10是艾滋病毒的結構示意圖。
圖11是4μmol/L的金絲桃蒽酮素光敏損傷的人血清中艾滋病毒的拉曼光譜圖(450-1750cm-1)。測試條件與圖1相同。
圖12是圖11的局部放大圖(450-1750cm-1)。
表1是在18℃所測得的人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜圖(450-3100cm-1)的說明。
從本發明所用4μmol/L的金絲桃蒽酮素損傷的艾滋病毒的拉曼光譜圖(圖11和圖12)，與圖1，3，4，5中所示人血清中艾滋病毒拉曼光譜圖(分別在450-3100cm-1，450-1100cm-1，1100-1750cm-1，2800-3100cm-1)以及圖6，7，8，9中所示經受金絲桃蒽酮素對艾滋病毒光敏損傷后的拉曼光譜圖(光譜范圍同1，3，4，5)作比較，可看出在圖3，4和圖7，8中作為內標的，構象不靈敏的，屬于蛋白質苯丙氨酸的單基取代苯基環的在1004cm-1的譜線在圖11，12中位移到1003cm-1，并且強度顯著下降。所以對4μmol/L終濃度的金絲桃蒽酮素光敏損傷的艾滋病毒結構的拉曼光譜分析只能做到定性。這說明4μmol/L終濃度的金絲桃蒽酮素光敏藥物對艾滋病毒的蛋白質結構有明顯的損傷。
下面將本發明選用的終濃度4μmol/L金絲桃蒽酮素對艾滋病毒光敏損傷的拉曼光譜測試結果(圖11和12)作為實施例，與終濃度2μmol/L金絲桃蒽酮素對艾滋病毒光敏損傷的拉曼光譜圖(圖6-9)進行比較，并結合對該病毒的四種主要組份的結構的損傷加以說明(詳見表2)，為了便于觀察和分析，我們對圖11，12作了適當的放大。
1、病毒碳水化合物(糖類)結構的光敏損傷從圖6中的圖譜A(正常的艾滋病毒光譜)與圖譜B(2μmol/L的金絲桃蒽酮素光敏損傷的艾滋病毒)及圖11，12(4μmol/L的金絲桃蒽酮素光敏損傷的艾滋病毒)的比較可以看出圖6A中在880，1048，1089，1277及1456cm-1的強譜線，在圖6B中僅稍有減弱或位移，分別處于880，1046，1087，1275，1454cm-1；而在圖11，12中不但有較大的位移，分別位移到871，1050，1090，1268，1461cm-1，而且強度陡然下降。這表明該碳水化合物有鏈的斷裂并且其數量明顯減少。碳水化合物(糖類)是病毒包膜糖蛋白gp 120和gp 41等不可缺少的組分，在HIV病毒附著到目標細胞上并進入其中時，這些糖蛋白起著關鍵的作用，因此糖類的損傷會破壞gp 120和gp 41的功能，以致使HIV無法進入人體。
2.病毒蛋白質的光敏損傷(1)主鏈構象從圖4，8，12三者的比較可看出，圖4中屬于α-螺旋在1264cm-1(酰胺III)的譜圖在圖8中消失了，圖4中在1226cm-1的β-折疊的譜線在圖8中變成了肩峰并移至1228cm-1，β-回折在1303cm-1的譜線位移到1306cm-1(酰胺III)，在1644，1684cm-1的譜線位移到1645，1680cm-1(酰胺I)，而屬于α-螺旋或無規卷曲在1660cm-1的譜線位移至無規卷曲在1664cm-1之處。而圖4中的β-折疊或無規卷曲在1669cm-1的譜線在圖8中消失了。在圖12中(圖11的局部放大)屬于主鏈構象的譜線弱小，分別在1225，1247cm-1(酰胺III)和1649，1664，1680cm-1(酰胺I)，應該注意的是在1225，1234，1247和1649cm-1的譜線也有人血清的貢獻，加上屬于C-H變形振動和C-H伸縮振動在1456cm-1和2935cm-1的譜線分別位移到1461和2946cm-1，它們的強度陡然下降。可知蛋白質的多肽鏈在4μmol/L HC的光敏損傷下發生了斷裂其數量也明顯減少。
(2)側鏈構象將圖1，3，4和圖6，7，8作比較看出當金絲桃蒽酮素的濃度為2μmol/L時(圖7)屬于酪氨酸、色氨酸的對羥苯基環和吲哚環，半胱氨酸的巰基及二硫鍵都有不同程度的變化，但苯丙氨酸在1004cm-1的譜線(內標)卻無變化。說明該病毒蛋白質只有構象的變化。但從圖11和12可看出當HC的濃度增至4μmol/L時上述基團的譜線強度則下降明顯，特別是在1004cm-1的苯丙氨酸的單基取代苯基環的譜線不但位移到1003cm-1而且強度明顯下降。說明該病毒蛋白質有構型的變化。其酪氨酸在830cm-1的譜線從強峰變成了肩峰，并且雙峰在845和830cm-1的譜線強度之比大于1，說明酪氨酸已從原來的“埋藏”變成“暴露”的(圖1與圖6和圖11比較。屬于HIV的S-H基團在2578cm-1(圖1B)的譜線位移到2577(圖6B)，2565cm-1(圖11)，而人血清的S-H基團在2554cm-1的(圖1A)譜線位移到2556(圖6B)，2545cm-1(圖1B)。屬于病毒HIV的在2578cm-1的譜線強度明顯下降，而屬于人血清的在2554cm-1的譜峰幾乎不變。病毒蛋白質包括包膜糖蛋白gp120，gp41的蛋白質部分，病毒的反轉錄酶，整合酶，核糖核酸酶和病毒的核外殼蛋白，基質蛋白等，因此病毒蛋白質的損傷特別是主鏈的損傷必將影響甚至破壞上述組分的功能，導致病毒失去感染的能力。
3、對病毒RNA結構的破壞該RNA骨架結構上磷酸二酯基團(PO2)在終濃度2μmol/L的金絲桃蒽酮素的光敏損傷下從814cm-1移至808cm-1(圖3和圖7)說明A-型病毒RNA變成了無序的RNA，然而HC為4μmol/L的該譜線在圖12中位移至802cm-1。磷酸離子(PO-2)的對稱伸縮振動譜線從圖4的1106cm-1位移至圖8的1102cm-1，而在圖12中它位移到1100cm-1并且強度明顯下降。說明HC的光敏損傷使病毒RNA從A型變成無序。與此同時屬于HIV的RNA的核糖和4個堿基(A，G，C，U)的譜線也有明顯的變化，甚至消失。病毒RNA的損傷直接影響HIV的生長繁殖。
4、病毒脂類的結構損傷正常的和HC光敏損傷的屬于病毒脂類亞甲基CH2的對稱和非對稱的C-H伸縮振動的兩根譜線，分別出現在圖9中的A，B圖譜；圖9A的病毒2883和2853cm-1(正常)，變為圖9B中的2883和2848cm-1(2μmol/L HC損傷的HIV)，其強度比I2883/I2853，I2883/I2848幾乎相同為5.6，說明它們是高度有序的凝膠相，并且2μmol/L的HC的光敏作用沒有使其脂雙層的結構受到明顯的損傷。但當HC濃度增至4μmol/L時上述二根譜線分別位移到2840和2871cm-1(圖11)并且它們的比值I2871/I2840大約是1，表明其側向相互作用序參數明顯下降，該病毒膜脂的流動性和離子通透性增加，這意味著該病毒的脂雙層功能的明顯變化。
綜上所述，當藥物終濃度增至4μmol/L時，屬于艾滋病毒HIV的4個組分的譜線位移、強度明顯下降，有的消失。病毒的A型RNA變成了無序時的RNA，其蛋白質發生了肽鏈的斷裂，糖類和脂類的碳氫鏈也有斷裂使該病毒的包膜的流動性和離子通透性大大增加。上述結果直接證明了金絲桃蒽酮素對艾滋病毒的光敏作用的靶分子不僅有RNA，蛋白質，而且還有糖類和脂類，并在終濃度達到4μmol/L時上述組分的數量會明顯減少及致嚴重的破壞。因此利用金絲桃蒽酮素的光敏作用殺滅血制品中的艾滋病毒時，HC的終濃度應以4μmol/L為宜。
從圖11，12可清楚地看到一些較強的峰都有人血清的貢獻，有些還是人血清圖譜(圖2)中的強峰，它們分別在545，629，923，946，1076，1342cm-1和1225，1234，1247cm-1。4μmol/L金絲桃蒽酮素HC的光敏作用使艾滋病毒的結構受到嚴重破壞。屬于它的一系列譜線發生位移和強度下降，與此同時屬于人血清的一些譜線卻變化不大，因此在圖譜上它們就顯得比較凸出了。結果提示HC的光敏作用殺滅人血清中的HIV的過程中，其對人血清的影響很小。從而也證實了美國Valentine等人的重要發現-金絲桃蒽酮素在治療劑量是低毒的(Science，1991，vol 254，P.522)另外在590，698的譜線歸屬待定，在1510cm-1的譜線雖有病毒RNA腺嘌呤的貢獻，但由于它很強使人認為還有別的物質分子的貢獻，這也有待進一步研究。
*8μmol/L HC的實驗結果在此省略。尋找殺滅HIV的最低有效濃度是本發明的宗旨，4μmol/L即是，故不再論述其它濃度。
表1.在18℃所測得的人血清中HIV1-HIV2的拉曼光譜(450--3100cm-1)頻率(cm-1) 病毒的四種組成碳水化合物RNA 蛋白質 脂類465493Man503skeletal modesr S-S str515GlcNacS-S str521 S-S str537GlcNacS-S str548 Trp581 C，GTrp596 C602Man613620 Phe631GlcNacr640 Tyr669Man G676684692703GlcNacC-S str717 C-S strC-N sym728 A736GlcNac743Man Ile，Asn751 C759 Trp，Val769Man778786 C，UThr814 P Asn832Man Tyr，Val851 Tyr859880β-configuration C-C str，TrpMan Val907Man C-C str926COH C-C str933GlcNacC-C str952Man C-C str
表1.(續)頻率(cm-1) 病毒的四種組成碳水化合物 RNA蛋白質脂類974Man r994CH2rock1004r Phc1048 Cl-H bending r C-N strC-O，C-C，GlcNac1089 COH C-N str C-C str1106 Man P1123 Man，GlcNac C，U C-N str1132 Man C-N str C-C str1157r C-N str11721178G，A，CTyr11931205 Tyr，Phe1226A Amide III1237U，C Amide III1244 Amide III1250A，C Amide III1264 Amide III1277 CH2OH，Man Amide III1282 Man，GlcNac，COHAmide III1303A，C Amide III1322 GlcNac G C-H def1330 C(6)-H2，CH3COH1341A C-H def，Trp1348 COH bending，Man1356 Trp1365 GlcNac G C-H def1379 CH3，GlcNac， G，U，AMan1394 C-H bending1408 Man CO2- sym str1419G，A1433 GlcNac Trp(N-H def)1456 CH2bendingCH2bending CH2bending1484G，A1494 Man1508A15201527C1537 Man G1555 GlcNac Amide II.Trp1581G，A Trp1567
表1.(續)頻率(cm-1)病毒的四種組成碳水化合物RNA 蛋白質 脂類16131620Man C＝O str，U Trp，Tyr，Phe16281635GlcNac(Amide I)1644 Amide I1660 C＝O str， Amide IU，G，C1669 Amide I1681 C＝O，str Amide IU，G，C16961725 C＝O str1740 C＝O str2552 S-H str，Cys2578 S-H str，Cys2853 CH2sym str2883 C-H str CH2asym str2900C-Hstr，Man2935C-H str，Man C-H str C-H str CH3sym str2979C-H str，Man C-H str C-H str縮寫詞說明標準3-字符號是用于各氨基酸和碳水化合物；一字符是用于RNA堿基；r＝ribose，核糖；P＝骨架磷酸基團(PO2-，PO2)；Man＝D-Mannose，甘露糖；GlcNac＝N-乙酰基-D-葡萄糖胺。其中已知有一些特殊類型的振動模式，它們由以下縮寫詞表示sym＝對稱，str＝伸縮，def＝變形，A＝腺嘌呤，U＝尿嘧啶，G＝嘌呤，C＝胞嘧啶，Trp＝色氨酸，Tyr＝酪氨酸，phe＝苯丙氨酸。表2 不同濃度HC對艾滋病毒(HIV1-HIV2)四種結構成分的光敏損傷的Raman光譜(450-3100cm-1
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表2續
說明H1人血清中的HIV1-HIV2。H22μmol/L HC光敏損傷的人血清中的HIV1-HIV2H34μmol/L Hc光敏損傷的人血清中的HIV1-HIV2。
權利要求
1.一種使用不同濃度多環醌類化合物的光敏作用殺滅血制品中艾滋病毒的方法，其特征在于以下各步驟(1)試樣制備首先制備緩沖液，由0.01mol/L的二甲砷酸鈉和0.001mol/L的EDTA配制，使pH＝7，然后向含有艾滋病毒的標準血試樣中加入不同濃度的(用緩沖液稀釋配制的)金絲桃蒽酮素(HC)光敏藥物，即將15μl的含HIV1-HIV2的人血清分別與金絲桃蒽酮素的溶液相混合，金絲桃蒽酮素的終濃度為2-8μmol/L；(2)用不同濃度的金絲桃蒽酮素的光敏作用對血清中的艾滋病毒殺滅將混有金絲桃蒽酮素的含艾滋病毒的血制品，用波長488.0，514.5，554.8，599.1，632.8，1064nm和功率為300-800mw的激光照射(隨著所述波長的紅移，激光功率應增加)，光照使上述光敏劑產生單線態氧和自由基，從而殺滅艾滋病毒；(3)對經過不同濃度金絲桃蒽酮素光敏作用后的含艾滋病毒血制品進行光譜法檢測利用光譜方法檢測不同濃度光敏劑金絲桃蒽酮素對艾滋病毒的殺滅的效果和程度，通過使用金絲桃蒽酮素之前和之后艾滋病毒的光譜圖樣比較分析，得到金絲桃蒽酮素低毒、有效的合理濃度供實際使用。
2.如權利要求1所述的使用不同濃度多環醌化合物光敏作用殺滅血制品中艾滋病毒的方法，其特征在于所說的多環醌化合物包括金絲桃蒽酮素(HC)和竹紅菌素及衍生物竹紅菌甲素(HA)、竹紅菌乙素(HB)、5-溴代竹紅菌乙素(5-Br-HB)、竹紅菌乙素修飾物(-乙醇胺)(HB-E)，所說的不同濃度為其在血液制品中的終濃度為2-8μmol/L，所說的檢測光譜方法包括拉曼光譜、付里葉轉換拉曼光譜(FT-Raman)Raman微探針、紅外光譜方法，可使用國內外出售的各種拉曼和紅外光譜儀。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于優選的多環醌化合物為金絲桃蒽酮素(HC)，其殺滅艾滋病毒的最低有效終濃度為4μmol/L，殺滅艾滋病毒的優選光源為波長488.0或514.5nm和功率350-500mw的激光，檢測不同濃度HC對艾滋病毒殺滅程度的光譜方法中被優選者是拉曼光譜法。
4.一系列由不同濃度金絲桃蒽酮素光敏作用殺滅艾滋病毒的拉曼光譜圖，包括圖1-12，其特征在于為圖6-12所示及表2所述的拉曼光譜圖。
5.如權利要求4所述的拉曼光譜圖，其特征在于圖11和圖12所示的4μmol/L金絲桃蒽酮素光敏作用損傷的人血清中艾滋病毒拉曼光譜圖。
全文摘要
本發明是利用多環醌類化合物,尤其是金絲桃蒽酮素的光敏作用殺滅血制品中艾滋病毒的實驗結果,提供了一種優選出的高效低毒的(在治療劑量是低毒的)實用劑量,適宜的激光波長和功率范圍及其使用方法等。并且提供了實用性的拉曼光譜檢測方法和一系列的參比(標準)拉曼光譜圖。
文檔編號G01N1/28GK1242937SQ9810333
公開日2000年2月2日 申請日期1998年7月28日 優先權日1998年7月28日
發明者許以明 申請人:中國科學院生物物理研究所