專利名稱：：用含氨基酸的緩沖液通過毛細管電泳分離蛋白質的方法
技術領域：
：本發明涉及蛋白質電泳領域，而且論述在通過毛細管電泳在蛋白質分離中得到高分辨力的方法。
背景技術：
：分析哺乳動物血清中蛋白質的水平，已被廣泛地用作各種疾病和異常生理狀況的指示手段。例如，低于正常水平的白蛋白是腎臟疾病的征兆，而高濃度的白蛋白則是脫水的特征。類似地，前-β脂蛋白水平的升高可以是慢性酒精中毒或雌激素過多癥的征兆，而β-脂蛋白水平的升高可以是高膽固醇的征兆。蛋白質可方便地通過電泳而分離，板凝膠電泳和毛細管電泳都已被應用。毛細管電泳的好處是，可以分析非常少的樣品，而且由于毛細管中壁表面與體積之比高，電流所產生的熱量可以很快地被散發掉，從而可以在高壓下進行電泳，因而縮短了分離時間。開放式毛細管區帶電泳(其中分離介質是緩沖溶液)特別有用，因為對于每次使用，毛細管可方便地加以調節并注入溶液。一旦施加電場，在毛細管壁表面處的電動勢是蛋白質移動和分離中的主要因素。蛋白質和毛細管壁之間的相互作用可改變這種移動和分離。在高或低pH下進行的分離(這樣會使蛋白質帶凈電荷)可減少蛋白質和毛細管壁之間的相互作用。這種相互作用在用熔凝氧化硅制成的毛細管中特別強，從而造成蛋白質被吸附在毛細管壁上。通過改變壁表面的電荷密度，吸附作用對電滲流會產生影響。電滲流的改變反之會改變遷移時間、峰分辨力和重復性。盡管影響程度更低，但是這些因素也適用于板電泳，尤其是使用薄板電泳時。為了通過抑制蛋白質與毛細管壁或其他包括在分離區帶中的壁之間的相互作用而改善分離的努力，已導致開發出眾多處理方法、添加劑和操作條件。一種技術是使用pH高于樣品蛋白質的等電點的緩沖液，從而賦予蛋白質凈負電荷，將它們從帶負電荷的壁上排斥開。該方法的缺點是蛋白質可能會水解以及發生其他的結構變化。鹽濃度高的強堿性緩沖液也已被用作阻斷蛋白質與壁之間的離子相互作用的手段。然而，高鹽濃度增加了緩沖液的導電性，因而增加了毛細管內熱量產生的速度。另一種方法是涂覆壁以掩飾或中和電勢，而用于該目的的涂料包括聚丙烯酰胺、乙二醇和五氟苯甲酰基。涂覆的壁的缺點有由于重復使用過程中涂層的逐漸破壞而導致重復性低，以及消除了電內滲流分量而導致分析速度的下降。另一種方法是在電泳緩沖液中包含硼酸根離子，以便與糖蛋白的糖部分形成復合物從而中和它們的電荷。使用硼酸根離子可能會使某些蛋白質尤其免疫球蛋白變性，從而形成分開的峰。同樣，硼酸根離子會增加緩沖液的導電性，限制了電場和分離所能到達的速度。發明概述現在發現，通過使用含有氨基酸的堿性電泳緩沖液，可以在沒有蛋白質-壁相互作用的不利特性下，通過毛細管電泳而實現有效的和快速的蛋白質分離。這種緩沖液普遍適用于電泳，其中包括各種幾何結構的電泳池，但是它對于在毛細管中進行的電泳特別適用。含氧化硅材料的毛細管，尤其內部沒有涂覆過的熔凝氧化硅毛細管是優選的。在最佳的使用中，含有氨基酸的緩沖液被用于加入樣品之前毛細管或其他電泳池的預處理，被用作加入樣品時樣品的稀釋緩沖液，以及被用作構成電源和分離區域之間電通路的兩個電極液槽中任一個中的電極緩沖液。氨基酸減少了蛋白質-壁之間的相互作用以及蛋白質-蛋白質之間的相互作用，而且避免了變性的危險。因此，用本發明緩沖液進行的分離可以提供板凝膠電泳所能達到的相同或等價的分離效果，而且精度高、分辨力高、重復性高。本發明的這些和其他特征及優點，通過下列的描述將更明顯。附圖簡述圖1是用本發明緩沖液通過毛細管區帶電泳分析正常血清樣品的電泳圖。圖2a是用本發明緩沖液通過毛細管區帶電泳分析正常血清樣品的電泳圖，其中使用一套不同于圖1的操作條件。圖2b是用本發明范圍之外的緩沖液通過板凝膠電泳分析與圖2a相同的血清樣品的光密度掃描圖。圖3a是用本發明的緩沖液進行的毛細管區帶電泳，分析患單克隆丙種球蛋白病的對象的血清樣品的電泳圖。圖3b是用本發明范圍之外的緩沖液通過板凝膠電泳分析與圖3a相同的血清樣品的光密度掃描圖。圖4a是用本發明的緩沖液進行的毛細管區帶電泳，分析患多克隆丙種球蛋白病的對象的血清樣品的電泳圖。圖4b是用本發明范圍之外的緩沖液通過板凝膠電泳分析與圖4a相同的血清樣品的光密度掃描圖。圖5a是用本發明的緩沖液進行的毛細管區帶電泳，分析患IgA單克隆丙種球蛋白病并有正常IgG的對象的血清樣品的電泳圖。圖5b是用本發明范圍之外的緩沖液通過板凝膠電泳分析與圖5a相同的血清樣品的光密度掃描圖。圖6a是用本發明的緩沖液進行的毛細管區帶電泳，分析一對象的血清樣品的電泳圖，該對象患雙克隆或寡克隆丙種球蛋白病且α1和α2升高。圖6b是用本發明范圍之外的緩沖液通過板凝膠電泳分析與圖6a相同的血清樣品的光密度掃描圖。圖7a是用本發明的緩沖液進行的毛細管區帶電泳，分析患小單克隆(minimonoclonal)丙種球蛋白病的對象的血清樣品的電泳圖。圖7b是用本發明范圍之外的緩沖液通過板凝膠電泳分析與圖7a相同的血清樣品的光密度掃描圖。圖8a是用本發明緩沖液進行的毛細管區帶電泳所獲得的白蛋白峰面積與用本發明范圍之外的緩沖液進行的板凝膠電泳所獲得的白蛋白峰面積之間的相關性圖。圖8b是類似于圖8a的相對α1球蛋白峰面積的相關性圖。圖8c是類似于圖8a的相對α2球蛋白峰面積的比較圖。圖8d是類似于圖8a的相對β球蛋白峰面積的比較圖。圖8e是類似于圖8a的相對γ球蛋白峰面積的比較圖。發明詳述和優選實施例氨基酸在本發明中之所以有效是因為它們在高pH條件下因羧基(-COO-)的離子化而帶負電荷。有用的氨基酸包括必需和非必需氨基酸。某些主要氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸和谷氨酰胺。其中優選的是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸，更佳的是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。優選的氨基酸類別是α-氨基酸，尤其是那些在水溶液中導電率較低的種類如甘氨酸。可在一個緩沖液中使用2種或多種氨基酸而不是僅用一種，盡管在絕大多數情況下用一種氨基酸便已足夠了。氨基酸的濃度并不重要，而且在任一具體情況下的最佳濃度取決于諸如待分析樣品的稀釋度和毛細管性質(包括施加的任何表面處理及其內直徑)等因素。一般，最佳結果是用約10-500mM的氨基酸濃度獲得的，更佳地為約20200mM。緩沖液優選是水溶液，盡管并不限于任何具體的溶劑。溶液是堿性的以便賦予氨基酸負電荷。盡管堿性度可以改變，但是優選的溶液是pH為約8-11，最佳地約9-10的溶液。用本發明的方法分析的樣品優選在注射或上樣于柱之前用緩沖液稀釋過的樣品。稀釋程度并不關鍵，可以變化。然而，一般在1份樣品對約1-100份緩沖液，更佳地為1份樣品對約3-30份緩沖液進行稀釋的情況下可獲得最佳結果。本發明可應用于一般性的蛋白質混合物的液體樣品，尤其是用于分析生物流體樣品。這種流體的例子有尿液、唾液、腦脊液、全血、血漿和血清。特別是血清樣品。緩沖液還可含有添加劑。例如可加入鹽類以增加溶液的離子強度，以便提高分離蛋白區帶的分辨力。優選的鹽類是無機鹽如堿金屬和堿土金屬的鹵化物。例子有鈉和鉀的鹵化物如氯化物、碘化物、溴化物和氟化物，其中優選氯化鈉。鹽濃度并不關鍵，可以改變，而最佳范圍取決于系統的其他參數。典型的范圍是約1-100mM，更佳地為約10-30mM。還優選的是，緩沖溶液中不含有除氨基酸之外的其他緩沖劑。進一步優選的是，緩沖溶液不含會與蛋白質或毛細管壁形成復合物或結合或相互作用的添加劑。具體地，緩沖液最好不含硼酸根離子、磷酸根離子或硼酸根和磷酸根的取代類似物。然而，即使在這些添加劑存在的情況下，本發明的好處仍能獲得。本發明還提供了各種材質的毛細管中性能更好的優點，無論是有涂層或無涂層的毛細管。然而，如上所述，本發明特別適用于含氧化硅材料如熔凝氧化硅、玻璃或石英的毛細管，最適用于內壁表面未經涂覆的含氧化硅的毛細管。根據本發明的蛋白質分離，可以方便地用常規電泳分離技術中所用的設備、材料、操作條件和程序進行。優選的毛細管是那些內直徑小于約200微米，最佳地約10-100微米的毛細管。本發明還適用于板型池和其他非毛細管系統中進行的電泳分離。對于毛細管系統，優選至少約50伏特/厘米毛細管長度，更佳的電壓伏特為約100-1000伏特/厘米。下列實施例僅僅是為了闡述目的而給出，它們不以任何方式定義或限定本發明。實施例1將25mM甘氨酸和25mMNaCl溶解于去離子水中，再用1NNaOH調節pH至11，從而制得電泳緩沖液。使用熔凝氧化硅毛細管，測得其內直徑為50μ而外直徑為375μ，而總長度為25厘米(從入口至檢測器為20厘米)。毛細管內表面未經涂覆，而外表面涂有聚亞酰胺以提高韌性和防止破碎。毛細管的預處理是用1NNaOH洗滌2分鐘，用蒸餾水漂洗2分鐘，用電泳緩沖液洗滌5分鐘。然后，在注有電泳緩沖液的情況下讓20kV通過毛細管2小時而調整毛細管。用電泳緩沖液稀釋不含藥物的(正常)血清50倍，然后在2psi(0.14kg/cm2)的壓力下注入毛細管1秒。在15.00kV的電壓下進行電泳，并對波長214mm處的吸收進行檢測。在3分鐘內出現了5個峰，如圖1的電泳圖所示。從左至右，這些峰代表γ(伽馬)球蛋白組份、β(貝塔)球蛋白組份、α1(阿爾法-1)球蛋白組份、α2(阿爾法-2)球蛋白組份和白蛋白組份。根據平穩的基線，這些峰十分明確。實施例2該實施例用本發明的緩沖溶液來比較患不同疾病的人的血清樣品的電泳圖，而且還包括在不含氨基酸的瓊脂糖凝膠上進行電泳的電泳圖。將11.26克甘氨酸和0.76克NaCl溶解于800毫升蒸餾水中，再用1NNaOH調節pH至9.6，再加去離子水至終體積為1000毫升，然后讓形成的溶液通過0.5μ的濾膜，從而制得電泳緩沖液。該電泳緩沖液含有150mM甘氨酸。血清樣品是將1份樣品與9份電泳緩沖液(體積)混合而制備的。毛細管是熔凝氧化硅毛細管，其內直徑為25μ而外直徑為360μ，而總長度為24厘米，其中從入口至檢測器的距離為19厘米。毛細管內表面未經涂覆，而外表面涂有聚亞酰胺。毛細管用1NNaOH洗滌30秒，再用電泳緩沖液漂洗30秒。在20℃下進行毛細管區帶電泳(僅使用電泳緩沖液作為分離介質)，其中樣品在5psi(0.35kg/cm2)的壓力下注入毛細管1秒，在15kV的電壓下和16μA下進行電泳3分鐘，并在214nm處進行檢測。比較試驗是在預澆制的瓊脂糖板凝膠中進行，其中用巴比妥緩沖液。該緩沖液組合物含有10mM5，5-二乙基巴比土酸加50mM5，5-二乙基巴比土酸鈉，pH為8.6，而電壓為100V，用藍染色法使蛋白質顯現。在各圖中所示的電泳圖軌跡如下圖2a正常血清，用甘氨酸電泳緩沖液的毛細管區帶電泳。圖2b正常血清，用巴比妥緩沖液的瓊脂糖板凝膠。圖3a患單克隆丙種球蛋白病的對象的血清，用甘氨酸電泳緩沖液的毛細管區帶電泳。圖3b患單克隆丙種球蛋白病的對象的血清，用巴比妥緩沖液的瓊脂糖板凝膠。圖4a患多克隆丙種球蛋白病的對象的血清，用甘氨酸電泳緩沖液的毛細管區帶電泳。圖4b患多克隆丙種球蛋白病的對象的血清，用巴比妥緩沖液的瓊脂糖板凝膠。圖5a患IgA單克隆丙種球蛋白病并有正常IgG的對象的血清，用甘氨酸電泳緩沖液的毛細管區帶電泳。圖5b患IgA單克隆丙種球蛋白病并有正常IgG的對象的血清，用巴比妥緩沖液的瓊脂糖板凝膠。圖6a患雙克隆或寡克隆丙種球蛋白病且α1和α2升高的對象的血清，用甘氨酸電泳緩沖液的毛細管區帶電泳。圖6b患雙克隆或寡克隆丙種球蛋白病且α1和α2升高的對象的血清，用巴比妥緩沖液的瓊脂糖板凝膠。圖7a患小單克隆丙種球蛋白病的對象的血清樣品，用甘氨酸電泳緩沖液的毛細管區帶電泳。圖7b患小單克隆丙種球蛋白病的對象的血清樣品，用巴比妥緩沖液的瓊脂糖板凝膠。在所有這些電泳圖中所示的峰(除了圖5a和5b之外)是白蛋白和組份α1、α2、β和γ，其中在毛細管區帶電泳軌跡中依次為從右至左，而在板凝膠電泳軌跡中為從左至右，而且在每種情況下白蛋白是最大的峰。在圖5a中，兩個最左側的峰(保留時間分別為1.16和1.24)分別是IgG和IgA，而在圖5b中分別是最右側的兩個峰。這些軌跡顯示，如同在使用巴比妥緩沖液的板凝膠電泳軌跡中一樣，在用甘氨酸緩沖液的毛細管區帶電泳軌跡中這些峰同樣有效地被分開。實施例3該實施例報道了相關性研究，在該研究中用實施例2中所述的兩種方法分析了37個不同病人的的血清樣品。對5種組份中每一種，比較了在兩種方法之間的峰面積，面積通過積分器確定。還進行了回歸分析。對于白蛋白和組份α1、α2、β和γ，結果分別繪制于圖8a、8b、8c、8d和8e中。回歸分析得到如下結果圖8ay＝0.9836x+2.4469；R2＝0.9176圖8by＝1.5197x+0.2363；R2＝0.9223圖8cy＝0.8888x-0.0989；R2＝0.8931圖8dy＝0.4147x+2.3944；R2＝0.4587圖8ey＝1.0696x-0.4784；R2＝0.9789β區的相關性(圖8d)沒有和其他4種區的相關性一樣好。有兩種可能的原因。首先，β2球蛋白可能高親和性地結合于染料但紫外吸收低。其次，光密度儀的自動劃界線不一致。然而其他4種區的相關性令人信服地表明，用甘氨酸緩沖液的毛細管區帶電泳是實現在血清樣品中蛋白質合適分離的有效手段。實施例4該實施例研究了單一血清樣品在重復的電泳分離中的數據的重復性。使用了6個毛細管，在實施例2所述的條件下，在每個毛細管中以連續方式進行10次電泳，并且不在中間進行毛細管處理。在每個電泳圖中對5個峰的每一個峰加一個內標測量其遷移時間和峰面積。對每個毛細管，在電泳-電泳比較中計算每個10次電泳系列的平均值，并確定標準差和變異系數(標準差除以平均值)。結果列于表I和II，其中“S.D.”指標準差，而“％C.V.”指百分比表示的變異系數。然后在毛細管-毛細管比較中，比較平均值，再計算出總平均值以及標準差和變異系數。這些都列于表III。從所有這3個表中可以看出，獲得了高重復性和精確度。表I各毛細管的電泳-電泳比較表II其他各毛細管的電泳-電泳比較</tables>表III毛細管-毛細管比較上述內容主要是為了闡述而提供的。對于本領域的技術人員而言很明顯，此處所述的操作條件、材料、程序步驟和系統的其他參數可被進一步地以多種形式加以改動或替換，這些同樣落于本發明的精神和范圍之內。權利要求1.一種分離液體樣品中的蛋白質混合物的方法，其特征在于，該方法包括通過施加電場通過分離管，而讓該樣品電泳經過注有氨基酸堿性溶液的毛細管。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該氨基酸是選自下組的成員甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸和谷氨酰胺。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該氨基酸是甘氨酸。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該堿性溶液不含硼酸根離子和磷酸根離子。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，堿性溶液的pH為約8-11。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該氨基酸在該堿性溶液中約為10-500mM。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該毛細管的內直徑小于約200微米。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該電場是這樣實現的施加至少約50伏特/厘米毛細管長度的電壓通過毛細管。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該毛細管是熔凝氧化硅毛細管。10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該毛細管是熔凝氧化硅毛細管，且內表面為暴露的氧化硅。全文摘要在含有一種或多種氨基酸的緩沖液中,通過毛細管電泳而分離蛋白質混合物,其中氨基酸的量足以防止或大大減少蛋白質結合于毛細管壁的程度。文檔編號G01N27/447GK1185836SQ97190003公開日1998年6月24日申請日期1997年2月26日優先權日1996年2月29日發明者E·克魯斯卡,劉承明申請人:生物輻射實驗室股份有限公司