用于血紅蛋白測量和白細胞區分的不含氰化物的試劑及其方法

專利名稱：用于血紅蛋白測量和白細胞區分的不含氰化物的試劑及其方法
該發明關于一種用于測量血液中總的血紅蛋白的試劑及其方法，其中該試劑不含氰化物和鐵氰化物離子。此外，該試劑及其方法能夠利用適當的電子設備在一個血樣中對全部白細胞進行計數并確定至少兩種白細胞。
血液樣品中白細胞和血紅蛋白的測量對諸如白血病和貧血癥等疾病的臨床診斷極為重要。為理解和解釋該發明起見，定義下列術語。
1、血紅蛋白----含在紅細胞中，在血液中作為氧的載體。它是一種有色蛋白質，由四個血紅素基團組成兩個α和兩個β珠蛋白鏈。
2、血紅素基團----與氧相結合的能力依賴于血紅素基團的存在。它也使血紅蛋白具有特殊的顏色。血紅素由一個稱之為原卟啉的有機部分和一個鐵原子組成。血紅素中的鐵原子在原卟啉環的中心與四個氮原子相結合。鐵原子可以是亞鐵狀態，二價或是氧化鐵狀態，三價。
3、高鐵血紅蛋白(符號為Hi)----鐵原子被氧化成三價鐵的血紅蛋白。替代術語為正鐵血紅蛋白和高價鐵血紅蛋白。
4、高鐵血紅蛋白氰化物----鐵原子被氧化為三價鐵并且已與氰化物離子相絡合的高鐵血紅蛋白。替代術語為氰化正鐵血紅蛋白，氰化高鐵血紅蛋白和正鐵血紅蛋白氰化物。
5、血紅蛋白類型----所有通常在循環血液中存在的鐵血紅蛋白衍生物。包括脫氧血紅蛋白(Hb)、氧合血紅蛋白(HbO2)、血紅蛋白S和血紅蛋白A2、碳氧血紅蛋白(HbCO)、高鐵血紅蛋白(Hi)。
6、確定血液中的血紅蛋白的NCCLS(臨床試驗標準國家委員會)參考步驟(H15-A Vol.4 No.3)。一個適用于通過高鐵血紅蛋白氰化物的方法測量血紅蛋白濃度的所有臨床試驗人員和儀器、試劑和材料的生產者的標準過程。
7、血紅蛋白測量----可根據血液的某些諸如比重和折射率等物理特性、血紅蛋白分子的化學組成、血紅蛋白結合氧、一氧化碳、硫等的能力以及血紅蛋白的衍生物的波譜特性來測量全部血紅蛋白濃度。
8、血紅蛋白穩定劑----在血紅蛋白測量期間，用于保持血紅蛋白衍生物或所形成的色原穩定的物理化學特性(化學結構、光學密度等)的化學化合物。
通常用自動血液分析儀來對血液樣本中的白細胞進行記數和區分，利用自動血液分析儀來對白細胞進行記數時，首先用一種等滲稀釋劑將整個血液樣品稀釋，并加入一種紅細胞溶解劑將樣品中的紅細胞溶解，得到含有白細胞的樣品。然后，樣品通過分析儀檢測部分的一個細小的通道或一個精細的小孔。根據響應所通過的單個白細胞而產生的檢測信號對白細胞進行記數，并對其進行區分。等滲透稀釋劑的進一步說明包含在美國專利3,962,125、4,346,018和4,521,518中。紅細胞溶胞劑的進一步說明包含在美國專利3,874,852、4,528,274、3,874,852、4,346,018和4,485,175中。
例如，美國專利4,346,018講授一種等滲透多用途血液稀釋劑和利用該溶胞劑系統區分兩類白細胞的方法。美國專利4,485,175講授了一種用季銨鹽作為稀釋劑和COULTERCOUNTER Model S-plus自動血液記數儀(佛羅里達邁阿密的考爾特(COULTER)公司的注冊商標)對淋巴細胞、單核白細胞和粒性白細胞三類白細胞的區分的方法和試劑系統。美國專利4,485,175也講授到，為形成一種用于測量血紅蛋白的合適色原，也可用一種堿金屬氰化物，例如氰化鉀。
已經用氰化高鐵血紅蛋白的方法進行血紅蛋白濃度的測量。根據這種方法，在血液樣品中加入一種含有非離子表面活性劑的紅細胞溶解劑，以降低紅細胞的細胞膜引起的混濁度。被釋放的血紅蛋白被一種氧化劑的作用所氧化，諸如鐵氰化鉀氧化劑，以產生高鐵血紅蛋白。接著，氰化物離子與高鐵血紅蛋白相結合形成氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)，可產生一種穩定的血紅蛋白測量樣品。用一個預定波長來測量氰化高鐵血紅蛋白樣品的吸收。這種方法作為確定血紅蛋白濃度的標準方法而被廣泛采用。
雖然用氰化高鐵血紅蛋白的方法形成的化合物一旦形成后是一種極穩定的物質，但使用一種氧化劑對紅細胞的氧化要用10多分鐘的時間來完成使用Drabkins試劑的氧化。此外，紅細胞的溶解、血紅蛋白的稀釋和紅細胞及血小板膜的溶解比自動儀器所要求的慢一些。
為滿足自動血液分析儀的時間要求，以往的方法是使用含有氰化物離子的紅細胞溶解劑，它可以形成穩定的血色原，并具有一個類似于氰化高鐵血紅蛋白的吸收頻譜。紅細胞溶解劑也減少了細胞溶解、血紅蛋白洗提和細胞膜溶解的時間需要。此外，必須用一種適當的方法，如次氯酸鈉，對無用的液體進行去毒和處理，這是極其費力的工作。
由于這個原因，也利用另外一種所熟知的氧合血紅蛋白方法。在氧合血紅蛋白方法中，紅細胞被用于溶解紅細胞并釋放血紅蛋白的非離子表面活性物質所溶解。血紅蛋白被釋放，并以氧合血紅蛋白的形式(HbO2)對其進行測量。用預定波長來測量氧合血紅蛋白的吸收。因為氧合血紅蛋白法不用氰化物，所以在處理試劑時不存在危險，也不需要進行麻煩的廢液的處理操作。
然而，傳統的氧合血紅蛋白方法具有一個溶解劑不僅溶解紅細胞，而且也使白細胞變得很小的缺陷。這對于吸收測量是有利的，因為它減小了白細胞引起的光散射，但在另一方面，它使得用溶胞劑對多于兩種白細胞的測量變得非常困難。
為避免這個問題，使用氧合血紅蛋白方法的自動血液樣品分析儀，通過將一個樣品送到兩個檢測部分為紅細胞和白細胞的測定單獨準備樣本，一個用于紅細胞的測量，一個用于白細胞的測量。然而，由于不僅需要兩個單獨的檢測部分，而且也需要兩套流水線來準備測量用的樣本，所以這種方法有需要昂貴而復雜設備的缺點。
另外，使用氧合血紅蛋白方法，不能精確地測量高鐵血紅蛋白含量高的血液樣本，這是因為高鐵血紅蛋白并不是很容易地可以轉化為氧合血紅蛋白的。當使用對照血液時，高鐵血紅蛋白含量非常重要。對照血液通常用于控制自動血液分析儀的分析精度。對照血液通常存放在制冷狀態，而且長時間具有穩定的血紅蛋白濃度。然而在高于室溫的儲存期間，血液中的血紅蛋白慢慢地轉化為高鐵血紅蛋白。因此，當用氧合血紅蛋白方法測量高于22℃儲存的對照血液時，無法測量已轉變為高鐵血紅蛋白的血紅蛋白部分，因此經過幾天之后，血紅蛋白的測量值會變得慢慢低于初始值。
解決該問題的方法是使用一種十二烷基硫酸鈉或等量的月桂基硫酸鈉(SLS)、一種陰離子表面活性劑和Triton X-100----一種非離子表面活性劑在中性緩沖溶液(pH值為7.2)中的試劑來測量血紅蛋白。這種方法由Oshiro等在《臨床生物化學》的第15卷83(1982)中講授。在該方法中，由SLS和Triton X-100的作用將紅細胞溶解，而洗提出的血紅蛋白被轉化成SLS血紅蛋白。因此，可以在不受高鐵血紅蛋白影響情況下進行血液中血紅蛋白濃度的測量，而且因為不使用氰化物，沒有必要進行對廢液處置的特殊工藝。然而，不可能用該方法從同樣處理的血液樣本中進行白細胞區分和血紅蛋白濃度的測量。在一個需要把洗提出的血紅蛋白轉化成SLS血紅蛋白的SLS濃度下白細胞被溶解，使得不能與血紅蛋白的測量同時進行。
美國專利5,250,437和5,242,832教授了這些問題的其他解決方法。這些公開出版物提到，為了測量血紅蛋白的濃度，用合適的紅細胞溶解劑通過可洗提紅細胞中的血紅蛋白的季銨鹽的主要作用有選擇地溶解紅細胞。幾乎同時，被洗提的血紅蛋白變性，即其空間結構被改變，并且血紅蛋白中的血紅素鐵被溶入試劑中的氧從二價離子氧化成三價離子，從而得到高鐵血紅蛋白。在美國專利5,250,437中，將適量的陽離子、非離子和兩性表面活性劑加入紅細胞溶解劑中來調整血紅蛋白變性的程度，以得到穩定的血紅蛋白。雖然沒有明確血紅蛋白的穩定機理，據推測，可能是多種具有不同分子結構的表面活性劑對血紅蛋白的作用在預定的水平上導致變性程度的固定或轉化為高鐵血紅蛋白的空間結構的變化。美國專利5,242,832通過添加一種血紅蛋白穩定劑改善了美國專利5,250,437中的試劑。雖然沒有弄清血紅蛋白穩定劑的作用機理，但據推測血紅蛋白穩定劑分子結構中的氮原子或酚式羥基中的氧原子的單個電子對可能與高鐵血紅蛋白中的血紅素鐵結合成螯合物，從而得到了穩定的血紅蛋白。
另外其他的方法包括美國專利4,853,338，它使用pH值至少為11.3的陰離子表面活性劑來測量全部血紅蛋白。離子表面活性劑可以作為一種堿，或在組合物中含有另外一種獨立于表面活性劑的強堿給予堿性高鐵血紅素反應所要求的pH值。適合給予所要求的pH值的表面活性劑包括長鏈的烷基三甲基氫氧化銨。適合與給予所要求的pH值的獨立成分相結合的表面活性劑包括兩性離子表面活性劑和陽離子季銨鹵化物。文獻還提到，可以使用陰離子表面活性劑，例如烷基硫酸堿金屬鹽。然而，由于堿性高鐵血紅素的pH值，這種方法不是最理想的。
其他的方法還包括美國專利4,656,139和4,617,275，它們公開了一種防止血紅蛋白轉變成高鐵血紅蛋白的氧合血紅蛋白方法。為了防止血紅蛋白轉變成高鐵血紅蛋白，把(2-吡啶基硫代-1-氧化)鈉作為一種保護劑加到硼酸緩沖溶液中。此外，在試劑系統中，用EDTA-2K作為一種螯合劑。試劑系統的pH值為6～8，滲透壓為240～310mOsm/kg。
另外，其他方法包括美國專利3,874,852公開的用一種由含有能充分溶解紅細胞和血小板細胞并將血紅蛋白轉化成用于測量的血色原的季銨離子和氰化物離子的無鐵氰化物的水溶液組成的試劑來進行血液中白細胞和血紅蛋白的測量。
另外一種方法包括美國專利4,185,964中提到的用于血液分析儀的溶解試劑，快速破壞白細胞。試劑與血紅蛋白反應或絡合，形成一種具有足夠穩定性的血色原，允許進行血紅蛋白的光譜測量。
另外一種方法也包括美國專利4,800,167，它提到一種用來測量全血中的血紅蛋白含量的試劑系統，全血包括分子量大約從10,000～360,000的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，pH值大于8，聚乙烯吡咯烷酮水溶液使全血中的血紅蛋白變性，形成一種可以在大約575納米的波長測量的穩定物質。
盡管有以上討論的已有技術，但還有研制其他具有下列之一或多個特點的試劑的必要它應是無毒，當與一種并不有害影響血紅蛋白穩定性的等滲的溶液一起使用時產生一種穩定血色原，并與其他血液測量參數相兼容，如白細胞計數和白細胞區分。
本發明涉及一種不含氰化物或鐵氰化合物離子的試劑組合物和一種測量血液樣品中的血紅蛋白濃度的方法。試劑組合物包括至少一種從季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物中選取的、含量能充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白的溶胞劑，和一種能足夠將釋放的血紅蛋白轉換成高鐵血紅蛋白的防氧化劑。一般地，當溶胞劑和防氧化劑組合時，試劑組合物具有大約6～7.5的pH值。試劑組合物在5～115的pH值范圍內能有效地充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白，優選從pH9-11，最優選95-105。在試劑組合物中可以加入一種pH值調節劑，提供大約在5～115范圍內的pH值。
本發明也涉及一種由以下步驟組成的測量血紅蛋白濃度的方法讓血液樣品與一種不含氰化物或鐵氰化物離子的試劑組合物發生反應，其中所述的試劑組合物包括(ⅰ)至少一種從季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物中選擇的、含量能夠充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白的溶胞劑，和(ⅱ)一種含量足能將釋放的血紅蛋白轉換成高鐵血紅蛋白從而形成一種反應產物的防氧化劑；及測量所述反應產物的吸收來確定所述血液樣品的血紅蛋白濃度。一般地，當溶胞劑和防氧化劑組合時，試劑組合物具有大約6～75的pH值。試劑組合物在5～115、優選的是在9～11而最好的是在95～105的pH值范圍內能有效地充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白。在試劑組合物中可以加入一種pH值調節劑，提供大約在5～115范圍內的pH值。
此外，本發明涉及一種能從同一血液樣品與試劑組合物的反應產物中進行血紅蛋白濃度測量和白細胞區分的試劑組合物和方法。試劑組合物包括至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物的、含量能夠充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白的溶胞劑，和一種含量能有效地將釋放的血紅蛋白轉換成高鐵血紅蛋白、從而形成反應產物的防氧化劑。一般地，當溶胞劑和防氧化劑組合時，試劑組合物具有大約6～7.5的pH值。試劑組合物在5～11.5、優選的是從9～11而最好是從9.5～10.5的pH值范圍內能有效地充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白。在試劑組合物中可以加入一種pH值調節劑，提供大約在5～11.5范圍內的pH值。
在一種血液樣品中測量血紅蛋白濃度和區分至少兩類白細胞的方法中，改進措施包括測量血液樣品與本發明的試劑組合物反應所得的反應產物血色原的吸收和根據所述的反應產物區分至少兩類白細胞。


圖1示出了使用佛羅里達州邁阿密的考爾特公司制造的COULTER COUNTERModel S-plusⅣdiff儀器的正常全血的不同樣品中血紅蛋白濃度測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSESⅢ diff溶胞劑(佛羅里達州邁阿密的考爾特公司的注冊商標)，由考爾特公司生產，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
圖2示出了圖1中使用COULTER COUNTER Model S-plusⅣdiff儀器的異常全血的不同樣品中血紅蛋白濃度測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSES Ⅲ diff溶胞劑，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
圖3示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff儀器的正常全血樣品中的白細胞(WBC)測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSES Ⅲ diff溶胞劑，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
圖4示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff儀器的異常全血的白細胞計數測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSES Ⅲ diff溶胞劑，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
圖5示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff儀器的正常全血的樣品中白細胞的淋巴細胞種類測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSES Ⅲ diff溶胞劑，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
圖6示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus Ⅳ diff儀器的正常全血的樣品中白細胞的單核細胞種類測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSES Ⅲ diff溶胞劑，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
圖7示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-plus diff儀器的正常全血樣品中的白細胞的粒性白細胞種類測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSES Ⅲ diff溶胞劑，由考爾特公司生產，而y軸表示使用實施例1的試劑，在圖中表示為LYSE S4。
本發明給出了一種測量血液中血紅蛋白濃度的新試劑組合物和方法，其中試劑組合物中不含氰化物或鐵氰化物離子。更優選的是，該試劑組合物和方法利用血液樣品和試劑反應的產物能夠進行血紅蛋白的測量和至少兩種白細胞的區分。
試劑組合物包括一種紅細胞溶胞劑和一種防氧化劑，并且不含有毒物質，例如氰化物離子。進行這種測量的樣液包括全部血液和用于校準和確定血液分析儀的正常性能的血液校準劑和血液對照品。校準劑和對照品可以取自于人或動物。
溶胞劑含有至少一種從季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物中選取的成分。季銨鹽具有如下的分子式
其中R1是C8～C20烷基、鏈烯基或鏈烯基基團；R2、R3和R4是C1～C8烷基、鏈烯基或鏈烯基基團；而X-是形成鹽的根，如Cl、Br、I、PO4和CH3SO4。優選的是，R1表示一種具有至少12個碳原子的烷基，而R2、R3和R4表示具有1～6個碳原子的短烷基。吡啶鎓鹽具有下列形式
其中，n是從7～19的整數，而X-是一個陰離子基團。
優選的溶胞劑是利用至少兩種季銨化合物的混合物。更特殊地，優選的溶胞劑由其中R1代表一種具有12個碳原子的烷基的季銨化合物和其中R1代表一種具有14～16個碳原子的烷基的季銨鹽化合物的混合物組成。最好，溶胞劑包括含有十四烷基三甲基溴化銨的十二烷基三甲基氯化銨。其它可以給出有效結果的季銨鹽包括與十四烷基三甲基氯化銨相混合的十六烷基三甲基溴化銨或十六烷基二甲基乙基溴化銨。
試劑組合物含有的有效含量能夠從紅細胞中釋放血紅蛋白的溶胞劑。優選的是，試劑組合物含有在5～80克/升范圍內的溶胞劑。最好含溶胞劑量的范圍是在15～35克/升。
用溶胞劑將血紅蛋白從紅細胞中釋放出來，并且被釋放的血紅蛋白與一種防氧化劑發生反應。防氧化劑用來將釋放的血紅蛋白轉化成血色原。所使用的防氧化劑的量能有效地把被釋放的血紅蛋白轉化成血色原。如果使用的防氧化劑的量不足，那么與使用市售產品LYSE S Ⅲdiff溶胞劑相比，在COULTER COUNTER Model S-Plus Ⅳdiff儀器上血紅蛋白到血色原的轉化就不足以精確地測量血紅蛋白的濃度值。優選地，防氧化劑的含量范圍從0.1克/升到10克/升，更優選是從1克/升到3克/升。這些范圍可以改變，因為防氧化劑的量與血液樣品的體積之比取決于加入到血液樣品中的稀釋劑的量和加入到血液樣品中的溶胞劑的量。
防氧化劑包括還原劑，例如抗壞血酸、亞磷酸、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉和具有還原特性硫的含氧酸堿金屬鹽，也包括其混合物，其中硫的氧化值從+2～+4。優選的是，防氧化劑包括亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和它們的混合物。最好，防氧化劑包括亞硫酸鈉。
一般地，當溶胞劑和防氧化劑組合時，試劑組合物具有大約6～7.5的pH值。試劑組合物的pH值可以在大約5～11.5的范圍內，優選的是9～11，最好是9.5～10.5。為了得到試劑組合物pH值范圍內的一個pH值，應當加入一種pH調節劑。
適于給與所希望的pH值的pH調節劑的例子包括強酸，例如鹽酸，和強堿，例如堿金屬氫氧化物。令人滿意的堿金屬氫氧化物的例子包括氫氧化鈉和氫氧化鉀。次優選的例子包括氫氧化四烷基銨，烷基可以含有1～4個碳原子，例如氫氧化四丁銨。
已經測定，與使用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶胞劑相比，在pH值5之下獲取精確的血紅蛋白濃度值時會出現嚴重問題。在pH值9之下，試劑組合物的穩定性降低。
試劑組合物應具有其它的特性，以使其與其預期用途相適合。這些特性包括具有220～370毫滲壓單位的滲透壓和大約3～11西門子的導電率。
已經發現，當使用一種已經混合并在70℃存放了幾天的溶胞劑和防氧化劑的水溶液時，所測量的血紅蛋白的濃度不同于使用溶胞劑和防氧化劑的水溶液新鮮混合物所獲得的值。利用溶胞劑和防氧化劑的水溶液新鮮混合物測量得到的血紅蛋白的濃度可以與使用LYSE S Ⅲdiff溶胞劑所獲得的值相比較。更特殊地，當在升高的溫度下存放溶胞劑和防氧化劑的混合物時，所測得的血紅蛋白的濃度值明顯低于當與使用LYSE SⅢ diff溶胞劑相比較所測得的血紅蛋白的濃度。為解決這個問題，可以在血紅蛋白濃度測量之前將試劑迅速混合。
最好在試劑組合物中加入一種防氧化穩定劑以提供試劑的穩定性。以能提供試劑組合物的穩定性的有效數量加入防氧化穩定劑。試劑組合物穩定性是使試劑能在長期存放之后提供精確的血紅蛋白濃度測量。更特殊地，當本發明的試劑組合物存放了至少6個星期，并且是在存儲溫度升高的情況下，血紅蛋白濃度的測量結果可以與LYSE SⅢ diff溶胞劑在經受同樣的存儲條件下的測量結果相比較。
合適的防氧化穩定劑是乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、檸檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和它們的化合物。優選的是，防氧化穩定劑選自乙二胺四乙酸二鈉、乙二醇雙(3-氨基-乙基醚)-N,N’-四乙酸(EGTA)、葡糖酸、N-(2-乙酰氨基)亞胺基二乙酸(ADA)和其混合物。最優選的穩定劑是EDTA。優選地，試劑組合物含有的防氧化穩定劑的范圍在0.1～10克/升，更優選地是1～5克/升，最優選地是2克～4克/升。
為了說明防氧化穩定劑的有效性，在試劑組合物之間做了比較。試劑1是實施例1中的不加乙二胺四乙酸二納的試劑。試劑2是實施例1中的試劑。試劑組合物在70℃條件下存放了7天。下列表格說明含有防氧化穩定劑的試劑組合物提供了可以與傳統LYSE S Ⅲ diff溶胞劑相比擬的血紅蛋白測量。
表一血紅蛋白濃度試劑組合物樣品 LYSE SⅢ試劑1 試劑2diff溶胞劑(無EDTA)(0.25％EDTA)新鮮血液1 15.5 14.4 15.3新鮮血液2 12.4 11.4 12.2測量血紅蛋白濃度的方法涉及到血液樣本與本發明的試劑組合物的反應所產生的色原的檢測。測量血紅蛋白濃度包括以下步驟讓血液樣品與不含氰化物離子的試劑組合物進行反應，所述的試劑組合物包括至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物的溶胞劑，溶胞劑的含量能有效地充分溶解紅細胞，并釋放血紅蛋白；其含量可有效地將釋放的血紅蛋白轉化成血色原的防氧化劑，和一種提供5～11.5的pH值以形成反應產物的堿溶液；并測量所述的反應產物的吸收來確定所述血液樣品的血紅蛋白的濃度。
反應產物色原具有在500～600納米測量可重復的吸收頻譜。
圖1示出了利用COULTER COUNTER Model S-Plus Ⅳ diff儀器的36種不同正常全血樣品的血紅蛋白濃度測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶胞液，而y軸表示使用在圖中表示為LYSE S 4的實施例1中的試劑。所測試的血液樣品數為36。正常的血液樣品定義為無已知疾病的人的血液樣品。
相關系數為r=0.9940，而回歸線，y=1.0115x-0.1671，表示出可以接受的相關性和偏差。
圖2示出了利用COULTER COUNTER Model S-Plus Ⅳ diff儀器的82種不同異常全血樣品的血紅蛋白濃度測量之間的相關性。x軸表示利用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶胞液，而y軸表示使用在圖中表示為LYSE S 4的實施例1中的試劑。異常血液樣品從患一種或多種疾病的人獲得，例如貧血癥、白血病和異常血細胞數目癥。
相關系數為r=0.9994，而回歸線，y=1.0249x-0.256，表示出可以接受的相關性和偏差。
實施例1通過在高于室溫的條件下將各成分混合制備下列組合物試劑。
數量(克/升)十二烷基三甲基氯化銨和十四烷基三甲基溴化銨32防氧化劑2EDTA二鈉2.5Pluronic 25R8 Prill 1pH值調整到 10此外，本發明試劑組合物另外具有能夠從同一種血液樣品與試劑組合物反應產物進行血紅蛋白濃度的測量和白細胞區分的優點。優選的是根據血紅蛋白的測量可以至少進行兩種白細胞的區分。這兩種白細胞是淋巴細胞和粒性白細胞。最優選的是，可以進行至少三種白細胞的區分。這三種白細胞是淋巴細胞、單核細胞和粒性白細胞。
當測量血紅蛋白的濃度和白細胞的區分時，溶胞劑的濃度被進一步調整到一個能以有效的含量，使其充分溶解紅細胞，而不有害影響白細胞，從而可以從同一反應產物中進行血紅蛋白濃度的測量和白細胞的區分。當使用一種季銨鹽化合物時，溶胞劑的有效含量在5～80克/升的范圍內。最好是在15～35克/升的范圍內。
溶胞劑溶解紅細胞而不有害影響白細胞。然而，有一定量的被溶解的紅細胞的細胞殘渣與白細胞保留在溶解的血液樣品中。細胞殘渣可能在白細胞的區分中產生背景噪聲或細胞流動阻塞。可選擇地，在試劑組合物中可含有一種能通過溶解細胞顆粒物質、蛋白質殘留物消除干擾的有效含量的表面活性劑。表面活性劑的濃度范圍從0.1到2.5克/升，而更優選的是從0.5到1.5克/升。合適的非離子表面活性劑包括普盧蘭尼克(Pluronic)F、Pluronic L、Pluronic P、Pluronic R(Pluronic表面活性劑由新澤西的Parsippary的BASF公司生產)以及聚氧乙烯烷基苯酚。優選的表面活性劑是Pluronic 25R8 Prill和Pluronic F127，而最好的表面活性劑是Pluronic 25R8 Prill。
當進行血紅蛋白濃度測量和白細胞區分時，防氧化劑的濃度是以能有效地將被釋放的血紅蛋白轉化成血色原的量。如果使用過量的防氧化劑，回收的白細胞的值較低。
優選的是，防氧化劑的含量范圍在0.1克/升到10克/升，更優選從1克/升到3克/升。這些范圍可以改變，因為防氧化劑的量與血液樣品的體積之比取決于加入到血液樣品中的稀釋劑的量和加入到血液樣品中的溶胞劑的量。
當進行血紅蛋白濃度和白細胞區分二者的測量時，當溶胞劑和防氧化劑組合時，試劑組合物具有大約6～7.5的pH值。試劑組合物的范圍可從5～11.5，更為優選的是從9～11，而最好是從9.5～10.5。為得到在合適的pH范圍之內的試劑組合物的pH值，可以加入一種pH調節劑。當pH值高于11.5時，在獲取相應于使用市售產品LISE SⅢ diff溶胞劑獲取的血紅蛋白濃度時會出現嚴重問題。
當進行血紅蛋白濃度和白細胞區分二者的測量時，防氧化穩定劑的濃度被調整到一個可以有效地提供試劑組合物的穩定性的量。更具體地，當本發明的試劑組合物存放了至少6個星期，并且是在溫度升高的情況下，白細胞區分和血紅蛋白濃度的測量結果可以與LYSE S Ⅲdiff溶胞劑在經受同樣的存放條件下的測量結果相比擬。同樣的防氧化穩定劑可用于血紅蛋白濃度的測量和白細胞的區分。優選的是，試劑組合物含有防氧化穩定劑的范圍在0.1～10克/升，而更優選的是從1～5克/升，而最好是從2～4克/升。
在測量血樣中血紅蛋白濃度和區分至少兩種白細胞的方法中，本發明涉及到將血液樣品與本發明的試劑組合物反應時所產生的反應產物的吸收測量的改進和依據所述的反應產物區分至少兩類不同白細胞的改進。
更具體地，本發明的方法包括讓血液樣品與不含氰化物離子的試劑組合物進行反應，所述的試劑組合物包括至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其組合物的溶胞劑，溶胞劑的含量能有效地充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白，一種含量可有效地將釋放的血紅蛋白轉化成血色原、從而形成反應產物的防氧化劑，測量所述反應產物的吸收來確定所述血液樣品的血紅蛋白的濃度，并根據所述的反應產物區分至少兩種白細胞。
一般地，當溶胞劑與防氧化劑相組合時，該方法的試劑組合物具有6～7.5的pH值。試劑組合物的pH值的范圍大約從5～11.5，更為優選的是從9～11，而最好是從9.5～10.5。為了得到試劑組合物在pH值范圍之內的一個pH值，應加入一種pH調節劑。
本領域的技術人員將認識到，通過本領域已知的技術可以完成白細胞的區分。Hamill的美國專利3,874,852 Ledis等人的美國專利4,485,175和Carter等人的美國專利4,528,274的講授舉例說明了這些技術。
實施例2一種全血樣品由一種預定濃度的等滲平衡稀釋劑稀釋，稀釋劑被調整到一個預定的pH值和滲透壓。以在一定時間內至少引起白細胞種類的一種的單個血細胞體積的變化這樣的方式將所得到的稀釋血液與本發明的試劑組合物相混合，從而能夠區分至少兩類白細胞。此外，可確定測量白細胞記數。
圖3示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff儀器的36種不同正常全血樣品的白細胞(WBC)測量之間的相關性。x軸使用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶胞劑，而y軸使用在圖中表示為LYSE S4的實施例1中的試劑。正常的血液樣品定義為無已知疾病的人的血液樣品。相關系數為r=0.9989，而回歸線y=0.9899x+0.0074，表示出可以接受的相關性和偏差。
圖4示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-PlusⅣdiff儀器的82種不同異常全血樣品的白細胞(WBC)測量之間的相關性。x軸使用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶液，而y軸使用在圖中表示為LYSE S 4的實施例1中的試劑。相關系數為r=0.9996，而回歸線y=0.9962x-0.0251，表示出較高的相關性和很低的偏差。
本發明的試劑組合物的另一個優點是它可用于作為使用傳統測量方法進行血樣中白細胞計數的一種試劑。當被用于白細胞計數的測量時，本發明的試劑組合物的試劑配方和用于血紅蛋白濃度測量及白細胞區分的試劑組合物的配方一樣。這提供了另一個優點能夠使用同一種試劑組合物和根據血液樣品與本發明的試劑組合物反應所產生的同種反應產物進行血紅蛋白濃度、白細胞區分和白細胞計數的測量。
圖5示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff儀器的204種不同正常全血樣品的白細胞的淋巴細胞測量之間的相關性。x軸使用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶胞劑，而y軸使用在圖中表示為LYSE S 4的實施例1中的試劑。相關系數為r=0.9885，而回歸線y=0.9761x-0.729，表示出可以接受的相關性和偏差。
圖6示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff儀器的224種不同正常全血樣品的白細胞的單核細胞測量之間的相關性。x軸使用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶液，而y軸使用在圖中表示為LYSE S4的實施例1中的試劑。相關系數為r=0.8528，而回歸線y=0.9147x+1.3805，表示出較好的的相關性和可接受的偏差。
圖7示出了利用實施例2的方法和COULTER COUNTER ModelS-Plus Ⅳ diff儀器的223種不同正常全血樣品的白細胞的粒性細胞測量之間的相關性。x軸使用市售產品LYSE S Ⅲ diff溶液，而y軸使用在圖中表示為LYSE S4的實施例1中的試劑。相關系數為r=0.9851，而回歸線y=0.976x+2.0711，指示出較高的相關性和很低的偏差。
本發明的詳細說明已在說明書中以說明為目的給出。不脫離本發明的精神和范圍，本領域技術人員可對所給的細節做一些變化。
權利要求
1.用于測量血液樣品中的血紅蛋白濃度的不含氰化物離子的試劑組合物，包括a．包括至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其組合物的溶胞劑，溶胞劑的含量能有效地充分溶解紅細胞并釋放血紅蛋白；和b．一種含量可有效地將釋放的血紅蛋白轉化成血色原的防氧化劑。
2.權利要求1的試劑組合物，其中溶胞劑包括兩種不同的季銨鹽。
3.權利要求1的試劑組合物，其中防氧化劑選自亞磷酸、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉和其它具有還原特性硫的含氧酸堿金屬鹽，包括其混合物，其中硫的氧化值從+2～+4。
4.權利要求1的試劑組合物，還含有一種提供5～11.5pH值范圍的pH調節劑。
5.權利要求1的試劑組合物，還包括一種其含量能有效地提供試劑組合物穩定性的防氧化穩定劑。
6.權利要求5的防氧化穩定劑，其中穩定劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、檸檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
7.權利要求2的試劑組合物，其中溶胞劑包括十二烷基三甲基氯化銨和十四烷基三甲基溴化銨。
8.權利要求1的試劑組合物，還包括一種表面活性劑。
9.測量血紅蛋白濃度的方法，包括步驟a．血液樣品與一種不含氰化物離子的試劑組合物發生反應，所述的試劑組合物包括(ⅰ)至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物的、其量足夠溶解紅細胞并釋放血紅蛋白的溶胞劑，和(2)一種其量能足以將釋放的血紅蛋白轉換成血色原，從而形成一種反應產物的氧化劑；b．測定所述反應產物的吸收來確定所述血液樣品的血紅蛋白濃度。
10.權利要求9的方法，其中溶胞劑包括兩種不同的季銨鹽。
11.權利要求9的方法，其中防氧化劑選自抗壞血酸、亞磷酸、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉和其它具有還原特性硫的含氧酸堿金屬鹽，包括其混合物，其中硫的氧化值從+2～+4。
12.權利要求9的方法，其中試劑組合物還含有一種提供5～11.5pH值范圍的pH調節劑。
13.權利要求9的方法，其中試劑組合物還包括一種其含量能有效地提供試劑組合物穩定性的防氧化穩定劑。
14.權利要求10的防氧化穩定劑，其中穩定劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、檸檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
15.權利要求10的方法，其中溶胞劑包括十二烷基三甲基氯化銨和十四烷基三甲基溴化銨。
16.權利要求9的方法，還包括添加表面活性劑。
17.權利要求11中的方法，其中所述反應混合物的吸收測量在500～600納米之間進行。
18.一種用于測量血液樣品中的血紅蛋白濃度和區分白細胞種類的不含氰化物離子的試劑組合物，包括a．一種至少包括選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物的成分之一、其量足夠溶解紅細胞并釋放血紅蛋白、并在體積上影響白細胞以確定兩種白細胞的種類的溶胞劑；和b．一種其含量能有效地將釋放的血紅蛋白轉化成血色原的防氧化劑。
19.權利要求18中的試劑組合物，其中溶胞劑包括兩種不同的季銨鹽。
20.權利要求18中的試劑組合物，其中防氧化劑選自亞磷酸、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉和其它具有還原特性硫的含氧酸堿金屬鹽，也包括其混合物，其中硫的氧化值從+2～+4。
21.權利要求18中的試劑組合物，其中試劑組合物還含有一種提供5～11.5pH值范圍的pH調節劑。
22.權利要求18中的試劑組合物，其中試劑組合物還包括一種其含量能有效地提供試劑組合物穩定性的防氧化穩定劑。
23.權利要求21中的防氧化穩定劑，其中穩定劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、檸檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
24.權利要求19的試劑化合物，其中溶胞劑包括十二烷基三甲基氯化銨和十四烷基三甲基溴化銨。
25.權利要求18中的試劑組合物，還包括一種表面活性劑。
26.一種測量血液樣品中的血紅蛋白濃度和區分白細胞種類的方法，包括a．使血液樣品與不含氰化物離子的試劑組合物發生反應，從而形成反應產物，所述試劑組合物包括(1)至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物的、含量足夠溶解紅細胞并釋放血紅蛋白并由體積影響白細胞，以便確定至少兩種白細胞種類的溶胞劑，和(2)一種含量足夠能將釋放的血紅蛋白轉換成血色原的防氧化劑；b．測量所述反應產物的吸收來確定所述血液樣品的血紅蛋白濃度；和c．根據反應產物區分至少兩種白細胞種類。
27.權利要求26中的方法，其中溶胞劑包括兩種不同的季銨鹽。
28.權利要求26中的方法，其中防氧化劑選自亞磷酸、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉和其它具有還原特性硫的含氧酸堿金屬鹽，包括其混合物，其中硫的氧化值從+2～+4。
29.權利要求26中的方法，其中試劑組合物還包括一種提供在5～11.5pH值范圍的pH調節劑。
30.權利要求26中的方法，其中試劑組合物還包括一種其含量能有效地提供試劑組合物穩定性的防氧化穩定劑。
31.權利要求29的方法，其中的防氧化穩定劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物、檸檬酸、酒石酸、葡糖酸、糖酸和其混合物。
32.權利要求27中的方法，其中溶胞劑包括十二烷基三甲基氯化銨和十四烷基三甲基溴化銨。
33.權利要求26中的方法，還包括加入表面活性劑。
34.權利要求32中的方法，其中所述的反應混合物的吸收測量在大約500～600納米之間進行。
35.權利要求30中的方法，其中根據反應產物可以區分至少三種白細胞種類。
全文摘要
一種不含氰化物離子的試劑組合物和一種用于測量血液樣品中的血紅蛋白濃度的方法。此外,根據試劑組合物和血液樣品的同一反應產物,試劑組合物可以用于測量血紅蛋白的濃度和區分至少兩種白細胞種類。試劑組合物包括至少一種選自季銨鹽、吡啶鎓鹽和其混合物的、含量足夠溶解紅細胞并洗提血紅蛋白的溶胞劑,和一種其有效含量能夠把釋放的血紅蛋白轉化成血色原的防氧化劑。可用一種pH值調節劑調節pH值,從而提供范圍在5～11.5的pH值。
文檔編號G01N33/72GK1215168SQ97126470
公開日1999年4月28日 申請日期1997年10月17日 優先權日1997年10月17日
發明者M·里斯格, C·揚 申請人:庫特國際公司