來自原生動物陰道毛滴蟲的高半胱氨酸脫硫酶的制作方法

專利名稱：來自原生動物陰道毛滴蟲的高半胱氨酸脫硫酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用一種催化高半胱氨酸，半胱氨酸，鄰乙酰-L-絲氨酸和/或甲硫氨酸降解的酶，該酶具體地說是高半胱氨酸脫硫酶，來測定生物學樣品中高半胱氨酸，半胱氨酸，鄰乙酰-L-絲氨酸和/或甲硫氨酸水平的測定法，還涉及編碼原生動物高半胱氨酸脫硫酶的多核苷酸片斷，包含該多核苷酸片斷的重組載體，含有所述多核苷酸片斷或所述重組載體的轉化細胞，原生動物高半胱氨酸脫硫酶多肽和用于醫學或獸醫學的含有重組高半胱氨酸脫硫酶的藥用組合物。
血液中高半胱氨酸水平的升高似乎是許多人類疾病狀態的重要指示物。高半胱氨酸是血管疾病和中風的征兆，Ueland,P.M.(1992)和Kluiitmans L.A.J.等(1996)；與糖尿病的形式和醇中毒相關，Cravo,M.L.等(1996)；用于監測肝臟和腎臟損傷，Bostom,A.G.等(1996)和神經管缺陷，Steegers-Theunissen,R.P.N.(1992)并與代謝的某些先天錯誤相聯系，Mudd,S.H.,(1989)。
血液中高半胱氨酸的水平按常規使用高效液相色譜(HPLC)方法測定，參見例如Poele-Pothoff M.T.B.等(1995)。然而，HPLC方法采用了昂貴而費力的機器，一般很復雜且據認為對于許多常規分析是不實際的。
專利公開WO93/15220(Cockbain)描述了使用高半胱氨酸轉化酶，S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH-水解酶)測定血液中的高半胱氨酸的方法。SAH-水解酶催化高半胱氨酸與共同底物，腺苷轉變為S-腺苷-高半胱氨酸。然后經過測定消耗的腺苷量可與消耗的高半胱氨酸量相關聯。然后從腺苷濃度差測定樣品中高半胱氨酸的量。然而，這種測定需要使用兩種起始底物(高半胱氨酸和腺苷)和兩種酶，使其相當復雜。它還涉及測定腺苷濃度的下降，可能不盡人意。
US4940658(Allen等)描述了一種測定身體組織樣品中巰基氨基酸，包括高半胱氨酸水平的方法，使用對總高半胱氨酸水平的測定來檢測鈷胺素和葉酸缺乏的方法，和使用對總高半胱氨酸水平的測定結合對甲基丙二酸的測定來區分鈷胺素與葉酸缺乏的方法。該測定包括將樣品與含有用合適標記物標記的待測已知量的巰基氨基酸的參照標準結合并用質譜儀測量各種類存在的標記和未標記的巰基氨基酸的相對量。由于標記種類的量是已知的，因此可計算標記與未標記種類的比率以測定在樣品中存在的巰基氨基酸的量。
US5438017描述了一種用于分析體液樣品中的巰基氨基酸的氣相色譜/質譜分析法。該測定依賴于使用標記的參照巰基氨基酸，相似于在US4940658中所述，但在經氣相色譜/質譜分析法分析樣品前需要另外的處理和/或純化步驟。
可以預期的是與HPLC方法相似，采用氣相色譜/質譜分析法的上述測定一般較為復雜，需使用昂貴和費力的機器且據認為對于許多常規分析是不實際的。
本發明的一個目的是提供一種避免和/或減輕至少一些上述缺陷的測定方法。
本發明的另一目的是提供能催化包括用于所述測定的高半胱氨酸降解的重組酶。
本發明提供了編碼原生動物高半胱氨酸脫硫酶的多核苷酸片斷，如DNA片斷。本發明進一步提供了一種重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶多肽。
本文所用的“高半胱氨酸脫硫酶”指能催化高半胱氨酸降解以釋放α-丁酮酸，硫化氫，和氨的酶。
這種酶也可具有對諸如甲硫氨酸，半胱氨酸和鄰乙酰基-L-絲氨酸的其它底物的親和性。例如，如果甲硫氨酸用作底物，則該酶的代謝終產物是α-丁酮酸，氨和甲硫醇。
應預料到的是可以有一些形式(例如，來自不同生物)或同工型的“高半胱氨酸脫硫酶”且本文包括所有這些形式/同工型及其應用。
本文使用的“多核苷酸片斷”指能產生高半胱氨酸脫硫酶或其生理學功能性衍生物的諸如脫氧核糖核酸(DNA)序列的核苷酸鏈和諸如RNA的其轉錄產物。生理學功能性衍生物是以酶功能性將該酶鑒定為上文所定義的高半胱氨酸脫硫酶的一種衍生物。因此，該術語包括雙鏈和單鏈DNA和從其產生的RNA序列。該術語排除了包括例如，在原生動物Trichomonas vaginalis中發現的該多核苷酸片斷的完整天然存在的基因組。
一般來說，該多核苷酸是基本上分離的形式。即，基本上沒有正常情況下在體內與完整基因組相聯系的生物學材料。
一般來說，術語“多肽”指表現出的生物學活性基本上相似于高半胱氨酸脫硫酶的生物學活性的氨基酸鏈或序列但不指具體長度的這種產物。如果需要，該多肽可在體內和/或體外進行修飾，例如，經過糖基化，酰胺化，羧基化，磷酸化和/或翻譯后裂解修飾，因此其包含特別是肽，寡聚肽，蛋白質和融合蛋白質。自然，專業技術人員會預料到修飾的多肽應保留生理學功能，即，具有高半胱氨酸脫硫酶活性。
編碼高半胱氨酸脫硫酶的DNA片斷可經過利用部分高半胱氨酸脫硫酶的cDNA來獲得。經過信使RNA的逆轉錄且隨后一般使用本領域已知的聚合酶鏈式反應(PCR)技術進行擴增可獲得該cDNA，例如，該PCR使用針對相關酶的保守區域設計的引物，如胱硫醚γ-裂解酶編碼序列，例如，人，大鼠和/或酵母胱硫醚γ-裂解酶。然后使用含有部分高半胱氨酸脫硫酶基因的擴增片斷從含有該基因的cDNA文庫克隆完整的高半胱氨酸脫硫酶基因。該cDNA文庫可來自原生動物，例如，陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)cDNA文庫。以這種方式獲得的含有高半胱氨酸脫硫酶基因的多核苷酸片斷在

圖1和2中描述。
圖1的DNA片斷編碼含有下文稱為CTLα(隨后重新命名為MGL1)的396個氨基酸的開放閱讀框(ORF)的基因ctlα(隨后重新命名為mgl1)。圖2的DNA片斷編碼含有下文稱為CTLβ(隨后重新命名為MGL2)的398個氨基酸的ORF的基因ctlβ(隨后重新命名為mgl2)。圖1和2所示的MGL1和MGL2與來自Pseudomonas putida的甲硫氨酸γ-裂解酶和來自酵母和人的胱硫醚γ-裂解酶(EMBL數據庫登記號分別為D30039,P31373和S52784)相同性百分數(在氨基酸水平上)的比較在表1中顯示。使用GCG Wisconsin程序包(Devereux,H.,Hacberli,P.Smithies,O.(1984)核酸研究，12,387-395)用缺口和加帽程序進行序列比較分析。
表1
表1顯示了圖1和2所示的推斷的高半胱氨酸脫硫酶與以前測序的甲硫氨酸γ-裂解酶和胱硫醚γ-裂解酶在氨基酸水平上僅有42-45％相同。因此，盡管使用針對胱硫醚γ-裂解酶保守區域設計的引物已克隆了MGL1和MGL2，但它們在多肽長度上基本上不相似。
本發明還包括與圖1和2中舉例的片斷具有至少80％，特別是至少90％，和特別是至少95％相似性的多核苷酸片斷。本發明還包括與圖1和2中舉例的多肽具有至少80％，特別是至少90％，和特別是至少95％相似性的多肽序列。“相似性”指核苷酸或氨基酸相同和保守取代，前提是高半胱氨酸脫硫酶的酶功能基本上未受損失。
技術人員會預料到可對基因或其衍生物進行遺傳操作，例如，經過本領域普遍已知的重組DNA技術克隆基因并在體外或體內表達由此編碼的多肽。具有圖1和2所述核苷酸序列的多核苷酸片斷或其衍生物優選用于高半胱氨酸脫硫酶的表達。
應明白對于本文包含的具體高半胱氨酸脫硫酶多肽，可存在變異(天然或其它)。這些變異可表現為在全序列上的氨基酸差異或在所述序列中一個或多個氨基酸的缺失，取代，插入，顛倒或添加。所有這些衍生物均包括在本發明的范圍內，前提是該衍生物具有生理學功能(即，表現出本文限定的高半胱氨酸脫硫酶活性)。例如，為達到本發明目的，可在下列各組內的氨基酸之間進行保守取代(Ⅰ)丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸；(Ⅱ)谷氨酸和天冬氨酸；(Ⅲ)精氨酸和賴氨酸；(Ⅳ)天冬酰胺和谷氨酰胺；(Ⅴ)異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸；(Ⅵ)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。
而且，可對鑒定在高半胱氨酸脫硫酶推斷的功能結構域內的氨基酸進行特定取代。例如，鑒定在推斷的底物結合結構域內的氨基酸可用保守或非保守氨基酸取代以觀察該取代產生的酶動力學方面的任何改變。該改變可導致，例如，高半胱氨酸比活增加，或比活減小而高半胱氨酸的Km下降，或對諸如半胱氨酸和鄰乙酰基-L-絲氨酸的其它底物的比活增加。
本發明人已表明MGL1中的半胱氨酸殘基C113和MGL2中的C116在高半胱氨酸脫硫酶的催化活性中起部分作用。他們已表明用甘氨酸取代半胱氨酸113/116仍產生有催化活性的高半胱氨酸脫硫酶。盡管該突變一般產生對所有底物比活減少的酶，但MGL2中的半胱氨酸116突變為甘氨酸產生對半胱氨酸和鄰乙酰基-L-絲氨酸比活增加的酶。而且，MGL2中半胱氨酸116突變為甘氨酸產生對高半胱氨酸的Km更低的酶。
另外已觀察到MGL1和MGL2序列相對于胱硫醚γ-裂解酶向N-端插入了7個氨基酸(MGL1中的殘基49-55)。該區域適合于突變研究。
突變研究使得可產生適合于許多不同用途的具有不同的催化活性的不同高半胱氨酸脫硫酶。
而且，可使用重組DNA技術制備編碼這些如上所述的衍生物的核酸序列。
正如本領域所熟知的，遺傳密碼的簡并性允許取代密碼子中的堿基以產生能編碼相同氨基酸的不同密碼子，例如，氨基酸谷氨酸的密碼子是GAT和GAA。因此，已清楚為了表達具有圖1或2所示氨基酸序列的多肽，或其片斷，可利用具有不同于圖1或2所示核酸序列的這類可替換的密碼子組合的衍生核酸序列。
另外，表現出高半胱氨酸脫硫酶活性的來自高半胱氨酸脫硫酶多肽或來自圖1和2所示氨基酸序列的片斷，或來自編碼所述高半胱氨酸脫硫酶多肽的核苷酸序列的或來自編碼所述高半胱氨酸脫硫酶多肽片斷的圖1和2所示的核苷酸序列的片斷也包括在本發明中。
自然，本領域的技術人員可預料到本發明包含產生所述高半胱氨酸脫硫酶多肽或基因的酶活性衍生物的上文所述的這類修飾。本發明的所述高半胱氨酸脫硫酶多核苷酸片斷優選與調控序列相連接。該控制序列可包括啟動子，操縱子，誘導物，核糖體結合位點，終止子等。本領域的普通技術人員可選擇給定宿主的合適的控制序列。另外，諸如添加氨基酸的所謂的“標記序列”可加到多肽的N或C端以便在表達多肽時產生所謂的融合蛋白質。
根據本發明的多核苷酸片斷可以連接到任何一個或多個各種表達控制DNA序列上，產生所謂的重組DNA分子。因此，本發明也包括含有可表達核酸分子的表達載體。然后，該重組核酸分子可用于轉化合適的宿主。表達載體優選是來自例如，質粒，或來自噬菌體或病毒產生的核酸序列的雜合DNA分子且稱為“載體分子”。
可用于克隆根據本發明的核酸序列的具體載體在本領域是已知的(例如，Rodriguez,R.L.和D.T.Denhardt，編輯，載體分子克隆載體和其用途綜述，Butterworths,1988)。
兩個特定的細菌表達載體pQE60和pQE30(Qiagen Hilden，德國)已用于高半胱氨酸脫硫酶表達。pQE系列表達載體(例如，pEQ60和pQE30)編碼一個6組氨酸標記(6×his-tag)，它能使用金屬-螯合親和色譜和快速蛋白質液相色譜(FPLC)純化融合蛋白質。
用于構建根據本發明的重組核酸分子的方法是技術人員已知的且特別是在Sambrook，等，(分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，1989)中闡述。
本發明也涉及含有可表達形式的核酸分子的轉化細胞。本文使用的“轉化”指將異源核酸序列導入宿主細胞，而不論所使用的方法，例如，直接吸收，轉染或轉導。異源多核苷酸片斷可通過自主復制來維持或可選擇整合進宿主基因組。優選提供具有與指定宿主相配伍的合適的控制序列的重組核酸分子且該控制序列可調節插入的多核苷酸片斷表達，例如，T7啟動子，taq啟動子，lac啟動子和trp啟動子。
用于表達重組核酸分子的合適的宿主可以是原核或真核來源。最廣泛用于表達重組核酸分子的宿主可選自細菌，酵母，昆蟲和哺乳動物細胞。重組高半胱氨酸脫硫酶的克隆和表達也有利于產生試劑，該試劑用于例如，原位表達研究的探針生產，抗高半胱氨酸脫硫酶抗體(特別是單克隆抗體)的生產和重組高半胱氨酸脫硫酶體外和體內生物學活性的評價。
本發明進一步提供了重組高半胱氨酸脫硫酶，它用于生產用作預防和/或治療劑的試劑。具體地說，本發明提供了含有重組高半胱氨酸脫硫酶及其藥用上可接受的載體的藥用組合物。諸如癌癥的疾病狀態可按與Hori,H.等(1996)對甲硫氨酸γ-裂解酶所述相似的方式受益于高半胱氨酸脫硫酶療法和/或預防處理。典型的高半胱氨酸脫硫酶可用于開發新的抗毛滴蟲藥，抗含高半胱氨酸脫硫酶和/或甲硫氨酸γ-裂解酶的其它病原體有活性的化合物。它們既包括使用重組高半胱氨酸在，例如，組合文庫中篩選抑制劑且也包括分析酶結構以便提供特異性抑制劑或前體藥物。
本發明提供了測定高半胱氨酸水平的工具。
因此，在本發明的另一方面提供了測定樣品中的高半胱氨酸的方法，包括下列步驟a)將樣品與能降解高半胱氨酸的酶接觸，和b)測定由所述酶對高半胱氨酸進行酶促降解所形成的任意反應產物。
可優選對高半胱氨酸和/或所述反應產物不進行色譜分離。
該酶優選高半胱氨酸脫硫酶，更優選的是重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶。
優選的是高半胱氨酸脫硫酶是根據圖1,2,6或7的高半胱氨酸脫硫酶。
重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶也可用于測定樣品中的其它底物，包括甲硫氨酸，半胱氨酸和鄰乙酰基-L-絲氨酸。
一般來說，生物學樣品可以是血液，血漿，糞便，唾液，陰道液或尿的樣品。高半胱氨酸可經二硫鍵結合到諸如白蛋白的循環蛋白質上，高半胱氨酸也可以其它二硫化物衍生物(一般是高半胱氨酸-半胱氨酸連接物)的形式存在。為了獲得存在于樣品中的總高半胱氨酸推定值，因此需要用還原劑處理樣品以裂解任何二硫鍵且釋放游離高半胱氨酸。二硫化物還原參見Jocelyn，酶學方法，143:243-256(1987)，其中列出了廣泛的合適還原劑。在本發明的說明中引入這些合適的還原劑。
為了方便，可測定上文所述反應的終產物，α-丁酮酸，硫化氫和氨，且各種合適的方法是技術人員已知的，例如，比色法，分光光度法，電化學法，熒光測定法或發光法。優選的是該方法的靈敏度足以檢測樣品中＜5μmol/l的高半胱氨酸濃度。
高半胱氨酸降解產生的α-丁酮酸可按Soda(Soda,K.(1968)生化年鑒，25:228-235)法使用3-甲基-2-苯并噻唑腙鹽酸(MBTH)檢測。
測定α-丁酮酸的另一方法按Li,R.+Kenyon,G.L.(1995),α-二羧酸化合物的分光光度法測定及其應用于α-丁酮酸的酶促形成，分析生物化學，230,37-40中所述。
檢測α-丁酮酸的一個特別優選的方法是經過加入NADH和乳酸脫氫酶以便將α-丁酮酸轉變為α-羥基丁酸且產生NAD+。然后可經過許多涉及轉變成NADH的方法測量NAD+水平，該方法包括經過在340nm處測吸光度的分光光度法，經過在365nm處激發和在460nm處發射的熒光法(Palmer T.(1991)，了解酶，第3版，Ellis Horwood，倫敦)；使用四氮唑鹽的比色法(Altma,P.F.(1974)組織化學38，p155-171)；電化學法(Morroux J.Elring PJ(1979)化學年鑒，51.346；Blaedel WJ,Jenkins RA(1975)化學年鑒47,1335；Juegfeldt H等(1981)化學年鑒53,1979；Wang J,Lin MS(1987)電化學年鑒221,257)；和發光法(Whitehead TP等(1979)臨床化學25,1531)。
作為選擇，丙酮酸脫氫酶可用于代替乳酸脫氫酶以產生NAD+并按上述檢測NAD+。
高半胱氨酸降解產生的硫化氫可經過，例如，按照下列(化學計算)方程式與醋酸鉛反應產生硫化鉛來測定。
然后可在合適的波長，如A360nm處經分光光度法測量所產生的硫化鉛。(Thong K.W.+Coombs,G.H.(1985)毛滴蟲中的高半胱氨酸脫硫酶活性。lRCS醫藥科學13.493-494)。
作為選擇，使用Clime,J.D.Limnol,Oceanogr.(1969)14:454-458所述的亞甲藍方法可測量硫化氫。簡單地說，硫化氫與在酸中的0.17mM N,N-二甲基-對-苯二胺磺酸和在酸中的氯化鐵反應產生可在650-670nm經分光光度法檢測的亞甲蘭。
高半胱氨酸降解產生的氨可在次氯酸鹽存在下與酚反應以產生靛酚，如Horn,D.B.+Squire,C.R.(1967)，檢測血漿中氨的改進方法，臨床化學學報，17,99-105中所述。然后可在合適的波長，例如，570nm下經分光光度法檢測所產生的靛酚。
NH3+OCl+酚→靛酚檢測氨的其它方法包括酶學法，按Guilbault等(1985)化學年鑒，57,2110所述使用α-酮戊二酸和NAD(P)+與谷氨酸脫氫酶；使用2-酮戊二酸和NADH以產生谷氨酸，水和NAD+且然后按上述測量NAD+；向氨中加入硝酸銀以產生黑色沉淀。
根據本發明的重組高半胱氨酸脫硫酶對許多底物表現出活性，除了高半胱氨酸外，還包括甲硫氨酸，半胱氨酸和鄰乙酰基-L-絲氨酸。因此可預料到高半胱氨酸脫硫酶可用于以上述相同的方式測定甲硫氨酸，半胱氨酸和/或鄰乙酰基-L-絲氨酸。
而且，由于本發明的重組高半胱氨酸脫硫酶對廣泛的底物表現出活性，該酶可用于合成非常見氨基酸和相關分子。
另外高半胱氨酸脫硫酶可用于從溶液中，例如從生物學培養基中去掉高半胱氨酸，甲硫氨酸和/或半胱氨酸。
高半胱氨酸脫硫酶也可用于試驗能催化涉及高半胱氨酸作為底物或產物的反應的酶(例如，S-腺苷高半胱氨酸水解酶)。以這種方式可測定的高半胱氨酸可應用于在生物學樣品中對其的檢測上。同樣，高半胱氨酸脫硫酶可用于測定能催化涉及甲硫氨酸或半胱氨酸或有關化合物作為底物或產物的反應的酶。這些代謝物可經過其被高半胱氨酸脫硫酶轉變為α-酮酸并按前面所述測量α-酮酸來測定。
該測定法也可用于估測分析物，該分析物首先斷裂成高半胱氨酸，然后經過測量高半胱氨酸的濃度來測定分析物的濃度。該分析物的例子包括高胱氨酸(其中使用DTT將高胱氨酸轉變成高半胱氨酸)或甲硫氨酸(可酶促轉變為高半胱氨酸)。因此在兩種情況下經過測量高半胱氨酸可測定分析物的濃度。
在另一方面，提供了一種用于體外測定樣品中高半胱氨酸水平的診斷試劑盒，其中該試劑盒包括a)能降解高半胱氨酸的酶，和b)能測定高半胱氨酸被該酶降解產生的反應產物的工具。
優選的是，該酶是高半胱氨酸脫硫酶，更優選的是重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶。
典型的是，該試劑盒的形式可以是用于手工和自動使用的以杯為基礎的試驗試劑盒，微量滴定平板試驗試劑盒或以試驗條為基礎的試驗試劑盒。
一種特別優選的用于體外測定樣品中高半胱氨酸水平的診斷試劑盒包括a)重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶，和b)乳酸脫氫酶和NADH，用于將所述高半胱氨酸脫硫酶降解高半胱氨酸產生的α-丁酮酸轉變成α-羥基丁酸并伴隨著NAD+釋放，以合適的方式測定所述的NAD+釋放。
現在將以下面非限制性實施例的方式進一步描述本發明。
實施例1設計用于克隆Trichomonas vaginalis高半胱氨酸脫硫酶的引物圖3顯示了來自人，大鼠和酵母的胱硫醚γ-裂解酶(分別參見Lu等，1992,Erickson等，1990和Ono等，1992)的多蛋白質序列對比。加黑的是選擇用于設計簡并寡核苷酸以用作聚合酶鏈式反應(PCR)的同源區域。選擇用于設計5’寡核苷酸引物的第一個同源區域是在不同的胱硫醚γ-裂解酶分子間序列高度同源的區域(V163-N170)。選擇用于設計3’引物的第二個區域是吡哆醛5’-磷酸(PLP)結合結構域(A222-G228)。根據這些同源區域設計的簡并寡核苷酸序列在圖4中表示。為了便于克隆，將酶HindⅢ和XhoⅠ的選擇性位點分別標記到兩個簡并寡核苷酸的末端。這兩個寡核苷酸命名為Cyst5’和Cyst3’。Cyst5’有31個核苷酸長且含有3個肌苷(Ⅰ),Cyst3’有28個核苷酸長且含有兩個肌苷殘基。在多個可能含有四重簡并性的位置導入肌苷以減少所得的合成寡核苷酸庫。按照標準方案使用應用生物系統DNA合成儀合成該寡核苷酸。
實施例2使用簡并寡核苷酸的PCRRNA分離陰道毛滴蟲·的克隆細胞系(G3)按Lockwood等(1984)的以前所述在改良的Diamond’s培養基中生長。在生長晚期(1-2×106/ml)收獲(4℃下以2300g離心15分鐘)細胞并在0.25M蔗糖中洗滌兩次。使用NucleonⅡ試劑盒(Scotlab,Coatbridge,Scotland)分離DNA。
使用可從商業途徑獲得的TRlZOL(RTM)試劑(可從Gibco,Paisley,Scotland獲得)以單一步驟從陰道毛滴蟲分離總RNA,根據廠家說明書該試劑是酚和異硫氰酸胍的單相溶液。
從總RNA分離Poly[A]+RNA用作cDNA合成的模板。Poly[A]+RNA使用Poly[A]+快速柱(可從Stragene,LaJolla,California，美國獲得)按照廠商說明書分離。
來自陰道毛滴蟲的1微克Poly[A]+RNA與逆轉錄酶一起按照Sambrook等(1989)所述的方法用于合成第一鏈陰道毛滴蟲cDNA。然后將cDNA用作帶有簡并寡核苷酸的PCR的模板。
PCR的條件如下起始在94℃變性4分鐘，接著進行30輪由94℃1分鐘，42℃1分鐘和72℃1分鐘組成的擴增循環，隨后在72℃5分鐘進行最后的延伸循環。部分反應物與合適的對照反應物一起在瓊脂糖凝膠(1.5％)上電泳。染色瓊脂糖凝膠后觀察到兩個PCR產物，一個大小為大約200堿基對(bp)(下面的帶片斷)，第二個大小為大約250bp(上面的帶片斷)。
為了獲得足夠的材料用于克隆，進一步進行了相同的PCR。
實施例3克隆擴增的PCR產物將來自幾個PCR反應的材料(大約1μgDNA)合并在一起并對PCR擴增的DNA進行酚/氯仿提取，乙醇沉淀且重懸于水中以去掉污染的核苷酸和Taq聚合酶。然后用HindⅢ和XhoⅠ限制性酶(其限制性酶切位點分別經過將其包含在Cyst 5’和Cyst 3’簡并寡核苷酸的未端已改造到擴增的DNA末端)完成對擴增的DNA的限制以產生有利于定向克隆的“粘性末端”。經過在2％TAE瓊脂糖凝膠上電泳，隨后用溴化乙錠染色并在長波紫外光下觀察來進一步純化DNA。使用干凈的解剖刀片從凝膠上切下感興趣的擴增帶(上面和下面的帶產物)，使用可從商業途徑獲得的SpinX柱(可從Costar,Cambridge,MA,USA獲得)按照廠商說明書從瓊脂糖凝膠片洗脫DNA。然后從用簡并引物經PCR產生的限制性酶切且純化的DNA(單獨的上面帶和下面帶產物和兩者的混合)與預先也用HindⅢ和XhoⅠ限制性消化的pBluescript(可從Stragene,La Jolla,California，美國獲得)混合，并通過2％TAE瓊脂糖凝膠純化并使用spinX柱洗脫，如上所述。pBluescript和大約200和250bp的擴增的PCR片斷以200ng插入片斷加200ng載體的量使用Amersham連接試劑盒(可從Amersham,Little Chalfort,Bucks,UK獲得)按照廠商說明書進行連接。
然后將連接反應物用于轉化超感受態XL1 Blue大腸桿菌細胞(可從Stragene,La Jolla,California，美國獲得)。大約30至40ng連接的DNA用于轉化感受態細菌細胞。轉化混合物涂布在含有LB amp,X-gal,IPTC的平板上37℃培養過夜。使用Promega(Promega,Madison,Wisconsin,USA)的Wizard質粒少量制備程序從白色細菌轉化子分離質粒DNA并進行選擇限制性分析以證實是否成功地將擴增的DNA克隆進了pBluescript質粒。
對含有克隆的PCR產物的轉化子進行測序并隨后分析以確定是否已從陰道毛滴蟲cDNA擴增了真正的胱硫醚γ-裂解酶同源物片斷。
實施例4分離全長的陰道毛滴蟲高半胱氨酸脫硫酶基因使用兩個PCR克隆(命名為cysta2和cysta16)從陰道毛滴蟲λZAPllcDNA文庫(Mallinson,D.J,Lockwood,B.C.,Coombs,G.H.,North,M,J.(1994)，來自病原體原生動物Trichomonasvaginalis四個半胱氨酸蛋白酶基因的鑒定和分子克隆。普通微生物學雜志140 2725-2735)分離相應的全長基因。按下列程序篩選出總共100,000個cDNA克隆。將100,000個噬菌體與宿主細胞大腸桿菌XL1Blue一起涂布在L-頂級瓊脂糖上，使噬菌體在37℃下繁殖直到它們在菌苔中剛好互相接觸。然后經過印跡到Hybond N尼龍濾紙(可從Amersham,Little Chalfont,Bucks,UK獲得)上轉移噬斑。
原位變性噬菌體DNA且隨后與用隨機引物放射性標記的cysta2或cysta16的200堿基對的高半胱氨酸脫硫酶片斷雜交。
使用高度嚴格條件在0.1×SSC/0.1％SDS中65℃下1小時對cDNA文庫的初次篩選揭示了有25個噬斑與cysta2探針雜交，而18個與cysta16探針雜交。將顯示雜交陽性噬斑的放射自顯影膠片與含有噬菌體的平板并排以取出含有陽性噬菌體的瓊脂糖塊。將瓊脂糖塊放入4℃的SM緩沖液和痕量氯仿中且使噬菌體失活過夜。
為了鑒定在高度嚴格條件下與cysta2或cysta16中任何一個的200堿基對放射性探針雜交的單個噬斑，進行了第二輪噬菌體純化。
實施例5分析Cysta2和Cysta16雜交克隆與Cysta2探針雜交的兩個λ克隆和與Cysta16探針雜交的5個λ克隆可使用F1輔助噬菌體機制(按照Stragene,La Jolla,California，美國廠商說明書的方案)直接拯救進pBluescript。隨后經過限制性酶切分析來分析拯救的質粒以測定克隆的插入DNA的大小。
作為對用Cysta2或Cysta16探針分離的質粒進行限制性分析的結果，選擇了兩個克隆用于全部測序，一個是Cysta2雜交克隆(ctlα，后來重新命名為mgl1)，另一個是Cysta16雜交克隆(ctiβ，隨后重新命名為mgl2)。選擇這兩個克隆是因為它們具有最大的插入片斷(大小大約為1.2到1.3千堿基)且據認為其大小足以編碼陰道毛滴蟲高半胱氨酸脫硫酶基因的全長拷貝。
實施例6兩個陰道毛滴蟲高半胱氨酸脫硫酶基因的測序對兩個陰道毛滴蟲高半胱氨酸脫硫酶基因中的每一個進行限制性作圖以便亞克隆更小的片斷幫助獲得各基因的全部核苷酸序列。
使用Sequenase(RTM)快速變性質粒測序試劑盒(可從Amersham,Little Chalfont,Bucks,UK獲得)與T7和T3引物(可從Stragene,La Jolla,California，美國獲得)按照廠商說明書完成對兩個克隆和其各自的亞克隆的測序。測定了第一個克隆(mgl1)的全部核苷酸序列和其推定的氨基酸序列以及第二個克隆(mgl2)的全部核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
為了獲得mgl1和mgl2的5’非翻譯區(UTRs)并證實起始密碼子，使用可從商業途徑獲得的5’RACE試劑盒(可從Gibco,Paisley,Scotland獲得)按照廠商說明書進行cDNA末端的5’逆轉錄酶快速擴增(RT-RACE)。獲得的mgl1和mgl2 RACE產物大小均為大約250個堿基對。按照廠商說明書將mgl1和mgl2 RACE產物直接克隆進ligATor試劑盒(可從R&D Systems,Minneapolis,USA獲得)的pTAg載體中。該系統采用的特征是在Taq聚合酶存在下進行的PCR具有標記到任意擴增片斷末端上的5’腺苷懸垂。該系統有助于將PCR產物克隆進具有互補胸苷殘基懸垂的載體中。
對轉化子的限制性分析揭示5’RACE產物已克隆進了pTAg載體。使用可從商業途徑獲得的-20引物和M13逆向引物在兩條鏈上進行RACE克隆的測序。
對mgl1的5’RACE產物測序揭示了5’UTR極短(13個核苷酸長)，但證實了從cDNA序列鑒定的起始ATG密碼子。
對于mgl2獲得了兩個獨立的5’RACE產物，兩個克隆都具有從cDNA文庫分離的基因拷貝所缺少的ATG起始密碼子。更長的mgl2RACE克隆鑒定了一個大約14個核苷酸長的短5’UTR區域。
圖1和2顯示了mgl1和mgl2的5’UTRs以及mgl1和mgl2各自完整的cDNA序列和推定的氨基酸序列。序列對比分析(見表1)顯示推定的MGL1和MGL2與以前測序的胱硫醚γ-裂解酶具有相當低水平的序列相同性且不可能克隆出陰道毛滴蟲胱硫醚γ-裂解酶。該發現證實了克隆的基因產物不具有胱硫醚γ-裂解酶活性(見表2)。
實施例7組氨酸標記的高半胱氨酸脫硫酶融合蛋白質的克隆和表達QlAexpress系統(Qiagen,La Jolla,California,USA)用于MGL1和MGL2多肽的表達和純化。將mgl1和mgl2基因克隆進pQE載體，它在表達的蛋白質N或C末端編碼6-組氨酸標記。然后使用Ni2+-NTA樹脂親和純化6-組氨酸標記的蛋白質(詳情參見QlAexpress手冊)。
mgl1的克隆mgl1 cDNA克隆在質粒pBluescript中維持。初步的序列分析表明陰道毛滴蟲mgl1 cDNA以與預期相反的方向克隆進了pBluescript，因此從pBluescript直接亞克隆mgl1到pQE載體是不可能的。為了克服pBluescript中mgl1 cDNA的方向問題，采用PCR克隆方案能將cDNA克隆進合適的pQE載體。
寡核苷酸引物設計成mgl1 cDNA的5’和3’端，它們分別包括限制性核酸內切酶位點NcoⅠ和BgⅢ。通過PCR擴增方法，將這兩個限制性位點改造到mgl1 DNA的末端，其存在有利于將DNA克隆進NcoⅠ和BgⅢ限制的pQE載體。兩個引物的核苷酸序列在圖5中顯示。
選擇pQE60，一種ATG構建體用作載體，將mgl1 DNA克隆進該載體。ATG構建體使得表達的蛋白質用真正的ATG密碼子開始。mgl1cDNA編碼起始甲硫氨酸，且因此認為適合于克隆進該具體的pQE載體(詳情參見QlAexpress手冊)。
含有mgl1 cDNA的pBluescript使用BamHⅠ線性化，將線性化的DNA用作模板與圖5中列出的兩個寡核苷酸一起用于PCR。PCR混合物的成分在下面列出。
1μl(10ng/μl)pBluescript/mgl1 BamHⅠ線性化的模板
5μl(100ng/μl)5’NcoⅠ引物5μl(100ng/μl)3’BgⅢ引物5μl10×pfu緩沖液(Stragene,La Jolla,California，美國)2.5μl各5mM的dATP,dGTP,dCTP,dTTP1μl pfu聚合酶(可從Stragene,La Jolla,California，美國獲得的Taq的校正型)30.5μl水使用下列條件進行mgl1 DNA的擴增94℃下5分鐘，隨后是如下的30次循環94℃下1分鐘42℃下1分鐘72℃下1分鐘，最后是如下的一次延伸反應72℃下5分鐘經PCR擴增后，使用Magic PCR Wizard preps(Promega,Madison,Wisconsin,USA)按照廠商說明書從mgl1 DNA中去掉污染的核苷酸和聚合酶。純化的mgl1 DNA在其5’端現在具有一個Ncol位點在其3’端具有一個BgⅢ位點，與pQE60載體一樣用這兩種酶限制性酶切該DNA。將限制性酶切的pQE載體和mgl1 DNA連接起來并將含有該插入片斷的完整載體轉化進M15[pREP4]細胞，詳情參見QlAexpress手冊。然后按照QlAexpress手冊將含有mgl1 DNA的pQE60質粒用于試驗重組蛋白質的表達。
mgl2的克隆將包含在pBluescript中的mgl2 cDNA直接亞克隆進pQE30。含有mgl2 DNA的pBluescript用BamHl和Xhol限制性酶切。將該限制性插入片斷與已用BamHl和Sall限制性酶切的pQE30載體連接。將完整的pQE30載體和插入片斷轉化進M15 pREP4細胞。然后將含有mgl2 DNA的pQE30載體按照QlAexpress手冊用于試驗重組蛋白質的表達。
將含有mgl1或mgl2的pQE質粒轉化進大腸桿菌菌株M15[pREP4]且獲得單個的菌落。將單個菌落接種進含有100ug/ml氨芐青霉素和25ug/ml卡那霉素的20ml LB培養基在37℃生長過夜。
然后用全部過夜培養物接種1升LB培養基，培養物在37℃下生長直到A750達到0.8(大約2-3小時)。然后加入IPTG至終濃度為1mM并在37℃使其繼續生長21/2小時。
離心收獲細胞并在-70℃冷藏。
按照Qiagen QlAexpress方案的方案5，使用諸如Ni-NTAsuperfloW的金屬螯合樹脂以FPLC純化表達的蛋白質。
經SDS-PAGE分析以FPLC獲得的含有蛋白質的餾份，混合那些具有重組高半胱氨酸脫硫酶的餾份并在-20℃貯存前用含有10％甘油的超聲處理緩沖液(50mM磷酸鈉pH8.0,300mM NaCl)透析過夜。
實施例8用于純化重組陰道毛滴蟲高半胱氨酸脫硫酶的改良方法下面詳細描述的方法包含細菌的生長，重組酶的表達和FPLC/Ni-NTA純化。所有緩沖液，培養基等的詳情在附錄中給出。載體，細菌宿主菌株和方法的進一步詳情可參考QlAGEN蛋白質表達手冊找到。
第1天將5μl M15[pREP4]細胞(含有pQE30/陰道毛滴蟲cDNA)的貯備甘油種子劃線到含有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上。37℃生長過夜。[在LB平板上的菌落可在4℃貯存達到2周]。
第2天在500ml燒瓶中用單個菌落接種50ml含有氨芐青霉素和卡那霉素(終濃度如上)的LB培養基。37℃下在有軌搖床中以-200rpm搖動生長過夜。
第3天在兩升燒瓶中，用50ml過夜培養物接種400ml加有氨芐青霉素和卡那霉素的新鮮LB培養基。
-37℃下搖動(200rpm)生長培養物1.75小時。經過加入無菌IPTG(以得到0.2mM的終濃度)并在37℃下再搖動生長2.25小時誘導細胞表達高半胱氨酸脫硫酶。
-經過在4℃下以8000g離心10-15分鐘沉淀細胞。
-將沉淀重懸于5ml超聲緩沖液中并轉移進15ml Falcon試管中，加入吡哆醛5’磷酸(PLP)至終濃度為20μM。在-70℃冷凍重懸的細胞直到純化需要。為了檢測進行的表達，取出200μl細菌培養物樣品，取出時間為a)剛好在加入IPTG前和b)在加入IPTG后在2.25小時誘導期間結束時。沉淀(1300rpm/5分鐘)細胞，重懸于80μl Laemmli’s樣品緩沖液中，煮沸5分鐘，取10μl等分試樣在12.5％SDS-PAGE凝膠上電泳以證實IPTG誘導后高半胱氨酸脫硫酶的表達。[作為選擇可取樣更大體積的未誘導和誘導的細胞(1ml)，經過超聲處理裂解并進行高半胱氨酸脫硫酶活性測定]。
用超聲處理緩沖液平衡Ni-NTA樹脂柱過夜。一般來說可使用8ml填充體積的樹脂/柱。
第4天在Ni-NTA樹脂上以FPLC親和純化His-標記的酶。
1．從-70℃冷庫中取出冷凍細胞，經過將試管放入裝有冷水的燒杯中復蘇。
2．經超聲處理裂解細胞。
3．將超聲處理的材料轉移進50ml離心試管中并在4℃以10,000g離心30分鐘。特別是當首先使用超聲儀時，經過以SDS-PAGE比較沉淀和上清餾份對于檢查細菌是否充分裂解是有用的。高半胱氨酸脫硫酶是高度可溶的且95％應在可溶餾份中。
4．離心后，上清[含有可溶性酶](～5-6ml總體積)通過0.22μmMillipore濾器直接過濾進附著在FPLC導入口(注射孔)的Luer-lock注射器中并開始純化。
注意在包括Waters 600S控制器和Waters 600S泵的WatersFPLC系統中進行所列的純化程序。基本步驟是樣品應用(當導入口轉向‘注射’檔時從注射器自動吸取樣品到柱上)。實際上可見該酶作為極亮的黃色帶結合到NT-NTA樹脂上。
1．用超聲緩沖液短暫洗滌2．用洗滌緩沖液洗滌更長時間3．使用線性梯度0-500mM咪唑[100％先滌緩沖液至100％洗脫緩沖液(inc.500mM咪唑)]進行酶洗脫注意FPLC運行條件的全部細節(流速，洗滌時間，梯度等)參見附錄。
5．在280nm下以紫外檢測器持續監測柱流出物的蛋白質濃度，收集全過程中的餾份。
6．合并含有重組酶的餾份(容易以其亮黃綠色鑒定)并在4℃下用1升透析緩沖液透析過夜(如果需要可更換幾次緩沖液)(以去掉咪唑)。
7．取少量(～50μl)透析酶制品的樣品使用BCA方法(Pierce化學公司BCA[Bicinchoninic acid]試劑盒)測定蛋白質含量。剩余制品與穩定緩沖液按1∶1混合，以1ml的等分試樣貯存于-20℃。
附錄所需的試劑和緩沖液Luria-Bertani培養基(LB培養基)在1升中在950ml水中溶解下列成分細菌用胰蛋白胨 10g細菌用酵母抽提物 5gNaCl 10g將pH調節到7.0(如果需要)。加蒸餾水至1升。以15 1b/平方英寸高壓滅菌20分鐘(對于LB瓊脂，每升含有15g細菌用瓊脂)。
抗生素氨芐青霉素(Sigma A-9518)(在蒸餾水中的100mg/ml貯液)-通過0.2μm Millipore濾器過濾滅菌，以1ml的等分試樣貯存于-20℃。
卡那霉素(Sigma K-4000)(在蒸餾水中的25mg/ml貯液)-按上述滅菌和貯存。
IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖苷；Gibco BRL 15529-019)1M貯液(在蒸餾水中)-濾器滅菌(0.2μm濾器)，以1ml的等分試樣貯存于-20℃。
吡哆醛5’-磷酸(PLP；Sigma P-9255)在蒸餾水中的1M貯液。每次新鮮配制(用于加入懸浮的細胞中)。
Ni-NTA Superflow樹脂(QlAGEN 30430)超聲處理緩沖液50mM磷酸鈉緩沖液，pH8.0,300mM NaCl1M Na2HPO4:46.6ml1M NaH2PO4:3.4ml17.53g NaCl加蒸餾水至1升洗滌緩沖液50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.0,300mM NaCl.10％甘油1M Na2HPO4:6ml1M NaH2PO4:44ml17.53g NaCl100ml甘油加蒸餾水至1升洗脫緩沖液含有500mM咪唑的洗滌緩沖液將17.02g咪唑溶于500ml洗滌緩沖液中。
(咪唑-Sigma l-0125)透析緩沖液100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5,300mM,20％甘油。20μM PLP,15μM二硫蘇糖醇1M Na2HPO4:30.35ml1M NaH2PO4:69.65ml17.53g NaCl200ml甘油2ml 10mM PLP貯液15μl 1M二硫蘇糖醇貯液(二硫蘇糖醇-Sigma D-9779)穩定緩沖液100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5,80％甘油，40μMPLP.30μMDTT在10ml中1.96ml 100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5,8ml甘油，40μl 10mM PLP,3μl 100mM DTT疊氮鈉(Sigma S-2002):0.05％溶液-用后泵到Ni-NTA柱上以防止細菌生長(純化期間將柱貯存在4℃的疊氮化物中)。
在蒸餾水中制備10％(w/v)的貯液(4℃貯存)。稀釋得到0.05％的工作濃度。
在FPLC上使用的所有緩沖液用前應抽氣。使用Millipore真空濾器單元通過0.2μm濾膜過濾緩沖液實現抽氣。
用于監測純化的高半胱氨酸脫硫酶活性測定高半胱氨酸→2-丁酮酸+NH3+H2S該試驗測量H2S的產生；H2S被醋酸鉛‘捕獲’形成膠體硫化鉛(一種深棕色化合物)，它在360nm處具有最大吸光度。
試劑測定緩沖液100mM咪唑緩沖液，pH6.5D,L-高半胱氨酸(Sigma H-4628)；貯液100mM(在測定緩沖液中制備)。測定中終濃度=40mM(400μl貯液)醋酸鉛(BDH 10142)；貯液3.3mM(在蒸餾水中制備)。測定中的終濃度=0.33mM(100μl貯液)重組酶作為起點，使用10μl 100×稀釋度的純酶制品。(在100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5中稀釋酶制品)用測定緩沖液將測定混合物的終體積調節為1.0ml。
進行對照測定的混合物1)沒有酶，2)沒有底物。
計算酶活性使用硫化鉛的摩爾消光系數為5205M-1cm-1。
abs(expd)變化-abs(control)變化×106時間X蛋白質濃度×5205M-1cm-1×103=μ摩爾分鐘-1mg prot-1純化重組陰道毛滴蟲MGL2的詳細FPLC程序梯度時間 流速 ％A ％B ％C1．(使用0-30分鐘的 0.2 100 00樣品)2．30 0.5 100 003．90 0.50 100 04．150 0.50 100 05．250 0.500 100緩沖液A=超聲處理緩沖液B=洗滌緩沖液C=洗脫緩沖液實施例9高半胱氨酸測定測定Ⅰ使用根據前面實施例在66mM磷酸鈉緩沖液pH7.5,0.33mM醋酸鉛中制備的重組高半胱氨酸脫硫酶測量高半胱氨酸水平。
高半胱氨酸脫硫酶催化高半胱氨酸轉變為α-丁酮酸，氨和硫化氫。硫化氫與醋酸鉛反應產生硫化鉛，硫化鉛可在360nm下以分光光度法檢測(摩爾消光系數=5205M-1cm-1)。
測定試劑0.1M磷酸鈉0.5ml1mM醋酸鉛 0.5ml100μM至10mM高半胱氨酸0.49ml(33μM-3.3mM終濃度)高半胱氨酸脫硫酶(6μg/ml) 10μl-最后加入測定試劑在20℃保溫0至120分鐘使其顯色。然后經過在360nm下測量吸光度來測定高半胱氨酸水平。
結果高半胱氨酸濃度 吸光度改變(40分鐘)3.3mM 1.066333μM0.79033μM 0.06測定Ⅱ測定原理二硫蘇糖醇(DTT)開始用于將高胱氨酸降解為高半胱氨酸并釋放結合高胱氨酸(高半胱氨酸)的蛋白質。然后高半胱氨酸在高半胱氨酸脫硫酶的作用下降解為α-丁酮酸，氨和硫化氫。然后利用特異性乳酸脫氫酶同工酶將α-丁酮酸轉變為α-羥基丁酸并伴隨著釋放NAD+。經過使用HCL降低pH去掉任何NADH后，NAD進入含有乙醇，乙醇脫氫酶，心肌黃酶和四氮唑鹽的循環機制產生可經光度法測量的有色產物。顏色加深相應于樣品中高半胱氨酸的濃度。
測定程序步驟1將100μl樣品(例如，檸檬酸鹽血漿)與500μl 0.1 mol/lHEPES,0.1mmol/l NADH,20,000μmnoles/min/l高半胱氨酸脫硫酶，50,000U/l乳酸脫氫酶和0.05mol/l二硫蘇糖醇，pH8.0混合進杯中37℃培養20分鐘。
步驟2加入500ul 1mol/l HCl,0.55％(v/v)NonidetP40,1×10-4mol/l氮蘭四唑(NBT)。37℃培養5分鐘。
步驟3加入500ul三(羥甲基)氨基甲烷(TRlS),1mol/l乙醇，隨后加入50ul 20,000U/l乙醇脫氫酶，1000U/l心肌黃酶。
加入含有乙醇脫氫酶的試劑后測量5分鐘在527nm處吸光度的增加。
測定效果ⅰ)標準曲線典型的標準曲線在下表中顯示
ⅱ)敏感性可清楚檢測的濃度為＜5μmol/l高半胱氨酸。
ⅲ)回收率將高半胱氨酸摻加進血漿并測定回收率
ⅳ)直線性下表說明了反應的直線性
使用上述量的鹽水稀釋病人樣品(血漿)并測量信號，與理論信號比較。ⅴ)交叉反應性下表說明了與甲硫氨酸和半胱氨酸的測定交叉反應性
將高半胱氨酸，甲硫氨酸和半胱氨酸摻加進血漿并測量信號。觀察到與半胱氨酸或甲硫氨酸的交叉反應性達不到200μmol/l的水平。
實施例10定點誘變重組MGL1和MGL2使用以PCR為基礎的QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)實現突變rMGL1(C113G)和rMGL2(C116G)的生產。雙鏈mgl1和mgl2 cDNA(以p-Bluescript或pQE30/60表達載體)用作模板。使用一對如下的寡核苷酸引物進行誘變，該引物互補于cDNA克隆的相反鏈，分別含點突變以便將各自的半胱氨酸密碼子(TGC)轉變成甘氨酸密碼子(GGC):1)5’-TGCCTTTATGGCGGCACACATGCTCTCT-3’；2)5’-AAGAGAGCATGTGTGCCGCCATAAAGG-3’。對突變的cDNA進行PCR介導的擴增后，使用Dpn-1核酸內切酶選擇性消化起始模板cDNA/載體。經過使用基因特異性寡核苷酸引物在兩條鏈上測序可鑒定含有所需突變的cDNA克隆。將在p-Bluescript中突變的cDNA在表達前亞克隆進pQE載體。按前面所述進行重組突變的MGL1和MGL2的生產和純化。
實施例11重組MGL1,MGL2，和突變的MGL1(C113G)和MGL2(C116G)的酶學研究以前從陰道毛滴蟲純化的甲硫氨酸γ-裂解酶對包括甲硫氨酸，高半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的許多底物具有活性，但對胱硫醚沒有活性(Lockwood和Coombs,1991)。為了評價MGL1和MGL2以及純化的天然甲硫氨酸γ-裂解酶之間的相似性，分析了重組酶的酶活性(表2)。發現rMGL1和rMGL2對高半胱氨酸具有相當高的活性且還發現它們迅速降解代謝甲硫氨酸，半胱氨酸和鄰乙酰基絲氨酸。兩種重組酶不能利用胱硫醚作為底物。還測定了兩種重組蛋白質對高半胱氨酸和半胱氨酸的動力學參數(表3)。rMGL1對兩種底物的表觀Km比rMGL2更高，對甲硫氨酸的差異最大。
生產并純化突變的rMGL1(C113G)和rMGL2(C116G)后，比較其酶活性與相應的野生型酶的酶活性(表2)。在最佳條件下rMGL1(C113G)對所有底物的活性比野生型rMGL1低得多。rMGL2(C116G)對高半胱氨酸和甲硫氨酸的活性也比野生型rMGL2更低，但令人驚奇的是突變酶對半胱氨酸和鄰乙酰-L-絲氨酸的活性增加。兩種突變酶都不表現出對胱硫醚的活性。
針對突變的和野生型酶在對高半胱氨酸和半胱氨酸的代謝方面進行了比較動力學分析(表3)。rMGL1(C113G)與野生型rMGL1相比Km值略高且Vmax值顯著更低表明該突變酶的底物結合效率下降。相反，rMGL2(C116G)對半胱氨酸的表觀Km比rMGL2低得多，且這與突變酶對該底物的活性增加(更高的Vmax)相關。意想不到的是rMGL2(C116G)對高半胱氨酸的Km相對于野生型酶下降了許多，盡管突變酶對該底物的Vmax明顯更低。
表2．突變的和野生型重組蛋白質的酶活性比較底物 rMGL1 rMGL1 突變型/野生型(C113G) (％)高半胱氨酸 370±11(8) 34.5±3.2(14) 9.3甲硫氨酸 10.4±0.31(4) 0.79±0.17(8) 7.6半胱氨酸 6.02±0.63(8) 2.330±0.35(8) 38.7鄰乙酰基-L-絲氨 3.74±0.1(4) 1.83±0.12(8) 48.9酸胱硫醚 N.D.(4)N.D.(8) -底物rMGL2 rMGL2 突變型/野生型(C116G)(％)高半胱氨酸 128±22(14)27.0±5.8(19)21.2甲硫氨酸 0.67±0.18(11) 0.15±0.05(14) 22.4半胱氨酸 1.06±0.42(16) 2.31±0.71(17) 217.9鄰乙酰基-L-絲氨 1.51±0.49(12) 2.15±0.17(14) 142.4酸胱硫醚N.D. (12) N.D. (8) -活性(以μmol分鐘-1mg蛋白質-1表示)是來自括號中所給實驗號的平均值±S.D.。經過使用標準方法監測硫化氫生產測定了對高半胱氨酸和半胱氨酸的活性；經過標準α-酮酸生產測定測量了對其它底物的活性。N.D.，活性檢測不到(＜0.04μmol分鐘-1mg蛋白質-1)。表3野生型和突變型rMGL1和rMGL2在對高半胱氨酸和半胱氨酸代謝方面的動力學參數高半胱氨酸 半胱氨酸KM1Vmax2Km1Vmax2rMGL112.2 2568.5 14.9rMGL115.2 42 9.7 4.6(C113G)rMGL237.7 13222.32.4rMGL26.2 53 3.6 4.8(C116G)使用了至少10種不同的底物濃度，至少重復三次測定。
1mM,2μmol分鐘-1mg蛋白質-1。
參考文獻1.Ueland,P.M.(1992)血漿高半胱氨酸和心血管疾病。在動脈粥樣硬化心血管疾病(Francis,R.N.編輯)，第183-230頁。MarcelDecker，紐約2．Kluijtmans,L.A.J.等，(1996)輕微高半胱氨酸過多血癥的分子遺傳學分析亞甲基四氫葉酸還原酶基因中的共同突變是心血管疾病的遺傳致病因素。美國人類遺傳學雜志，58,35。
3．Cravo,M.L.等，(1996)慢性醇中毒中的高半胱氨酸過多血癥與葉酸，維生素B-12和維生素B-6狀態相關。美國臨床營養學雜志63,220。
4．Bostom,A.G.等，(1996)透析病人中高半胱氨酸過多血癥的高劑量B-維生素治療，國際腎研究49,147。
5．Steegers-Theunissen,R.P.M.(1992)高半胱氨酸過多血癥和經常性自發流產或胎盤早期脫離。Lancent339,1122。
6．Mudd,S.H.(1989)轉磺基作用疾病。在遺傳疾病的代謝基礎(Scriver,C.R.編輯)第693-734頁。McGraw-Hill，紐約
7．te Poele-Pothoff,M.T.W.B.等(1995)測定血漿中總高半胱氨酸的三種不同的方法。臨床生物化學年鑒32,218。
8．Hori,H.,Takabayashi,K.,Orvis,L.,Carson,D.A.,Nobobri,T.(1996)Pseudomonas putida L-甲硫氨酸-α-脫氨基-γ-巰基甲烷-裂解酶。癌癥研究56No.9第2116-2122頁。
9．Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)分子克隆，實驗室手冊(第2版)。冷泉港實驗室出版。
10．Ono,B.l.,Tanaka,K.,Naito,K.,Heike,C.,Shinoda,S.,Yamamoto,S.,Ohmori,S.,Oshima,T.和Toh-E,A.(1992)啤酒糖酵母CYS3基因的克隆和鑒定。細菌學雜志174,3339-3347。
11．Lu,Y.,O’Dowd,B.F.,Orrego,H．和lsrael,Y.(1992)編碼胱硫醚γ-裂解酶的人肝臟cDNA的克隆和核苷酸序列。生物化學和生物物理研究通訊189,749-758。
12．Lockwood,B.C．和Coombs,G.H.(1991)Trichomonasvaginalis甲硫氨酸γ-裂解酶的純化和鑒定。生物化學雜志279,675-682。
13．Erickson.P.F.,Maxwell,l.H.,Su,L.J.,Baumann,M．和Glode,L.M.(1990)胱硫醚γ-裂解酶的cDNA序列和推定的氨基酸序列與相關大腸桿菌酶的比較。生物化學雜志269,335-340。
14．Lockwood,B.C.,North,M.J．和Coombs,G.H.(1984)Trichomonas vaginalis,Tritrichomonas foetus,TrichomitusBatrachorum比較蛋白裂解活性。實驗寄生蟲學58,245-253。
權利要求
1．一種測定樣品中的高半胱氨酸的方法，包括下列步驟a)將樣品與能降解高半胱氨酸的酶接觸，和b)測定由所述酶對高半胱氨酸進行酶促降解所形成的任何反應產物。
2．根據權利要求1的測定高半胱氨酸的方法，其中該酶是高半胱氨酸脫硫酶。
3．根據權利要求2的測定高半胱氨酸的方法，其中高半胱氨酸脫硫酶是重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶或其表現出高半胱氨酸脫硫酶活性的功能活性衍生物。
4．根據權利要求3的測定高半胱氨酸的方法，其中重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶是基本上如圖1,2,6或7所示的高半胱氨酸脫硫酶。
5．根據權利要求1至4中任意一項的測定高半胱氨酸的方法，其中一種所述的反應產物是α-丁酮酸且測定α-丁酮酸的水平。
6．根據權利要求1至4中任意一項的測定高半胱氨酸的方法，其中一種所述的反應產物是硫化氫且測定硫化氫的水平。
7．根據權利要求1至4中任意一項的測定高半胱氨酸的方法，其中一種所述的反應產物是氨且測定氨的水平。
8．根據權利要求5的測定高半胱氨酸的方法，其中經過將α-丁酮酸與NADH和乳酸脫氫酶或丙酮酸脫氫酶反應以便將α-丁酮酸轉變為α-羥基丁酸且產生NAD+和測定NAD+水平來測定α-丁酮酸的水平。
9．根據權利要求1至8中任意一項的測定高半胱氨酸的方法，其中所述的方法靈敏到足以檢測＜5μmol/l高半胱氨酸的濃度。
10．一種測定可降解為高半胱氨酸的分析物的方法，其中包括首先將分析物降解為高半胱氨酸并然后以任意一項前面權利要求的方法估測所產生的高半胱氨酸。
11．根據權利要求10的方法，其中分析物是高半胱氨酸或甲硫氨酸。
12．一種測定樣品中的甲硫氨酸，半胱氨酸或鄰乙酰基-L-絲氨酸的方法，包括下列步驟a)將樣品與重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶或其能降解甲硫氨酸，半胱氨酸或鄰乙酰基-L-絲氨酸的功能活性衍生物接觸，和b)測定由甲硫氨酸，半胱氨酸或鄰乙酰基-L-絲氨酸的酶降解所形成的任何反應產物。
13．一種用于體外測定樣品中高半胱氨酸水平的診斷試劑盒，其中該試劑盒包括a)一種能降解高半胱氨酸的酶，和b)能測定高半胱氨酸被該酶降解產生的反應產物的工具。
14．根據權利要求13的用于體外測定樣品中高半胱氨酸水平的診斷試劑盒，其中該酶是高半胱氨酸脫硫酶。
15．根據權利要求14的用于體外測定樣品中高半胱氨酸水平的診斷試劑盒，其中高半胱氨酸脫硫酶是重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶或其表現出高半胱氨酸脫硫酶活性的功能活性衍生物。
16．根據權利要求15的用于體外測定樣品中高半胱氨酸水平的診斷試劑盒，其中重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶是基本上如圖1,2,6或7所示的高半胱氨酸脫硫酶。
17．編碼原生動物高半胱氨酸脫硫酶的多核苷酸片斷。
18．根據權利要求17的多核苷酸片斷，其中多核苷酸片斷是脫氧核糖核酸(DNA)片斷。
19．根據權利要求17或18中任意一項的多核苷酸片斷，其特征在于所述的多核苷酸片斷編碼具有基本上如圖1,2,6或7所示的氨基酸序列的多肽或其功能活性衍生物。
20．根據權利要求17的多核苷酸片斷，其特征在于它是基本上相同于圖1,2,6或7所示的多核苷酸片斷或其功能活性衍生物的多核苷酸片斷。
21．一種重組核酸分子，包含根據權利要求17-20中任意一項的多核苷酸片斷。
22．根據權利要求21的重組核酸分子，其特征在于重組核酸分子含有與所述的多核苷酸片斷可操作連接的調控序列，以用于控制所述的多核苷酸片斷的表達。
23．根據權利要求21和22中任意一項的重組核酸分子，其中該重組核酸分子是一種質粒。
24．根據權利要求21和22中任意一項的重組核酸分子，其中該重組核酸分子來自病毒載體。
25．用根據權利要求17至24中任意一項的多核苷酸片斷或重組分子轉化的原核或真核宿主細胞。
26．重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶多肽或其表現出高半胱氨酸脫硫酶活性的功能活性衍生物。
27．圖1,2,6或7所示的重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶的多肽或其功能活性衍生物。
28．一種與根據權利要求26和27中任意一項的多肽或片斷發生免疫反應的抗體。
29．根據權利要求17至20中任意一項的多核苷酸片斷在治療中的應用。
30．根據權利要求21至24中任意一項的重組核酸分子在治療中的應用。
31．根據權利要求26和27中任意一項的重組原生動物高半胱氨酸脫硫酶或其功能活性衍生物在治療中的應用。
32．根據權利要求26和27中任意一項的重組多肽或其功能活性衍生物在生產用于治療的藥物中的應用。
33．根據權利要求26和27中任意一項的重組多肽或其功能活性衍生物在生產用于癌癥治療的藥物中的應用。
34．一種藥用組合物，包含根據權利要求17至20中任意一項的多核苷酸片斷及其藥用上可接受的載體。
35．一種藥用組合物，包含根據權利要求26和27的多肽或其衍生物及其藥用上可接受的載體。
36．根據權利要求26和27中任意一項的重組多肽或其功能活性衍生物在篩選其抑制劑中的應用。
37．根據權利要求26和27中任意一項的重組多肽或其功能活性衍生物在從樣品中去掉高半胱氨酸，甲硫氨酸和/或半胱氨酸中的應用。
38．根據權利要求26和27中任意一項的重組多肽或其功能活性衍生物用于測定酶的存在和催化涉及高半胱氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸作為底物或產物的反應。
全文摘要
本發明涉及使用一種催化高半胱氨酸,半胱氨酸,鄰乙酰－L－絲氨酸和/或甲硫氨酸降解的酶,該酶更具體地說是高半氨酸脫硫酶,來測定生物學樣品中高半胱氨酸,半胱氨酸,鄰乙酰－L－絲氨酸和/或甲硫氨酸水平的測定法,還涉及編碼原生動物高半胱氨酸脫硫酶的多核苷酸片斷,包含該多核苷酸片斷的重組載體,轉化的細胞,原生動物高半胱氨酸脫硫酶多肽和用于醫學或獸醫學的含有重組高半胱氨酸脫硫酶的藥用組合物。
文檔編號G01N33/68GK1231696SQ9719832
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月23日 優先權日1996年8月23日
發明者格雷厄姆·赫伯特·庫伯斯, 杰里米·查爾斯·莫特拉姆, 大衛·約翰·普里特查德, 羅伯特·斯圖爾特·坎貝爾 申請人:格拉斯哥大學校董事會