專利名稱：免疫組織化學染色用組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫組織化學染色用組合物。詳細來講，本發明涉及包含對組織損害性小的、經近紅外線或遠紅外線照射后能發出熒光的標記用化合物，能與特異的識別癌細胞等的抗體等結合的診斷用標記，并且熒光強度優良的免疫組織化學染色用組合物。
近年來，隨著電子內窺鏡的普及內窺鏡診斷變得越來越容易，胃癌及結腸癌等癌癥在早期階段即可被發現。不過，在微小癌癥的診斷方面，采用電子內窺鏡與使用一般的內窺鏡其診斷能力幾乎相同。這與新的診斷方法還沒有確立，尚無法充分發揮和利用電子內窺鏡的機能有關。如果能發現一種能標記微小病變的標記抗體，使在一般內窺鏡下無法辨別的微小病變，在電子內窺鏡下能夠檢測出來，再經電子計算機的處理使之圖象化，就可以使檢測變得簡易可行，但這種方法迄今還未實用化。
為了使上述使用電子內窺鏡進行診斷的方法得以實現，有采用根據免疫組織化學染色法對活體組織進行直接染色。固定后標本的染色法已有非常成熟的技術。但是，未經固定的標本的染色法卻沒有現成的、可供同行利用的技術。例如，盡管目前已有有關未經固定標本的免疫染色法報道(四國醫學雜志，29,180,1987)，但尚未見有關采用近紅外線對新鮮切除標本或活體組織本身進行免疫染色的報道。
另一方面，對于上面描述的診斷方法，必須有在電子內窺鏡下能夠檢測出來的診斷用標記物(標記化的抗體等)才行。我們知道目前已有這么一種診斷用標記物它把具有經紫外線激發后、可發出紫外或可見熒光的標記用化合物結合到抗體上，這種診斷用標記物已被廣泛地用于診斷從活體摘除的組織是否存在癌組織或癌細胞。但是采用這種由紫外線激發、具有熒光特性的診斷用標記物的方法，由于紫外線會導致活體組織和DNA的損傷，不適宜在活體使用。迄今還沒有能夠直接用于活體的診斷用標記物。
我們知道吲哚花青綠(ICG)在紅外線內窺鏡下，具有特異性吸收從而發出熒光。盡管已有在使用紅外線內窺鏡時，使用吲哚花青綠的報道(Gastroenterological Endoscopy,34,pp.2287-2296,1992；Gastrointestinal Endoscopy,40,pp.621-2；628,1994)，但有關這方面的工作均為血管內給ICG。而且，一般說來，象吲哚花青綠這類熒光性物質疏水溶性強，其單體在腸道內很快被吸收，我們嘗試著在其母核或側鏈部位導入一個親水溶性的磺基以提高它的水溶性，從而使測定效率提高，并可避免吸收后的毒性問題(有關以上背景技術材料的綜述，可以參考喜納兼勇著“2．臨床檢查用(診斷用)色素”項pp.223-230、入江正浩主編“技能性色素的最新應用技術”、株式會社CMC發行、1996年)。
本發明者們，經過不斷合成各種各樣的吲哚花青綠衍生物，終于成功地生產出在近紅外線乃至遠紅外線激發下即可產生熒光的吲哚花青綠衍生物，同時發現將上述吲哚花青綠衍生物用作標記用化合物，使之與抗癌抗原抗體發生反應，能制造出可直接在活體上使用的診斷用標記物，而且發現這種診斷用標記物對于采用免疫組織化學染色法直接用于活體的組織染色是很有用的。有關此項發明已做了專利申請(特愿平7-12283號)。
另外，本發明人，本著要提供具有良好水溶性的診斷用標記物為宗旨，進行了銳意研究，結果發現對于上述吲哚花青綠衍生物中能形成分子內偶離子(兩性離子)的化合物，偶離子的形成，可使分子的離子性下降，進而使水溶性會受到損害對此讓碘化鈉等作用于該衍生物，使其分子內部無法形成偶離子，繼續保持分子整體的離子特性，水溶性可顯著增加。有關這方面的發明也做了專利申請(特愿平7-223613號)。
但是，對于使吲哚花青綠衍生物等具有熒光特性的標記用化合物和抗體結合得到的本診斷用標記物。做進一步的研究發現這種診斷用標記物的熒光強度，與結合前吲哚花青綠衍生物(標記用化合物)自身的熒光強度相比較，大約衰減了十分之一。在應用上述診斷用標記物進行在體免疫組織化學染色、進行癌組織等微小組織檢測時，如果采用與一般的熒光檢測裝置相比敏感度很高的裝置來進行，則有可能避免這樣的問題，但是高性能裝置的開發和使用必須投入巨大的勞力和資金。另一方面，如果能提供一種特異地作用于將熒光性標識用化合物結合在抗體上得到的診斷用標記物，并使它的熒光強度增強的熒光強度增強劑，就有可能利用原本就有的檢測裝置對雜色組織進行簡便而準確的檢測。
本發明的目的，是提供一種能作用于使吲哚花青綠衍生物等具有熒光特性的標記化合物和抗體結合。得到的診斷用標記物、并使其熒光強度增強的物質，另外提供一種，當在使用上述診斷用標記物進行活體內免疫組織化學染色時，能使其熒光強度顯著增強的免疫組織化學染色用組合物。
本研究的發明者們，為了解決上述課題，進行了鍥而不舍的努力，結果發現選自二肉豆蔻酰基磷脂酸及二硬脂酰基磷脂酸等酰基甘油磷酸、二硬脂酰基磷脂酰膽堿等酰基甘油磷酸膽堿等甘油磷脂；硬脂酸等脂肪酸；及辛基糖苷等糖衍生物表面活性劑的物質，這些物質能使這種-讓吲哚花青綠衍生物等具有熒光特性的標記用化合物和抗體結合得到的診斷用標記物熒光強度顯著增強。另外，發現包含這些物質和診斷用標記物的組合物，作為能夠直接用于活體免疫組織化學染色用的組合物是非常有實際價值的。而且發現在上述組合物中辛基糖苷等糖衍生物表面活性劑如果作為必須成分來使用的話，能夠提供溶解性優良的穩定的組合物。本發明就是在這些見解的基礎上完成的。
也就是說，本發明是提供一種免疫組織化學染色用的組合物，其特征在于包括含有結合了與熒光性官能團的抗體的診斷用標記物，及選自甘油磷脂、脂肪酸、糖衍生物等表面活性劑中選取出來的物質。根據本發明的最佳實施方式，可以提供甘油磷脂是酰基甘油磷酸的組合物；酰基甘油磷酸是包含2個C10-20脂肪酸殘基的1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸的組合物；1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸是二肉豆蔻酰基磷脂酸或二硬脂酰基磷脂酸的組合物；甘油磷脂是酰基甘油磷酸膽堿的組合物；酰基甘油磷酸膽堿是包含2個C10-20脂肪酸殘基的1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸膽堿的組合物；1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸膽堿是二硬脂酰基磷脂酰膽堿的組合物；以及該表面活性劑是辛基糖苷的組合物。
而且，按照本發明可以提供包含選自甘油磷脂及脂肪酸的物質和上述表面活性物質的上述組合物；該熒光性官能團是來源于吲哚花青綠衍生物的官能團的上述組合物；熒光性官能團是由吲哚花青綠-N-羥基硫代琥珀酰亞胺基酯衍變而來官能團的上述組合物；及抗體是抗癌抗原抗體的上述組合物。
進一步根據本發明的其它形式，可以提供包括結合了熒光性官能團的抗體的免疫組織化學染色用的診斷用標記物熒光強度增強劑，該熒光強度增強劑包括選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質；提供運用以包括含有結合了熒光性官能團的抗體的診斷用標記物和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質在內的熒光強度增強劑為特點的組合物進行活體組織免疫組織化學染色的方法；以及，提供運用以包括含有熒光性官能團結合抗體在內的診斷用標記物和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質在內的熒光強度增強劑為特點的組合物，從免疫組織化學角度進行癌癥診斷的方法。
附圖簡述
圖1是在普通光及紅外線光的照射下，滴加了本發明組合物的木棉紗布類纖維組織通過顯微鏡拍攝下來的照片。圖中、(a)表示用普通光進行拍照的結果、(b)表示用紅外線進行拍照的結果。
圖2表示對于結合ICG-sulfo-OSu的小鼠抗粘蛋白抗體、添加熒光強度增強劑肉豆蔻酰基磷脂酸及辛基糖苷前后的吸收光譜和熒光光譜的變化。圖中、(c)為添加熒光強度增強劑前的吸收光譜；(c’)為添加熒光強度增強劑后，本發明的組合物的吸收光譜；(d)為添加熒光強度增強劑前的熒光光譜；及(d’)為添加熒光強度增強劑后，本發明的組合物的熒光光譜。
實施發明的最好方式本發明的組合物是免疫組織化學染色用的組合物，其特征在于它包含含有熒光性官能團結合抗體的診斷用標記物和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質。而且，作為本發明最佳實施方式的組合物，其特征在于它包含含有熒光性官能團結合抗體的診斷用標記物、選自甘油磷脂及脂肪酸的物質、及糖衍生物表面活性劑。
在本說明書，“甘油磷脂(glycerophospholipid)”是指以甘油為基本骨架的磷脂、具體點說就是以甘油磷酸(glycerol phosphate)為基本骨架磷脂。例如，1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸膽堿(磷脂酰膽堿)等的酰基甘油磷酸膽堿類；1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)等酰基甘油磷酸乙醇胺類；1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸-L-絲氨酸(磷脂酰絲氨酸)等的酰基甘油磷酸絲氨酸類；磷脂酰肌醇類；1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸(脂酸)等的酰基甘油磷酸類；及二磷脂酰甘油等都是甘油磷脂的代表化合物。
作為構成上述甘油磷脂的甘油磷酸，甘油1-磷酸、甘油2-磷酸和甘油3-磷酸的任何一種異構體均可，沒有一定的立體構型的限制，但由天然型的sn-甘油3-磷酸(L-α-甘油磷酸)形成的甘油磷脂最適合使用(甘油3-磷酸用HOCH2-CH(OH)-CH2O-PO3H2表示)。在上述的甘油磷脂中，最適用于本發明組合物的是酰基甘油磷酸或酰基甘油磷酸膽堿。
在本說明書中“酰基甘油磷酸”是指，甘油磷酸的單脂肪酸酯或雙脂肪酸酯，即用式A1OCH2-CH(OA2)-CH2O-PO3H2(式中A1及A2各自獨立地表示氫原子或脂肪酸殘基的酰基，A1及A2并不同時表示氫原子)表示的化合物。在上式中，作為形成單價脂肪酸酯或雙價脂肪酸酯的脂肪酸殘基(從用A1OH和/或A2OH表示的脂肪酸中分別除去-OH表示的羥基以后剩下的基團)，可以使用碳原子數在8～22(C8-22)范圍優選碳原子數在10～22(C10-20)范圍的脂肪酸殘基，例如從碳原子數10、碳原子數12、碳原子數14、碳原子數16及碳原子數18的脂肪酸中產生的殘基是最合適的。
象這種脂肪酸殘基直鏈或支鏈均可、飽和或不飽和也均可。另外構成雙脂肪酸酯的脂肪酸，相同及不同也均可。作為酰基甘油磷酸，最好能夠使用sn-甘油3-磷酸的二硬脂酸酯(二硬脂酰基磷酯酸)或二肉豆蔻酰基酯(二肉豆蔻酸基磷脂酸)等。作為酰基甘油磷酸使用堿加成鹽也可以。作為這種堿加成鹽，可舉出鈉鹽、鉀鹽等例子。其中，優選二硬脂酰磷脂酸或二肉豆蔻酰基磷脂酸的鈉鹽。
本說明書中“酰基甘油磷酸膽堿”，是指甘油磷酸膽堿的單脂肪酸酯或雙脂肪酸酯，即可用下式表示的化合物A3OCH2-CH(OA4)-CH2O-PO(OH)OCH2CH2N+(CH3)3(式中A3及A4各自獨立地表示氫原子或脂肪酸殘基的酰基，A3及A4并不都同時表示氫原子)。在上面這個式子中，作為形成單脂肪酸酯或雙脂肪酸酯的脂肪酸殘基(從用A3OH和/或A4OH表示的脂肪酸中分別除去以-OH表示的羥基以后剩下的基團)，可以使用碳原子數在8～22(C8-22)范圍優選碳原子數在10～22(C10-20)范圍的脂肪酸殘基，例如從碳原子數10、碳原子數12、碳原子數14、碳原子數16及碳原子數18的脂肪酸中產生的殘基是最合適的。象這種脂肪酸殘基直鏈或支鏈均可、飽和或不飽和也均可。另外構成雙價脂肪酸酯的脂肪酸，相同及不同均可。作為酰基甘油磷酸，最好能夠使用sn-甘油3-磷酸膽堿的二硬脂酸酯(二硬脂酰基磷脂酰膽堿酸)等。
作為脂肪酸，可以使用碳原子數在8～22(C8-22)范圍的脂肪酸，優選使用碳原子數在10～22(C10-20)范圍的脂肪酸，例如從碳原子數10、碳原子數12、碳原子數14、碳原子數16及碳原子數18的脂肪酸中產生的殘基是最合適的。脂肪酸直鏈或支鏈均可、飽和或不飽和也均可。例如最好能夠使用硬脂酸。作為糖衍生物表面活性劑，只要是既不讓蛋白質發生實質性變性的物質，還對皮膚和粘膜等活體組織刺激性低的物質即可，并無特別的限定，比如可以使用辛基糖苷、庚基糖苷、辛基硫代糖苷、或庚基硫代糖苷等。
本發明的組合物，還可包括選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的一種或兩種以上的物質的熒光增強劑。前面所述的糖衍生物盡管它本身就有熒光增強作用，但在選自甘油磷脂及脂肪酸的物質難溶于水的場合，此時最好是把它和選自甘油磷脂及脂肪酸的物質混合起來使用。因為通過前面所述的糖衍生物表面活性作用可使原本不溶于水的酰基甘油磷酸等物質變得可溶于水，使組合物的配制變得容易起來，而且制劑的穩定性也有顯著改善。此外，通過把糖衍生物表面活性劑和選自甘油磷脂及脂肪酸的物質混合起來使用，還有望得到熒光強度協同增強的效果。例如包含辛基糖苷和二硬脂酰基磷脂酸的組合物、包含辛基糖苷和二蜂蠟基磷酸肌酸的組合物是本發明中最好的方式。
前面所述的熒光增強劑的含量不必特別限制，可以選擇所使用的診斷用標記物的種類及激發光的種類等適當選擇。此外，在把上述糖衍生物和選自甘油磷脂及脂肪酸的物質混合起來使用時，所選糖衍生物的適宜量，是以能使選自甘油磷脂及脂肪酸的物質溶化為標準。比如，最好是采用使糖衍生物成為臨界膠束濃度附近(辛基糖苷約為25mM左右)的濃度。
作為包含在本發明組合物的診斷用標記物，是熒光性官能團結合抗體的診斷用標記物，只要是能夠在免疫組織化學染色中使用的物質即可，并沒有特別限定。例如，最好能夠使用這種診斷用標記物，通過用600-800nm波長的激發光進行照射，能激發780nm以上、最好是780-840nm以上波長的熒光。其中，通過用近紅外線乃至遠紅外線照射，就能夠激發出波長在810nm以上、優選在820nm以上的熒光，象這種診斷用標記物，由于在進行診斷時不會引起活體組織和DNA的損傷，所以特別用于本發明的組合物。此外，最好能使用水溶性好的診斷用標記物。本發明的組合物可以包含一種或一種以上的診斷用標記物。
本說明書中“熒光性官能團”，是來源于熒光性標記用化合物的、具有熒光特性的部分構造，是指通過標記用化合物和抗體發生反應后結合在抗體上的那部分化學構造。作為為了使熒光性官能團結合到抗體上而使用的標記用化合物，能夠使用如吲哚花青綠衍生物之類。作為優選的標記用化合物，可以使用如在Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters,5(22),pp.2689-2694,1995中記載的吲哚花青綠-N-羥基琥珀酰亞胺基酯(ICG-OSu)和吲哚花青綠-N-羥基硫代琥珀酰亞胺基酯(ICG-sulfo-OSu)等。如果使用這些標記用化合物，能夠容易地使作為熒光性官能團的吲哚花青綠衍生物的整個母核構造導入到抗體上。
熒光性官能團既可以直接和抗體結合，熒光性官能團和抗體之間也可通過接頭(リンカ-)或白蛋白等蛋白質結合。在白蛋白等蛋白質上，能導入一個或兩個以上前面所述的熒光性官能團，好的時候能導入十個以上，而且抗體的導入也變得非常容易，因此使用了這種蛋白的診斷用標記物是優選的。
本發明組合物包含的診斷用標記物中，作為優選的診斷用標記物，能夠例舉出①含有(a)抗體和、(b)與該抗體結合的如式(Ⅰ)所示的
(分子式中，R1及R2各自獨立地表示氫原子、烷基、芳基、烷氧基、或磺酸基；R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代的烷基；X-表示需要時存在的陰離子材料；Y為碳原子數1乃至10的亞烷基、或含有氧原子、氮原子、及硫原子的一個以上原子的碳原子數在1至10之間的亞烷基)熒光性官能團的診斷用標記物；及②含有(a)抗體和、(b)與該抗體結合的分子式如(Ⅱ)所示的
(分子式中，R4及R5各自獨立地表示氫原子、烷基、烷氧基、或磺酸鹽基；R6表示亞烷基；M+表示堿金屬離子；Q表示鹵素離子、高氯酸離子、或硫氰酸離子；Y為碳原子數1到10的亞烷基、或含有從氧原子、氮原子、及硫原子中選取出來的一個以上原子的碳原子數在1至10之間的亞烷基)熒光性官能團的診斷用標記物。
用上述分子式(Ⅰ)及(Ⅱ)表示的熒光性官能團，是通過結合在母核上的-Y-CO-基的羰基與抗體結合的。上述分子式(Ⅰ)中，R1及R2各自獨立地表示氫原子、烷基、烷氧基、或磺酸基(-SO3H)。R1及R2，分別能夠在到苯基上的任意位置取代。作為烷基，可以使用碳原子數在1至6范圍的直鏈或支鏈低級烷基，最好是使用碳原子數在1至4范圍的直鏈或低級支鏈烷基。例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等最為合適。
作為用R1及R2表示的芳基，可以使用取代或未取代的苯基、萘基、吡啶基等。作為烷氧基，可以使用碳原子數在1至6范圍優選碳原子數在1至4范圍的直鏈或支鏈低級烷氧基，具體說來，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基是最適合使用的。作為磺酸基，可以使用游離形態的-SO3H基、磺酸基的堿加成鹽(磺酸鹽基)，比如鈉鹽、鉀鹽等。其中，R1及R2最好是分別表示氫原子、烷基、烷氧基、或磺酸鹽基。
R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代的烷基。在這些基團當中，作為烷基，可以使用前面敘述的物質。磺酸烷基的磺酸基或氨基取代烷基的氨基，可以分別取代烷基上的任何部位，比如可以使用烷基末端取代的物質。
磺酸基及氨基，可以分別形成堿加成鹽及酸加成鹽。比如磺酸可形成鈉鹽和鉀鹽、氨基可以形成鹵化銨等鹽，優選氨基形成季銨鹽等。另外，作為氨基可以使用取代或未取代的氨基。作為磺酸烷基或氨基取代烷基的例子，可以例舉磺酸甲基(-CH2SO3H)、磺酸乙基、氨甲基、氨乙基、甲氨乙基、及它們的鹽。
在用式(Ⅰ)表示的熒光性官能團中，X-表示需要時存在的陰離子材料，例如鹵素離子、醋酸根離子、高氯酸根離子、碳酸根離子等。用X-表示的這些陰離子材料，可以抵消Y-CO-基取代的母核內氮原子所帶的正電荷，以維持用式(Ⅰ)表示的熒光性官能團整體為中性。因此，例如當用式(Ⅰ)表示的熒光性官能團中的R1、R2及R3三個基團中的某個基團為陰離子性基團時，這個基團的負電荷會抵消母核內季銨所攜帶的正電荷，由此形成分子內兩性離子，此時就不需要X-了。另一方面，例如R1或R2是磺酸基，R3是氨基取代烷基時，為了使這些基團之間電荷均衡，此時X-又變得很有必要了。
在上述分子式(Ⅱ)所表示的熒光性官能團中，R4和R5分別各自代表氫原子、烷基、烷氧基、或磺酸鹽(スルホネ一ト)基。R4和R5能夠分別取代苯基上的任意位置。作為烷基及烷氧基能夠使用上述物質，作為磺酸鹽基(-SO3-M+:M+表示堿金屬離子，和Q-的偶離子M+既可相同也可以不一樣)，可以使用諸如磺酸鈉基或磺酸鉀基等。
R6表示直鏈或者支鏈的亞烷基，例如，碳原子數在1-6之間，優選碳原子數在2-5之間的直鏈或支鏈的低級亞烷基，優選使用三甲撐基、四甲撐基、或五甲撐基。取代R6的-SO3基，能夠取代該亞烷基的任意位置，例如優選使用置換了亞烷基末端的物質。更加具體地說，作為R6-SO3，例如用-(CH2)k-SO3(k表示2-4的整數)表示的基團等是最合適的。
M+表示堿金屬離子。作為堿性金屬離子，優選使用鈉離子或鉀離子。Q表示鹵素離子、高氯酸根離子、或硫氰酸根離子，優選使用氯離子、溴離子、或碘離子等。這當中，碘離子是最好的。不必拘泥于任何特定的理論，上述的熒光性官能團盡管有Y-CO-取代的氮原子所攜帶的正電荷(上式中用N+表示)和來自于R3-SO3的負電荷，若與用M+Q-表示的堿金屬鹽共存的話，氮原子所攜帶的正電荷(上式中用N+表示)和Q-之間、及R3-SO3和M+之間，分別形成離子鍵。其結果，阻止了分子內的偶離子形成，維持分子整體的離子特性，水溶性顯著增大。
在上述分子式(Ⅰ)和(Ⅱ)中，Y為碳原子數1到10的直鏈或支鏈的烷基，優選碳原子數3-5的直鏈或支鏈的亞烷基，更優選三甲撐基、四甲撐基、或五甲撐基。另外，Y表示含有選自氧原子、氮原子、及硫原子的一個以上原子的碳原子數1-10的直鏈或支鏈烷基。作為用-Y-CO-表示的基團，例如可以利用-CH2-CO-；-(CH2)2-CO-；-(CH2)3-CO-；-(CH2)4-CO-；-(CH2)5-CO-；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)2-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)3-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)4-CO-NH-(CH2)5-CO-；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)2-CO-；-(CH2)4-CO-(N,N’-piperadinyl)-(CH2)2-CO(N,N’-piperadinyl，表示哌嗪的1-位被-(CH2)4-CO-基團取代，4-位被-(CH2)2-Z基團取代。以下與此相同。)；或-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-(N,N’-piperadinyl)-(CH2)2-CO-等。
另外，-Y-CO-基團的羰基，也可進一步通過碳原子數1-10的直鏈或支鏈的亞烷基；含有選自氧原子、氮原子、及硫原子的一個以上原子的碳原子數1-10的直鏈或支鏈亞烷基；或-NH-NH-基等與抗體結合。而且，上面所敘述的優選的診斷用標記物，在特愿平7-12283號說明書及特愿平7-223613號說明書中已做了詳細的說明、其制造方法在說明書上也做了詳細的記載，從事本行業的人如果遵照這些公開的說明，就可容易地制造出上面所敘述的優選的診斷用標記物。此外，促使用上述分子式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示的熒光性官能團和抗體相結合的標記用化合物也同樣在上述說明書中做了公開說明。而且，在用分子式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示的熒光性官能團中，為了方便起見，把氮原子所攜帶的正電荷(上式中用N+表示)固定的寫在母核內的一個氮原子上，其實通過共軛雙鍵，正電荷有可能移動到另一個氮原子上去，這一點對從事本行業的人來說是很容易理解的。
作為構成診斷用標記物的抗體，能夠利用識別各種抗原的、對癌特異性高的抗體。例如能夠應用與癌細胞和癌組織、最好是與早期癌細胞和早期癌組織特異性結合的抗癌抗原抗體，具體點說，可以使用與CEA、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、Span-1、CA72-4、CA125、HCG、p53、STN(シアリルTn抗原)、c-erbB-2蛋白發生特異性反應、與胃有關的抗腫瘤抗體、抗粘蛋白抗體、抗糖鏈抗體等，及其它如與食道癌、大腸癌、直腸癌、皮膚癌、子宮癌等腫瘤抗原發生特異性反應的抗腫瘤抗體。而且，也可以使用在抗病原體蛋白抗體、抗癌抗原抗體上結合了抗生物素蛋白或生物素等增強反應體系的抗體等。不過，上面說明的抗體只是示范性的，診斷用標記物能夠使用的抗體并不限于上面所例舉到的，只要是與作為檢查診斷目的的靶細胞和靶組織發生實質性特異性結合的抗體，均可應用。
構成診斷用標記物的抗體、因為可與癌抗原等發生特異性地結合，所以癌細胞和癌組織等病灶均可采用診斷用標記物進行免疫染色。然后，用紅外線激光等進行近紅外線甚至遠紅外線照射，根據發出的熒光可以確認病灶。因為本發明的組合物包含的熒光增強劑，它可使診斷用標記物的熒光強度增加數倍--數十倍，這樣應用熒光測定裝置，便能夠輕易地把病灶確定下來。
本發明的組合物，一般提供水溶性組合物、或微粒子狀粉末及凍結干燥粉等固體組合物。作為熒光增強劑最好使用包含糖衍生物和酰基甘油磷酸的水溶性組合物，例如把辛基糖苷等表面活性劑根據需要溶解于生理鹽水或磷酸緩沖生理鹽水等水溶性介質后，加入二硬脂酰基磷脂酸的鈉鹽，在室溫-約60℃范圍，優選約50℃，更優選約40℃溶解，然后，加入溶解了診斷用標記物的生理鹽水或磷酸緩沖生理鹽水等水溶性介質，混合，配制而成。不過，本發明組合物的配制方法并不限于上面所例舉到的，從事本工作的人毫無疑問可選擇其它適宜的方法。把上面敘述到的水溶性組合物凍結干燥，使其成為凍結干燥粉末狀的組合物，也可得到本發明的組合物。
另外，本發明的組合物可以把包括熒光增強劑的水溶液(例如酰基甘油磷酸及需要時含有的表面活性劑的水溶液)及包含診斷用標記物的水溶液分別準備好，在診斷使用前將兩液體混合調配好。而且，也可以采用下面的方法進行診斷在給予包含診斷用標記物的水溶液后，再把包含熒光強度增強劑的水溶液通過別的途徑再給予。
為了配制本發明的組合物，從藥理學、制劑學角度考慮允許使用的添加物如下賦形劑、崩解劑及其輔助劑、結合劑、潤滑劑、包衣劑、色素、稀釋劑、基質、溶解劑及其輔助劑、等滲劑、pH調節劑、穩定劑、拋射劑、及粘合劑等。比如可以添加葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、淀粉、或結晶纖維素等賦形劑；羧甲基纖維素、淀粉、或羧甲基纖維素鈣等崩解劑及其輔助劑；凡士林、液體石蠟、聚乙二醇、明膠、高嶺土、甘油、純水、或硬脂等基質；葡萄糖、氯化鈉、D-甘露糖醇、甘油等滲劑；無機酸、有機酸、無機堿或有機堿等pH調節劑；維生素A、維生素E、輔酶Q等有助于穩定的藥物制劑用添加物。
把本發明的免疫組織化學染色用組合物當作診斷藥物使用的例子，擬結合使用紅外線內窺鏡進行檢查的方法加以說明，對懷疑病灶存在的組織噴射或涂抹專供內窺鏡使用的上述診斷藥物(濃度范圍為0.1-1000mg/ml)，使病變部位染色，適當清洗把多余的診斷藥從組織中除去，用近紅外線乃至遠紅外線，具體點說，用波長600-800nm范圍、最好用波長768nm的光線，或用激光激發光等進行照射，就能把發出熒光的病灶部位給檢出來。本發明的組合物可直接應用于活體，而且，具有熒光強度良好的特性，但本發明的組合物的使用范圍并不限定于活體，對石蠟包埋的標本同樣適合使用。
為了檢出熒光，可以使用如紅外線內窺鏡或紅外線顯微鏡等手段，可以使用具有透過特性的濾光器，具體點說，可把具有可以擋住激發光特性的濾光器和熒光檢出用濾光器一或兩片以上組合起來使用。用本發明的組合物進行活體內窺鏡檢查時，可使用放大率在10-1000范圍的內窺鏡，最好使用具有顯微鏡水平放大率的紅外線內窺鏡等。另外，內窺鏡方面，還可設計噴射或涂抹本發明組合物的手段、及洗凈手段。
需要使用本發明組合物對取出的活體組織及標本進行處理時，可以使用檢出熒光的紅外線顯微鏡。而且，在普通光下觀察標本、確定染色部位后，在暗室內紅外線光源下，或用紅外線膠片進行攝影，也可以先將其記錄在錄象帶等記錄媒體上，然后用電子計算機進行圖象分析。
實施例下面通過實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的范圍并不限于以下的實施例。
實施例1吲哚花青綠衍生物而使用ICG-sulfo-OSu(Biooraganic&Medicinal Chemistry Letters,5(22),pp.2689-2694,1995)，參照該刊物記載的方法，配制了每分子小鼠抗CEA抗體可與16分子的ICG-sulfo-OSu結合的診斷用標記物。這種診斷用標記物凍干保存直到使用前。把這種診斷用標記物溶解在含37.5mM辛基糖苷的PBS-液中，測定吸收光譜和熒光光譜。結果，最大吸收波長為802.8nm，摩爾吸光系數3.90×105M-1.cm1(狹縫寬度0.2nm，對照含37.5mM辛基糖苷的PBS液，常溫測定)；激發波長為768nm，熒光波長為820nm(激發光側狹縫寬度5nm；熒光側狹縫寬度5nm)。
另一方面，往磷酸緩沖生理鹽水(10ml,pH7.4)中靜靜地加入辛基糖苷(株式會社同仁化學研究所制，880mg)，在40℃水浴環境中邊攪拌使其溶解。接著，往溶液中加入二硬脂酰基磷脂酸鈉(148.8mg)，在60℃水浴環境中邊攪拌使其溶解，加入磷酸緩沖生理鹽水使其最終液量為20ml，降至室溫后，分裝成1ml的包裝，冰凍保存，直到臨用時。這種溶液的二硬脂酰基磷脂酸鈉和辛基糖苷的終濃度分別為10mM和150mM。
在凍結干燥狀態的上述診斷用標記物(54μg)中加入10％(v/v)二甲基亞砜(DMSO)-磷酸緩沖生理鹽水(20μl,pH7.4)溶解，這種溶液每5μl中加入上述加溫的二硬脂酰基磷脂酸鈉及辛基糖苷溶液5μl，用微吸量管緩慢地反復吹打，使之混勻，即可獲得水狀的本發明組合物。另外，使用吲哚花青綠(ICG)溶液、ICG-sulfo-OSu溶液、及水(對照)代替診斷用標記物溶液，通過同樣的操作制得水溶性組合物。觀察上述各種樣品溶液(添加組)和未加含有二硬脂酰基磷脂酸鈉及辛基糖苷的溶液的樣品溶液(未添加組)，波長在800nm以上的熒光發光，以評價添加二硬脂酰基磷脂酸鈉所引起的熒光強度的增加。發現在添加了二硬脂精磷酸肌酸鈉溶液的診斷用標記物組，熒光強度顯著增強。
而且，使用奧林帕司光學社制的BHSM-IR，這是一種從可見光到近紅外線范圍均可觀察的紅外線顯微鏡，在樣品的下方配置激發光透過濾光器(朝日分光社制)，它能透過波長在710-790nm范圍的光，在樣品的上方配置激發光透過濾過器(朝日分光社制)，它能透過波長在810-920nm范圍的光。CCD使用日立電子社制造的KP-MI，把經過CCD的熒光攝入列圖象攝取裝置(奧林帕司光學社制，EVIP-230)，經過增幅系統(奧林帕司光學社制)記錄到圖象記錄裝置(奧林帕司光學社制，S321S)內。
把上述樣品各5μl滴到放在載玻片上的木棉紗布線(1cm)上，采用上述光學系統攝取普通光及紅外線光照射下的圖象。熒光強度按照下面的劃分進行評價圖象上完全觀察不到熒光者規定為(-)，可見到部分熒光者規定為(+)，熒光清晰可見者規定為(++++)，介于它們之間的再劃分為(++)和(+++)兩個級別。又通過前述機器，對記錄下來的圖象，進行包括原圖像的累計處理、背景圖像的累計處理、減算圖像的制作、過濾圖象的制作、及增強反差等系列圖象處理，轉換成最終圖象。結果如下面的表1所示。添加了二硬脂酰基磷脂酸鈉的診斷用標記物，熒光強度明顯增強。表中濃度均表示ICG換算濃度。又，圖1是采用上述光學系統，對滴加了本發明組合物的木棉紗布線進行普通光或紅外線光照射而拍攝到的照片。圖中(a)表示在普通光照射下的拍攝結果，(b)表示在紅外線光照射下的拍攝結果。
表
s>+++非常清晰可見++清晰可見+可見±隱約可見實施例2和實施例1一樣，采用小鼠抗粘蛋白抗體(抗MUC-1:Yamamoto,M.,et al.,Japanese Journal of Cancer Research,87(5),pp.488-496,1996)，配制了每分子抗體與16分子的ICG-sulfo-OSu結合的診斷用標記物。這種診斷用標記物一直冰凍干燥保存，直到臨使用前。采用和實施例1同樣的方法測定吸收光譜和熒光光譜，最大吸收波長為802.8nm，摩爾吸光系數3.90×105M-1.cm1(狹縫寬度0.2nm，對照含37.5mM辛基糖苷的PBS液，常溫測定)；激發波長為768nm，熒光波長為820nm(激發光側狹縫寬度5nm；熒光側狹縫寬度5nm)。
又，采用小鼠抗硫代粘蛋白抗體(91.9H:Irimura,T.,etal.,Cancer Res.,51,pp.5728-5735,1991)，配制了每分子抗體與16分子的ICG-sulfo-OSu結合的診斷用標記物。這種診斷用標記物一直冰凍干燥保存，直到臨使用前。采用和實施例1同樣的方法測定吸收光譜和熒光光譜，最大吸收波長為802.8nm，摩爾吸光系數3.90×105M1.cm-1(狹縫寬度0.2nm，對照含37.5mM辛基糖苷的PBS-液，常溫測定)；激發波長為768nm，熒光波長為820nm(激發光側狹縫寬度5nm；熒光側狹縫寬度5nm)。進而采用人抗CEA抗體、人抗粘蛋白抗體及人抗硫粘蛋白抗體，均配制成了每分子抗體與16分子的ICG-sulfo-OSu結合的診斷用標記物。給予這些診斷用標記物的分光學光譜數據，與各自對應的、由小鼠抗體配制成的診斷用標記物相同。
在從小鼠抗粘蛋白抗體得到的上述診斷用標記物的凍結干燥品100μg中加入4.0ml的磷酸緩中生理鹽水溶解，取這種液體1.5ml再加本發明的熒光增強劑溶液1.5ml，在50℃的水浴環境中加熱，配制成最終的樣品。作為對照配制了加1.5ml磷酸緩沖生理鹽水的溶液。最終診斷用標記物的抗體濃度為83.3nM、ICG-sulfo-OSu的濃度為1.33μM。
使用日立分光光度計650-40測定各種樣品的熒光光譜。激發光和熒光的縫隙均為5nm。將測定1ppm硫酸奎寧得到的熒光強度作為標準值，測定前68.0(λex=255nm,λem=451nm)，測定后69.5(λex=255nm,λem=451nm)。結果如表2所示。
表2
OG辛基糖苷(37.5mM)DSPA二硬脂酰基磷脂酸(2.5mM)DSPC二硬脂酰基磷脂酰膽堿(2.5mM)DMPA二棕櫚酰基磷脂酸(2.5mM)STAD硬脂酸(2.5mM)PBS磷酸緩沖生理鹽水(對照)a常溫測定，其它組合物在50℃加熱后馬上測定b括號內為熒光強度增強劑添加前的值c括號內為熒光強度增強劑添加前的值另外，關于表中組合物6，添加熒光強度增強劑二肉豆蔻酰基磷脂酸和辛基糖苷前后的吸收光譜及熒光光譜的變化如圖2所示。圖中，(c)為熒光強度增強劑添加前、(c’)為熒光強度增強劑添加后的吸收光譜；(d)為熒光強度增強劑添加前、(d’)為熒光強度增強劑添加后的熒光光譜。包含熒光強度增強劑的本發明組合物，使吸收光譜和熒光光譜的強度顯著增大，在熒光的發射光譜方面，最大熒光波長向長波長側移位約18nm。實施例3為了探討辛基糖苷的熒光強度增強作用和濃度之間的關系，將實施例2所制得的ICG-sulfo-OSu標記抗粘蛋白抗體的凍結干燥品400μg，加入到16ml的磷酸緩沖生理鹽水中溶解，取這種溶液1.5ml再加各種濃度的辛基糖苷溶液1.5ml，在50℃衡溫。最終的診斷用標記物中抗體濃度為83.3nM、ICG-sulfo-OSu的濃度為1.33μM。和實施例2一樣測定樣品的熒光光譜。激發光和熒光的狹縫均為2nm。將測定1ppm硫酸奎寧得到的熒光強度作為標準值，測定前100.0(λex=251nm,λem=450nm)，測定后96.0(λex=251nm,λem=450nm)。結果如表3所示。在辛基糖苷臨界膠束濃度(25mM)附近，熒光強度急劇增加，在這以上的濃度可見到熒光強度平穩增加。隨著熒光波長向長波長側移位，在臨界膠束濃度附近，可見到移位急劇增大。
表3
OG辛基糖苷產業上的應用本發明的組合物對活體組織免疫染色有用，例如對應用紅外線內窺鏡等進行準體內食道癌、胃癌、或大腸癌等上皮組織惡性新生物的早期診斷，和外科手術時的病灶定位、診斷有用。由于本發明的組合物具有熒光強度良好的特征，經紫外線激發不會對活體組織和DNA造成損傷，可應用普通的熒光檢出裝置直接對活體進行檢查或診斷。特別是使用本發明的熒光強度增強劑后，熒光的峰波長向長波長側移位，而且，由于在峰波長位置的吸收光強度顯著增大，不受激發光的干涉使熒光觀測變得更加容易，使包括熒光濾過器等在內的測定系統整體設計的容許度得到大幅度地改善，此為本發明的特征。
權利要求
1．組合物，其特征在于其是免疫組織化學染色用的組合物，其含有包括熒光性官能團結合抗體在內的診斷用標記物和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質。
2．權利要求1的組合物，其中甘油磷脂是酰基甘油磷酸。
3．權利要求2的組合物，其中酰基甘油磷酸是包含2個C10-20脂肪酸殘基的1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸。
4．權利要求3的組合物，其中1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸是是二肉豆蔻酰基磷脂酸或二硬脂酰基磷脂酸。
5．權利要求1的組合物，其中甘油磷脂是酰基甘油磷酸膽堿。
6．權利要求5的組合物，其中酰基甘油磷酸膽堿是包含2個C10-20脂肪酸殘基的1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸膽堿。
7．權利要求6的組合物，其中1,2-二酰基-sn-甘油3-磷酸膽堿是二硬脂酰基磷酸酯酰膽堿。
8．權利要求1的組合物，其中該表面活性劑是辛基糖苷。
9．權利要求1-8任一項的組合物，包括選自甘油磷脂及脂肪酸的物質和上面記載的表面活性物質。
10．權利要求1-9任一項的組合物，其中該熒光性官能團是源自吲哚花青綠衍生物的官能團。
11．權利要求10的組合物，其中熒光性官能團是源自吲哚花青綠-N-羥基硫代琥珀酰亞胺基酯的官能團。
12．權利要求1-11任一項的組合物，其中抗體是抗癌抗原抗體。
13．熒光強度增強劑，是含有熒光性官能團結合抗體的免疫組織化學染色用的診斷用標記物的熒光強度增強劑，含有選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質。
14．應用組合物對癌細胞進行免疫組織化學染色的方法，其特征在于該組合物包括包括含有熒光性官能團結合抗體的診斷用標記物，和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質。
15．應用組合物對癌進行免疫組織化學診斷的方法，其特征在于該組合物包括含有熒光性官能團結合抗體的診斷用標記物，和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性劑的物質。
全文摘要
免疫組織化學染色用組合物，其特征在于它包括含有熒光性官能團結合抗體的診斷用標記物，和選自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物的表面活性劑的物質。該組合物具有良好的熒光強度，而且經紫外線激發不會引起活體組織或DNA的損傷，所以可用于活體免疫組織化學染色。比如可以使用紅外線內窺鏡等進行的食道癌、胃癌、或結腸癌等上皮組織惡性腫瘤準體內早期診斷、及外科手術時的病灶定位診斷成為有效而且安全的進行。
文檔編號G01N33/58GK1238042SQ97199808
公開日1999年12月8日 申請日期1997年9月18日 優先權日1996年9月19日
發明者芝村誠一, 伊東進, 竹迫和浩, 入村達郎 申請人:第一化學藥品株式會社