用于測定生物體液中鎂的測試片的制作方法

專利名稱：用于測定生物體液中鎂的測試片的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于簡易測定生物體液，特別是如血清和血漿這樣的體液中鎂濃度的干測試片。
鎂是一種在生物體內僅次于鈣的最大含量的二價金屬，并且是一種廣泛影響體內各種酶的反應的重要的必需元素。血清和血漿的鎂濃度在與鈣濃度的競爭中發生變化，在中樞神經系統或心臟機能不全，腎功能不全，急性胰腺炎等疾病中能夠觀察到上述變化，這使得鎂的測定成為重要的臨床診斷項目之一。
人們已知用一種二價金屬螯合指示劑在體液樣品中進行比色測定和測定濃度的各種方法。最常用的螯合指示劑是4-甲基-1，3-苯二甲基藍I。根據Dojin Kagaku Catalog第19版(1994年5月31日出版)，用羊毛鉻黑T，鈣色素，偶氮胂羧，1-〔1-羥基-4-甲基-2-苯偶氮)-2-葉酚-4-磺酸，偶氮氯膦，甲基百里酚藍，鄰甲酚肽配位酮.，SPANS，二甲酚橙及類似物也可以實現鎂的比色測定。
當用這些螯合指示劑在生物樣品中進行鎂的比色測定時，必須加入一種鈣掩蔽劑以便避免共存的鈣的干擾而不影響指示劑。在鎂和鈣的共存物中，所選擇對鈣的掩蔽劑實例包括O，O’-雙〔2-氨甲基〕乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸(下文常稱作“GEDTA”〕，反式-1，2-環己二胺-N，N，N’，N’-四乙酸(下文常稱作“CyDTA”〕，和O，O’-雙〔2-氨基苯基〕乙二醇-N，N，N’，N’四乙酸(下文常稱作“BAPTA”〕作為一種用于掩蔽其它諸如鐵，銅和鋅這樣的重金屬的方法，加三乙醇胺或一種氰化物的化合物也是公知的。
用這些組合物制備一種用于測定鎂的試劑組合物目前是一種本領域技術人員能夠很容易推斷出的設想，且已經發了大量用于測定鎂的試劑組合物并將它們付諸實際應用。例如最常使用具有GEDTA的4甲基-1，3-苯二甲基藍I組合物和目前在市場上出售的許多它們的試劑盒。再如，JP-A-4-120464公開了一種具有GEDTA或BAPTA的偶氮氯膦組合物〔本文中所用的術語“JP-A’意思是“未審公開的日本專利中請”)，EP-A-597900公開了一種具有GEDTA或BAPTA的偶氮胂I組合物，且JP-A-5-11908公開了一種其中使用了一種甲衍生物的方法。
美國專利5,397,710中公開的組合物涉及了一種用于全血的干測試片，它具有分離血細胞的功能。它用羊毛鉻黑T，1〔1-羥基-4-甲基-2-苯偶氮〕-2-萘酚-4-磺酸，1-偶氮-2-羥基-3-〔2，4-二甲基羧酸苯胺〕萘-1’-〔2-羥基〕苯，偶氮氯膦III，羥基萘酚藍，偶氮胂I，SPANS或類似物作為指示劑，并使用GEDTA作為掩蔽劑。
在現有技術已使用的螯合指示劑中，除了甲衍生物以外，每種指示劑都具有一種烯丙基偶氮結構作為螯合作用的功能部分和一種茶酚結構作為色素的部分。
目前，當用一種干燥試劑分析液體樣品時樣品多數是未稀釋的血清，血漿，尿或類似物并且在許多情況中，所測定的物質含有相當高的濃度。鎂也不例外，它在人血清或血槳中的濃度通常是1.8至2.0mg/dl，而在異常情況中，有時達5.0至6.0mg/dl。測試片必須具有測定這類異常值的能力。
這就是說，當用一種金屬螯合指示劑制備用于測定鎂的干測試片時，對于樣品中鎂的濃度來說，在試劑中必須事先包括必需和足夠用量的螯合指示劑(所預計測定范圍的上限濃度包括異常值)。然而，當按照這樣一種必需和足夠的用量加入螯合指示劑時，在與鎂形成一種復合體前，甚至在不需和未改進的條件下就可以觀察到非常高水平的染色。換句話說，這些方面有一個缺陷，這就是由于較高的最初背景值，具有較低鎂濃度樣品的測定準確度變得很差。
由于通過相當強的體內平衡來控制生物體液〔諸如血清和血漿〕中鎂的濃度，所以將正常值限制在一個極其窄的范圍。從而，由于在疾病的診斷中，檢測一個稍微偏離這個較窄范圍的值是很重要的，所以較差的測定準確度是一個致命的缺陷。
另外，當本發明的發明人已經嘗試過用干法加工可想到的現有技術的鎂螯合指示劑和鈣掩蔽劑組成的組合物來制備來制備各種用于測定鎂濃度的干測試片時，發現在大多數組合物(包括現有技術的組合物)中都不能避免鈣的干擾。
此外，甚至在冷藏條件(4至8℃〕下，許多這樣獲得的干測試片仍表現出較差的儲藏穩定性。
本發明的一個目的是提供一種表現出較低背景值的干測試片來測定鎂的濃度，所述的干測試片在整個測定范圍內具有非常好的測定準確度，且不受共存的鈣的干擾，還具有一種非常好的儲藏穩定性并能夠容易和方便地使用。
本發明的這一目的和其它目的已經通過用一種于測試片來測定生物體液中鎂的濃度而實現，所述的干測試片包括下列〔i〕至〔iii〕的試劑組分〔i〕鄰甲酚酞配位酮(下文常稱作“OCPC”〕；〔ii〕O，O’-雙〔2-氨基苯基〕乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)；和〔iii〕一種pH為8.5至11.0的pH緩沖劑。
這種干測試片可以進一步含有一種離子型去污劑作為試劑組分〔iv〕。
此外，本發明的這一目的和其它目的已經通過上述干測試片而實現，其中這種干測試片包括一種不透水的支持體，該支持體上有一個檢測區；其中檢測區包括一種含有不溶于水的多孔材料的樣品保留層和一種含有水溶性聚合物的粘合層，且其中試劑組分存在于樣品保留層和粘合層中的至少一層中。


圖1是本發明測試片的檢測區和周圍區的一個截面圖，其中參數1表示樣品的保留層，參數2表示粘合層，參數3表示不透水的支持體，和參數4表示基底膜。
圖2是用本發明測試片進行鎂的光學測定的一個標準曲線。
圖3表示用在發明測試片測定鎂時共存鈣的干擾。
圖4表示本發明測試片的儲藏穩定性。
盡管用OCPC測定鈣或鎂的技術是一種已經公知的方法，但是對鎂進行的特殊測定使用OCPC和BAPTA的組合物還是一種在現有技術中沒被發現的技術。本發明人已經發現當用OCPC以及作為鈣掩蔽劑的BAPTA制備測試片時，不需降低鎂的測定靈敏度，就完全可以避免鈣的干擾。
由于OCPC和BAPTA都是二價金屬的螯合劑，所以它們與鎂和鈣都形成螯合物。然而，OCPC具有的對鎂的整合作用穩定常數比BAPTA所具有的更大，且BAPTA具有的對鈣的螯合作用的穩定常數比OCPC所具有的更大。應用這一原理，通過一種OCPC和BAPTA的特定組合物已經完成了本發明。
由于主要用光學法來測定干測試片，所以在檢測區的背景值較低是當然優選的。含有OCPC的本發明測試片具有極低的背景值，在制備一種測試片的過程中，甚至大量加入它時，反應前它就具有淡粉紅色。因此，可以制成一種具有較高準確度的測試片。
因為pH值變高(因為堿性變強〕，所以用OCPC進行鎂測定的靈敏度變高。此外，甚至在沒有鎂存在的情況下，當變成堿性時，OCPC也可以顯色。由于下面的一個難題，還沒有把加工成的干測試片付諸實際應用，這一難題就是當調整至強堿性端以便增加靈敏度時，背景值變高，而反之，當調整到中性端時，靈敏度降低。然而，通過用一種能夠將反應系統調整到pH為8.5至11.0的緩沖劑，不需降低靈敏度就能獲得一種具有低背景值的測試片，這能同時防止制備過程中因空氣含有的二氧化碳而導致的pH值降低。
人們還已知，當用包括OCPC的一般螯合反應系統測定生物體液〔諸如血清或血漿樣品〕中的鎂時，測定會受到樣品中的蛋白質〔特別是白蛋白的干擾。由于白蛋白吸收鎂的特性而導致的這一現象不會產生實際問題，因為在血清或血漿中白蛋白所吸收的鎂的部分有一個幾乎是恒定的比例，約是30％，從而用一種簡單的數值處理就可以消除它。
然而，當樣品具有一種極低或極高的白蛋白水乎時，在有些情況中不能忽略這樣的干擾。通過向反應系統中加入一種具有蛋白質變性功能的離子型去污劑，本發明已經能夠防止和避免大量受檢測樣品〔包括具有極低或極高白蛋白水平的樣品)中的偏差。
本發明中的這測試片可以在幾分鐘之內準確地測定血清和血槳中鎂的濃度，使得將它廣泛用于臨床診斷。此外，作為一種干燥型測試片，可以將它非常簡便而容易地進行操作。
當濃度不足時，因為不能在測定范國的上限周圍進行測定，所以有必要加入一種高濃度的螯合指示劑。然而，太過量的這種添加可以產生背景值。與其它螯合指示劑相比，由于甚至以高濃度加入時，OCPC也不會產生高背景值，所以它能保持測定的準確度。按檢測區的干重計，優選加入的OCPC在0.05至0.3％的范圍內，更優送在0.07互0.15％的范圍內。檢測區能干重意思是含有試劑組分，樣品保留層和粘合層的檢測區的干重。
對于所預計的鈣的濃度來說，可以加入足量的BAPTA。在血清或血漿樣品的測定中，按檢測區的干重計，優選BAPTA的用量是0.3至5.0％，更優選0.5至1.5％。
在這類的測試片中，pH緩沖劑可以選自常規使用的公知緩沖劑，條件是將它在pH8.5至11.0的范圍內使用并且當干燥時組分不會蒸發。pH緩沖劑的實例包括硼酸-氫氧化鈉緩中劑，碳酸氫鈉-碳酸鈉緩沖劑，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖劑，CHES緩沖制和CAPSO緩沖劑。盡管當pH值在8.5至11.0的范圍內時足以實現鎂的測定，但是pH的范圍可以優選9.5至10.0。按檢測區的干重計，可以使用的緩沖劑的濃度優選0.3至5.0％，更優選1.0至3.0％。
用于本發明干測試片中的不透水支持體是一種表面不光滑的白色薄膜，它含有一種塑料，諸如聚對苯二甲酸乙二醇酯，聚苯乙烯或類似物，它具有的厚度是50μm至1mm，優選100μm至300μm。
檢測區包括一種水溶性粘合層和一種含有不溶于水的多孔材料的樣品保留層，它們疊加在不透水的支持體上。
如果粘合層含有試劑組分，那么在生產檢測區時，通過將試劑組分均勻涂布在支持體上來制備粘合層，因比，當將樣品保留層進行疊加時，它用作一種粘合劑，并且在測定時，它還可以作為一種保持均勻顯色的層。
因為所測定的樣品是生物體液，諸如血清、血漿及類似物，所以將一種水溶性聚合物用作粘含層的材料，可以將所述的水溶性聚合物進行選擇，條件是它基本上不含鎂和鈣。它的實例包據聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮。可以將這些材料以一種具有適當粘性的涂漬溶液的方式加入。在材料是聚丙烯酰胺的情況下，涂漬溶液的濃度是4至6％，或在材料是聚乙烯吡咯酮的情況下，涂漬溶液的濃度是10至15％。用于適當粘性調整中的聚合物濃度在0.5至20％的范圍內變化很大，優選5.0至10％(干燥后)，這取決于它的種類。上述粘合層中可以不包括試劑組分并且僅在下述樣品保留層中包括飽和形式的試劑組分。
將樣品保留層在應用時用來均勻地展開試劑表面上的樣品，而當與試劑反應時用它來保留樣品并將反應后的試劑置于光學上可檢測到的條件中。作為用于樣品保留層中的不溶于水的多孔材料，在洗滌和干燥后，如果必要，可以使用含有纖維素的濾器或膜濾器，含有天然或化學纖維的纖維素衍生物或玻璃纖維或紡織材料。在優選的實例中，將濕或干的紡織材料〔諸如一塊布)壓制并疊加在粘合層上。如果是干燥的材料，按樣品保留層的重量計，它的百分比占檢測區的65至95％，優選75至85％。
用已在美國專利3,992,158、4,042,335和4,258,001中公開(例如〕的公知的涂漬法，可以在不透的支持體上均勻地涂漬粘合層的涂漬溶液，所涂漬的厚度范圍是50至300μm，優選100至200μm。通過噴40℃至60℃的熱空氣而將這樣涂漬的粘合層進行干燥。
當將樣品保留層疊加在粘合層上時，有時可以將粘合層中的試劑組分連同聚合物一起轉入樣品保留層中，使得在有些情況下，在本發明所定義的檢測區中兩層都不能明顯地相互分離。
在任何情況下，檢測區中的樣品保留層和粘合層兩者都可以含有本發明中所用的OCPC和BAPTA和pH緩沖劑的組合物。
根據本發明，當制備一種用于測定鎂的濃度的干燥試劑時，通過進一步加入一種離子型去污劑可以獲得一種具有高性能的測試片，所述的離子型去污劑使蛋白質變性，從而避免了血清或血漿中白蛋白的影響。離子型去污劑的實例包括作為陰離子去污劑的十二烷基硫酸鈉和作為陽離子去污劑的十四烷基三甲銨溴化物，但是對于本領域技術人員來說，顯然可以使用任何其它的化合物.條件是它是一種具有類似功能的離子型去污劑。按檢測區的干重計，離子型去污劑的濃度優選0.3至20.0％，更優選5.0至15.0％。
可以向檢測區中加入其它組分，諸如一種用于掩蔽金屬(不外乎是鈣)的氰化物化合物和一種金屬螯合指示劑的穩定劑，但在本發明的干燥試劑組合物中，這些附加組分不見持別需要的。
將這樣獲得的本發明干測試片檢測區的原片插入一種小片中并將它粘合在一種可以用手指固定的基底膜上，從而獲得一種用于測定鎂的測試片。截面圖在圖1中表示(1樣品保留層；2粘合層，3不透水的支持體；4可以用手指固定的基底膜)。由于基底膜4僅是一個手柄，所以它不是本發明的主要組成部分。通過將檢測區的原片插入一種條狀物中可以獲得沒有基底膜的本發明測試片。
將合適量的液體樣品應用在測試片的檢測區上，并且從檢測區端或支持體端測定反應完成后的反射率(當從支持體端測定時，主要是支持體和手柄的材料是透光性的〕。在接近OCPC和鎂的螯合物的吸收峰的較長處測定反射率，優選在565至575nm處。
通過在恒定水平時控制所用液體樣品的體積、反應溫度和反應時間，可以進行高準確度的測定。
現在參照實施例來更進一步的解釋本發明，但不應理解成認為它們用來限制本發明。
實施例粘合層涂漬溶液的制備〔配方〕鄰甲酚肽配位酮1.50mmol/1％(Dojinkagaku〕O，O’-雙〔2-氨基苯基〕乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸四鹽16mmol/l(Dojinkagaku)硼酸鈉緩沖劑〔pH9.5〕300mmol/l(Wako Pure Chemical)十二烷基硫酸鈉 10.0％〔w/w〕(Wako Dure Chemical)10％丙烯酸胺〔聚合物〕 5.0％〔w/w〕(Nakalai Tesque)檢測區原片的制備將這樣制備的溶液以120μm的厚度(濕態〕涂漬在一種白色聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜上，該薄膜具有的厚度是200μm，通過噴45℃的熱空氣15分鐘表進行干燥。
向這種薄膜上加壓粘合一塊約250μm厚的紡織材料，所速的紡織材料已經用0.1％TritonX-100〔Nakalai Tesque〕的水溶液進行了均勻濕潤，接著用噴45℃熱空氣的方法干燥15分鐘。
干燥后檢測區原片每1M含有下列組分。鄰甲酚酞配位酮 94.3mg〔0.09％〕O，O’-雙〔2-氨基苯基〕乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸四鉀鹽1.21g〔0.08％〕硼酸 2.23g〔1.80％〕氫氧化鈉 0.74g〔0.78％〕十二烷基硫酸鈉 1.20g〔10.85％〕丙烯酰胺 6.0g〔0.71％〕TritonX-100143mg〔0.03％〕紡織材料 120g〔84.86％〕括號內的數值代表按檢測區干重計的％。測試片的制備通過下述方法將這樣獲得的檢測區原片插入一種5mm×7mm的小片中并將它制成一種測試片，所述的方法是用一種壓敏粘合劑的雙面涂層膠帶將檢測區的原片粘合在一種白色聚對苯二甲酸乙二醇酯基底薄膜上端，所述的基底膜用作一種具有0.5mm厚的條形(5mm×80mm)手柄。將這一階段處的檢測區和周圍區的載面圖在圖1中表示。測定過程將由Kyoto Dai-ichi Kagaku Co·Ltd制造的臺式反射率測定儀SPOTCHEM@SP4410用作測定儀器。將測試片放在控制在37℃的儀器臺上面，然后在測試片上使用5.0μl的血清樣品，在預定的一段時間后，在575nm的波長處測定樣品的反射率〔R〕。將反射率〔R〕用Kubelka-Munk公式換算成k/s值。
*Kubelka-Munk公式K/s＝〔1-R〕2/2R通過測定已知濃度的樣品來事先繪制k/s值-鎂的濃度標準曲線。該標準曲線在圖2中表示。用這種曲線計算出每份樣品中的鐵的濃度。在各次操作間再現性的評價為了評價本發明測試片在各次操作間的再現性，取三份血清樣品，分別是低濃度〔樣品〕，常規濃度〔樣品2〕和高濃度〔樣品3〕，將每份樣品都連續測定12次。如表1中所示，每份樣品中的偏離系數〔CV〕都是3％或更低。
表1樣品1 樣品2 樣品3Mg(mg/dl) 1.52 2.05 5.091 1.52.05.12 1.52.15.23 1.52.05.14 1.52.15.15 1.62.15.06 1.52.15.07 1.52.05.18 1.52.15.09 1.52.15.110 1.52.25.111 1.52.15.212 1.42.15.0AVG(mg/dl)1.50 2.08 5.08STD(mg/dl)0.043 0.058 0.072CV(％) 2.84 2.77 1.41共存鈣的干擾、為了證明本發明測試片對鈣的干擾的耐受性向常規和高鎂濃度的血清樣品中加入不同量的鈣，并檢驗對鎂的測定值的影響。如圖3中所示，這種測定完全不受最高達20mg/dl鈣的干擾。儲藏穩定性的證明將本支明的測試片與一種干燥劑一起密封在玻璃瓶中并在冷凍條件〔4℃〕下進行保藏以檢驗穩定性。在圖4中所示的一段時(開始階段和6，12和18個月)后，用這樣保藏的測試片測定常規和高鎂濃度的血清樣品，每份樣品都測6次。如圖4中所示，很難觀察到靈敏度的改變，它證明本發明的測試片是相當穩定的。
因此，如上具體所述，根據本發明，可以獲得在血清和血漿樣品中快速并干燥測定鎂中使用的干測試片，它在整個測定范圍內具有極好的測定準確度，它表現出較低的背景值，它不受共存的鈣的干擾，它具有較高的儲藏穩定性并且可以簡單而容易地操作。
盡管本發明已經參照它的特定實施例作了具體描述，但是對于一個本領域技術人員來說，顯然可以在其中做各種變化和修改，而不會脫離它的內容和范圍。
本申請以在日本提出的Hei8-112908號申請為主，將其內容引入本文中作為參考。
權利要求
1.一種用于測定生物體液中鎂濃度的干測試片，它包括下列〔i〕至〔iii〕的試劑組分〔i〕鄰甲酚酞配位酮；〔i 〕O，O’-雙(2-氨基苯基〕乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸；和〔iii〕一種pH為8.5至11.0的pH緩沖劑。
2.如權利要求1中所要求的測試片，它還含有一種離子型去污劑作為試劑組分〔iv〕。
3.如權利要求2中所要求的測試片，其中離子型去污劑選自由丁二烷基硫酸鈉和十四烷基三甲銨溴化物組成的物質組。
4.如權利要求1中所要求的干測試片，其中干測試片包括一種不透水的支持體，該支持體上有一個檢測區；其中檢測區包括一種含有不溶于水的多孔材料的樣品保留層和一種含有水溶性聚合物的粘合層；且試劑組分存在于樣品保留層和粘合層中的至少一層中。
5.如權利要求4中所要求的測試片，其中干測試片還含有一種離子型去污劑作為試劑組分〔iv〕。
6.如權利要求5中所要求的測試片，其中離子型去污劑選自由十二烷基硫酸鈉和十四烷基三甲銨溴化物組成的物質組。
7.如權利要求5中所要求的測試片，其中按檢測區干重的百分比計，試劑組分、水溶性聚合物和不溶于水的多孔材料具有下述比例鄰甲酸肽配位酮0.05至0.3％；O，O’-雙〔2-氨基苯基)乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸0.3至5.0％；pH為8.5至11.0的pH緩沖劑0.3至5.0％；離子型去污劑0.3至20.0％；水溶性聚合物0.5至20％；和不溶于水的多孔材料65至95％。
全文摘要
一種用于測定生物體液中鎂濃度的干測試片，它包括下列[i]至[iii]的試劑組分鄰甲酚酞配位酮；[ii]O，O’-雙[2-氨基苯基]乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸；和[iii]一種pH為8.5至11.0的pH緩沖劑。
文檔編號G01N33/52GK1168977SQ97109679
公開日1997年12月31日 申請日期1997年3月27日 優先權日1996年3月29日
發明者古田仁志, 吉田真三, 吉岡潤治, 蘆田久 申請人:株式會社京都第一科學