專利名稱：：抗體生產的檢測的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗體生產的檢測，特別是涉及借助于修改的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測與感染或接種等反應時血液樣品中的主動抗體合成。ELISA長期用于檢測和測定抗體(或抗原)。最常見的是，ELISA用作血清學試驗，但也用于研究抗原或抗體的免疫化學特征，例如，經常發現將它應用于評價和鑒定免疫反應，在雜交瘤技術等中經細胞培養研究抗體生產。由于其靈敏性，簡單性及操作的簡便和快速，該技術已廣泛用作診斷工具且現在常規用于臨床實驗室以檢測感染或接種后血清或血漿中抗感染原的抗體。因此，例如，HIV感染的許多試驗取決于使用常規ELISA試驗檢測血清或血漿中抗該病毒的抗體。然而，由于這種簡單的血清學ELISA試驗僅僅測量了樣品中靶抗體的存在，它不能區分與抗原反應的進行中的抗體合成與感染后或經被動傳遞等已經存在的抗體。同時在有些情況下，可足以簡單地獲得關于抗體存在的信息，在其它情況下需要能確定檢測的靶抗體是否是在試驗時，例如在接種過程中或在嬰兒感染的診斷中由淋巴細胞急性合成的以區別被動傳遞的母體抗體。這在傳統的ELISA方法中不能實現。因此已建立了其它方法，使得能夠檢測進行中的抗體合成。可具體提及的有酶聯免疫斑點(ELISPOT)試驗(也稱為斑點ELISA或ELISA斑點試驗)，例如由Czerkinsky等在《ELISA和其它固相免疫試驗》，D.M.Kenneny和S.J.Challacomb編輯，1988，第10章217-239中所作的綜述。基于ELISA方法，該技術能計數分泌抗一種或多種靶抗原的抗體的淋巴細胞。ELISPOT基本上是ELISA方法的一種變化，其中經過培養在用靶抗原覆蓋的特別修飾的ELISA孔中的淋巴細胞并經過用在分泌細胞周圍產生有色沉淀(斑點)的酶底物復合物取代標準ELISA試劑顯示分泌抗體的細胞(ASC)。然后計數斑點得到生產抗體的細胞數測量值。在體外培養期間，蛋白質合成抑制劑可包含于培養基中以證實檢測到的斑點是由于從頭抗體合成引起。已證實ELISPOT技術在研究體液免疫反應的動態中非常有用，且已用于檢測免疫過的受試者外周循環中瞬時出現的自發ASC，該方法的某些特征限制了其在臨床診斷情況中的應用。首先，由于對每個樣品需要計數單獨的斑點，這是費時且費力的，因此該方法不特別適合于分析大量的樣品，如在臨床診斷實驗室中的樣品。第二，在每個樣品中僅計數分泌抗體的細胞數，一般來說，這需要合理大小的樣品體積例如，幾毫升。ELISPOT板也較昂貴且該試驗不易于自動化。由此可見，盡管在抗體檢測技術上有進展，但仍需要一種簡單，快速且實施時花費有效的試驗，它能可信地精確定量自發分泌的抗體，能區分從頭抗體合成，特別是能在血液樣品上實施以達到診斷目的。本發明闡述了該需要。因此，在一個方面，本發明提供了一種在血液樣品中檢測與靶抗原反應的主動抗體生產的方法，所說的方法包括在蛋白質合成抑制劑存在和不存在時，在允許淋巴細胞生產和分泌抗體的條件下，將所說的樣品或另選從所說樣品中直接分離的淋巴細胞的等分試樣與固相接觸；檢測溶液中與固相上所說的抗原結合的抗體；及在蛋白質合成抑制劑存在或不存時比較所說的抗體結合，從而獲得與所說的抗原反應的主動抗體分泌的測定量。本文使用的“主動抗體生產”指由樣品中淋巴細胞生產的自發分泌的抗體，該淋巴細胞在試驗過程中作為主動進行免疫反應的結果而主動產生抗體。在所有情況下該抗體指本發明的試驗方法前或期間存在于體內但不存在于體外的抗原。本文使用的短語“與所說抗原反應的主動抗體分泌”試圖指與在該試驗中使用的抗原結合的主動分泌的抗體，盡管使用的抗原可以不是開始刺激免疫反應的免疫原。因此，該試驗中所用的抗原和在體內已刺激和正刺激抗體生產的免液原由于其相同或非常相似的抗原決定簇可能都結合待檢測的抗體，在其它方面抗原和免疫原可以是不相同的。因此，本發明的方法中使用的抗原可以是含有相關免疫原全部或一些部分的物質，例如，來自感染的個體，或從相同或相似材料純化的部分，同樣抗原可經合成來制備，例如，經化學合成或重組表達比天然抗原增加或缺少部分的抗原。因此，可使用融合蛋白質或僅表達合適抗原決定基(或簇)的分子。一般來說，本發明的方法涉及在允許淋巴細胞產生和分泌抗體的條件下培養與合適的固體表面接觸的血液樣品中的淋巴細胞以固定待檢測的抗體，然后回收細胞，并檢測抗體與固相上抗原的結合。經過比較在蛋白質合成抑制劑存在或不存在時檢測的抗體結合水平，可區分和定量從頭抗體合成。令人驚奇的是，本發明的方法允許使用較小的血液樣品體積(例如，μl體積，不超過1ml)，直接檢測未刺激的淋巴細胞的自發抗體生產，而不用在與固相培養前預培養淋巴細胞的前面步驟。換句話說，樣品的淋巴細胞直接用于本發明的試驗方法而不經過任何預處理或刺激，例如，經抗原體外刺激。從而可檢測取樣時淋巴細胞分泌的抗體。以這種方式，即使使用這種較小的樣品體積，也能具有優勢地將與試驗抗原反應的自發進行的抗體合成與淋巴細胞的旁觀者激活區分開。也分析了不刺激細胞引起任何記憶時它們自發分泌抗體的情況下的淋巴細胞。這與其它所公開的利用體外抗原刺激以增強試驗靈敏性的方法成對比。另一方面，本發明利用自發抗體分泌允許檢測指示試驗抗原正在進行的感染的血液中的抗體；在感染或接種等后的前幾周，血漿淋巴細胞分泌抗試驗抗原的抗體。以本發明的方法檢測該抗體使人們能夠診斷或測定該感染或監測與接種反應的抗體等。這在嬰兒和新生兒中特別有用，其中區分新合成的抗體與被動傳遞的母體抗體是重要的。可在分開的試驗中或在使用多個相關抗原的相同試驗中分析相同的血液樣品中抗一些不同的感染原的抗體。從而允許使用與病人存在的臨床癥狀一致的有關接觸抗原。在診斷感染中，區分正在進行的抗體合成與因以前感染已經存在的抗體也是重要的。經體外抗原刺激引起免疫記憶與試圖鑒定正在進行的急性感染的試驗不一致，因此以前基于抗原刺激的方法不具有這種優勢。另外，包括抗原刺激的步驟可能減少本發明的試驗的有利性時間因素，與
背景技術：
的方法相比，本發明的方法操作非常快。根據本發明的方法檢測的抗體所針對的抗原包括細菌和病毒抗原。臨床上重要的抗原包括但不限于來自諸如單純皰疹病毒，巨細胞病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)和任一肝炎病毒的抗原。該抗原的檢測可用于迅速確定病人是否被感染，例如用于血液篩選目的或用于確定和/或監測感染。由于其簡單性，該方法特別有用，且當不能得到復雜的設備時，例如在野外情況下可使用。本文使用的術語“檢測”和“測定其量”包括抗體生產水平的定量和定性測定，其意義為獲得樣品中所產生的抗體總量的絕對值，也包括抗體生產水平的指數，比率，百分數或相似指標以及半定量或定性測量。本發明的主要優勢是僅需要較小的樣品體積，例如50-500μl，優選100-300μl，且通常是100-200μl血液或可與全血來源體積相比的血產物，它與一般依賴幾毫升體積血清的傳統診斷試驗成對比。這在從新生兒取血樣的情況中特別有用，因為本發明的方法僅需要μl體積。可直接使用血液樣品，一般是外周血液樣品，盡管可優選首先從樣品中分離淋巴細胞。這可使用本領域熟知的標準技術進行。因此，例如，可常規使用各種全血制品，如加有肝素的血液，加有EDTA的血液等，如臨床實驗室所常規制備的。盡管不是必需的，存在于樣品中的紅細胞可被裂解，例如，經過使用短期接觸蒸餾水或氯化銨的常規方法，或經過使用其它熟知的溶血技術。可預料到所有富集或純化的制品必須含有存在于產生制品的全血中的淋巴細胞以便檢測自發性抗體生產。如果需要，可分離淋巴細胞，例如使用標準淋巴細胞分離培養基，如Lymphoprep(NyegaardCo.Oslo，Norway)，或使用免疫磁性分離(IMS)或相似的以固相為基礎的分離系統或其它常規技術。在IMS或相似分離技術的情況下，固相，例如用對某些類白細胞具有特異性的抗體覆蓋的磁珠可用于選擇性地分離有用的淋巴細胞。如果使用分離的淋巴細胞，這些細胞在使用前可使用標準的洗滌方法進行洗滌。然而已觀察到，充分洗滌細胞是不必要的。事實上，經過不充分洗滌，可提高細胞的可利用率且加速該方法。如果需要，按上述處理的血液樣品或分離的淋巴細胞然后按常規與攜帶合適結合配體的固相接觸以固定待檢測的一種或多種抗體。通常結合配體是被待測的一種或幾種抗體識別的試驗的一種或幾種抗原。在一個實施方案中，本發明因而提供了一種檢測血液樣品中活性抗體生產的方法，所說的方法包含在存在和不存在蛋白質合成抑制劑時將所說樣品或另選直接從所說樣品中分離的淋巴細胞的等分試樣與攜帶被待檢測的一種或多種抗體識別的一種或多種抗原的固相接觸；在溶液中檢測抗體與所說抗原的結合；且比較在存在或不存在蛋白質合成抑制劑時所說的抗體結合，由此獲得與所說抗原反應的主動抗體分泌的測定量。也可使用另外的結合配體，例如，識別和結合待檢測的抗體的蛋白A，蛋白G或抗體。在后一種情況下，不需要高度特異性的結合，因為在本試驗方法的該實施方案中經過隨后接合特異性地結合待測抗體的抗原而導入了特異性。從而在所有實施方案中產生了特異性抗原-抗體復合物。在本發明方法的檢測步驟中，確定固定于該固相支持物上的該復合物的存在。該固相可以是任意熟知的支持物或通常廣泛使用的或建議用于固定，分離等的基質。它們可以采用顆粒，片狀，凝膠，濾膜，膜或微量滴度條，管或板等的形式且通常可由聚合體材料制成。然而，為了易于操作和簡單，通常使用標準微滴度板和孔，優選標準ELISA平板。固相也可修飾成允許檢測對某一范圍內的不同抗原具有特異性的抗體。因此，例如，合適的固相材料如硝酸纖維素等的盤或條等可用不同抗原覆蓋，并同時加入不含任何接觸抗原的微滴度孔或其它合適的裝置中。然后可用結合抗體的檢測方法區分不同的抗原。可使用分別用與某些臨床癥狀或綜合癥一致的相關抗原覆蓋的一系列盤來鑒定哪一種猜想的病原體引起該疾病。然后在分開的孔中分別處理這些盤。這是一種特別節省材料的方法，因為可使用同樣小的血液體積進行試驗以同時測定許多不同的抗原(來自相同感染原或來自各病例中與臨床綜合癥或癥狀相關的不同病原體)。另一方法是使用存在于不同孔中的多個血液樣品，各孔用不同的結合配體例如，抗原或抗體，覆蓋從而進行試驗。將結合配體，例如抗原結合到固相上的技術也是非常熟知的并在文獻中有廣泛的描述。許多標準抗原覆蓋程序在例如《ELISA和其它固相免疫測定，理論和實踐方面》，1988，D.M.Kemeny和S.J.Challacombe，JohnWiley和Sons編輯中描述。如果需要，可使用標準技術再洗滌和封閉開板。經過在含有結合配體，例如濃度為0.01至150μg/ml蛋白的合適緩沖液，例如，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中4℃培養平板過夜，接著使用合適的封閉培養基(一般是一種細胞培養基)封閉并在例如37℃下培養1至5小時可簡單地用結合配體覆蓋標準微滴度平板，例如ELISA板。去掉封閉溶液后，平板即可使用。然而，通常情況下，實施本發明方法所需的物質可以試劑盒的形式提供，其中提供的固體支持物已用結合配體覆蓋并適當封閉。如上所述，接觸步驟一般包含在固相存在時，在允許抗體合成和分泌的條件下培養樣品或分離的淋巴細胞。通常情況下，可使用標準ELISPOT培養條件，如Czerkinsky等1988(出處同上)所述。一般來說，當培養細胞的培養基依賴于CO2作為部分緩沖系統時，樣品或細胞在37℃下在含5％CO2的空氣中培養。也可使用不依賴CO2的培養基，其中實施另一緩沖系統，例如使用熟知的HEPES組份的培養基。在這些例子中，細胞簡單地在37℃培養，從而進一步簡化了該試驗及其對復雜的設備的需要。培養時間可以變化，但一般需要至少1-2小時。已發現2至6小時的培養時間，例如2到4小時產生較好的結果，盡管在某些情況下可能需要更長的培養時間，例如高達12或24小時或過夜。合適的培養基是本領域熟知的且包括許多標準細胞培養基，例如，Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)或RPMI或使用HEPES作為不依賴CO2的緩沖系統，含合適的血清，例如胎牛血清(FCS)或按需要加入其它成份例如谷氨酰胺的熟知的細胞培養基。培養基中選擇的添加成份可包括抗生素，例如，慶大霉素，青霉素，鏈霉素等，其它氨基酸，生長因子等。在接觸步驟前可能需要稀釋樣品/細胞懸液，可使用常規的細胞/樣品稀釋范圍。一般使用培養基作稀釋劑進行稀釋。為了區分正在進行的抗體合成，在蛋白質合成抑制劑存在和不存在時進行培養。因此，培養前，向部分樣品細胞等分試樣中加入抑制劑以阻止蛋白質(也即抗體)的合成，部分不加抑制劑進行培養。可使用任何常規已知的蛋白質合成抑制劑，例如，亞胺環己酮。可使用10-5000μg/ml的濃度，例如50-500μg/ml亞胺環己酮。還優選包括諸如疊氮化鈉的ATP酶抑制劑或其它與蛋白質合成抑制劑相似的抑制劑以便迅速且完全終止細胞代謝。培養后，從固相上去掉樣品/細胞。這一般可經過使用合適的介質，例如諸如PBS的緩沖液洗滌來簡單地實現。然而已發現不需要充分洗滌。然后以固相進行檢測抗體結合的步驟。關于讀取信號而言，檢測步驟在溶液中發生。可使用檢測抗體結合的任何已知方法，只要能產生溶液中的可讀信號，例如，依靠熒光，化學發光，比色或產生可檢測信號的酶反應。然而，通常使用免疫測定作為檢測方法，優選酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。免疫測定，特別是ELISA的技術是本領域中熟知的并已在文獻中描述(例如見《ELISA和其它固相免疫測定，理論和實踐方面》，1988，D.M.Kemeny和S.J.Challacombe，JohnWiley和Sons編輯)。去掉樣品/細胞后，例如在ELISA檢測方法中可加入酶-抗體連接物，它結合與固相上的抗原結合的抗體。同樣，如果待測抗體經結合配體，例如，經過抗不同種類的抗體的一種抗體非特異性地結合于固相上，則可加入酶抗原連接物，它將特異性地結合待檢測的固定抗體。然后加入一種酶底物以形成可檢測的信號。在本發明中，常規使用可溶性底物，在溶液中產生可檢測的信號。這具有優勢，因為它利于且簡化了對大量樣品的處理和加工，允許估測抗體生產，盡管如上所述，絕對定量是不必要的，但如果需要，可獲得定性或半定量結果。為了方便，可選擇產生分光光度術上可檢測的信號的底物，它可以經過閱讀吸光率簡便地讀數，例如，使用標準ELISA平板閱讀器。事實上，可使用標準ELISA試劑，其優勢在于能使本發明的試驗與現存方法和常規用于臨床實驗室的技術相配伍。然而，可使用其它的檢測/信號產生系統，經熒光，化學發光等產生可檢測的信號。免疫-酶放大方法也可用于增強信號和增加靈敏度，例如，使用抗生物素蛋白-生物素方法，如Extravidin系統可從Sigma獲得。生物素標記的二級抗體與過氧化物酶抗生物素蛋白復合物結合用作ELISA試劑。由于一個抗生物素蛋白分子能結合幾個生物素分子，使用抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復合物增加了過氧化物酶分子的表面濃度，使該方法產生更大靈敏性。細胞培養(接觸)步驟和結合抗體的檢測步驟所需的物質和工具也可按常規以試劑盒的形式與結合配體覆蓋的固相一起提供。可使用其它試驗方法補充本發明的試驗所獲得的信息。在傳統的ELISA試驗中可獲得對以前存在的血清/血漿抗體的其它有用的數據。另外，從血液樣品中分離淋巴細胞后，在進行這一步時，可使用本發明的試驗中所用的相同的結合配體覆蓋的固相將剩下的血漿液體用于檢測以前存在的抗體。為了保證本發明的試驗方法可信地實施，可包括合適的對照。首先，比較蛋白質合成被抑制的孔與未抑制的孔可保證本發明記錄下了試驗細胞的精確的抗體生產而不僅僅是記錄了外周血以前存在的抗體。在使用純化的淋巴細胞制品作樣品的例子中，可保證淋巴細胞樣品中來自外周血的痕量截留抗體不會影響試驗。其次，為了確定從抑制和未抑制的孔中的信號所記錄的差別不是由于偶然和非特異性地(旁觀者)激活淋巴細胞，可使用陰性對照抗原。該抗原可以是來自很可能引起病人急性疾病的感染原，例如，破傷風類毒素。該旁觀者激活的淋巴細胞數目無論如何在所有情況下都遠低于使用本發明的方法產生陽性試驗結果所需要的數目。本發明的設計考慮到了這一點。如上所述，由于其操作簡便和快速及其簡單性，本發明的試驗使其具有診斷或其它臨床或獸醫用途，例如，魚類養殖。除了較小的樣品體積外，另一個優勢在于僅需要一個樣品，而不必象大多數常規血清學試驗所要求的以2到3周間隔取血清對。不需要復雜的儀器，且該試驗易于自動化。另外，如果需要，可能易于試驗不同的免疫球蛋白同模標本。本發明的上述試驗方法提供了一種經過分析抗限定抗原的特異性抗體的自發表達來評價正在進行的感染的存在或程度的方法。很清楚該方法可應用于確定已知的疾病癥狀，且其中與有關免疫原相關的抗原可獲得，從而提供了一種感染的特異性標記。然而在一些臨床情況中，不能鑒定具體的疾病或感染，和/或合適的抗原不能獲得以用于該試驗。在這些情況下，該試驗可修改成評價感染的非特異性指示物的存在或程度。因此，例如，含淋巴細胞的樣品，例如全血或由其純化或富集的淋巴細胞制品可檢查其感染標記，例如，細胞因子或干擾素，例如γ-干擾素的生產。因此，從本發明的另一個方面來看，提供了一種檢測血液樣品呂非特異性感染指示物存在的方法，所說的方法包含在蛋白質合成抑制劑存在和不存在時，在允許淋巴細胞生產和分泌感染指示物的條件下將所說的樣品或另選從所說的樣品直接分離的淋巴細胞的等分試樣與固相接觸；檢測溶液中感染指示物與固相上結合的配體的結合；且比較在存在或缺乏蛋白質合成抑制劑時所說的感染指示物的結合，從而獲得所說樣品中感染指示物的測定量。為了實施該方法，可提供具有合適的捕獲分子(例如抗檢測的感染指示物的抗體)的固相。為了檢測固定于固相上的所說的感染指示物的存在，可使用上文所述的方法，例如經過使用標記的抗體或配體。在該方法中，經過選擇合適的固定基團或檢測分子可鑒定特定標記。因此，例如，樣品中的所有蛋白質可固定于固相支持物上并使用標記的特異性抗體或配體進行檢測。另外，特異性的結合配體可用于固定恰當的感染指示物，然后可以陽性或陰性合適地標記指示物，例如在前一種情況下，經過與存在于感染指示物上但對該分子不專一的區域結合，或在第二種情況下，經過標記固相上未結合的結合配體來進行。實施該方法的試劑盒也形成本發明的一個部分。現在參考下面非限制性的實施例更詳細地描述本發明，其中本發明的試驗方法稱為血漿急性試驗(Plasmacuteassay)。實施例1一般方法細胞在接種后的不同時間從接受滅活流感疫苗的自愿者取肝素處理的血液。血液與等體積的PBS混合物。用Lymphoprep(Nyegaard&Co.Oslo)分離淋巴細胞。細胞在PBS中洗滌2次，重懸于(稀釋)補充了20％FCS，2mML-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Pen+Strep)的Dylbecco氏修飾的Eagle氏培養基＝MEDIUM中。終止溶液在含10％疊氮化鈉的PBS中配制1mg/ml的亞胺環己酮。ELISA和流感抗原從用于臨床試驗的流感疫苗的3個病毒株(本文簡稱為H3N2，H1N1和B)純化表面抗原。ELISA板GreinerEIA平板655001F-型或CostarEIA板3590。用10μg/ml蛋白的PBS溶液以100μl/孔在4℃覆蓋過夜。在室溫下用MEDIUM封閉1小時。用PBS洗滌一次。試驗對于3個流感抗原的每一個在兩個平行組中將100μl細胞懸浮于MEDIUM中的稀釋液加入3份孔中。一組中的3個孔在起始步驟中加入50μl終止溶液進行。在37℃下在含5％CO2的空氣的培養箱中培養不同的時間。ELISA板用PBS洗滌一次，然后用含0.05％Tween20的PBS洗滌2次。加入50μl/孔的合適稀釋的免抗人Ig過氧化物酶連接物(Sigma)，室溫放置1小時。隨后使用鄰苯二胺(OPD)底物使平板顯色并在492nm下讀數吸光率。接種后11天取的血液樣品細胞培養時間；4小時，0小時＝封閉的孔細胞數H3N2H1N1B0/4小時6.6×104264/522199/490352/5270/4小時6.6×103238/290143/194331/353所有項目是三個孔中吸光率×1000的平均值，變動范圍±10％。結論6.6×104＝66,000個細胞在培養4小時時產生顯著的信號增加。H3N2吸光率上升98％，H1N1上升153％，B上升50％。這是代表性實驗。其它的試驗顯示出細胞過夜培養在封閉和未封閉的孔中產生吸光率超過1000的更明顯的區別。對于更短的培養時間，例如2-3小時，該系統也有效。對于多10倍的細胞，例如6.6×103個細胞/孔也可產生清楚的區別，但并不總能產生該區別。實施例2一般方法細胞；在接種后的第7天從接受滅活流感疫苗的自愿者取加有肝素的血液。血液與等體積的PBS混合。以Lymphoprep(Nyegaard&Co.Oslo)分離淋巴細胞。細胞在PBS中洗滌2次，重懸于加有20％FCS，2mML-谷氨酰胺，Pen+Strep的Dulbecco氏改良的Eagle培養基(如前所述)＝MEDIUM中。終止溶液1mg/ml亞胺環己酮在含10％疊氮化鈉的PBS中配制。試驗抗原純化的表面抗原來自臨床試驗中使用的流感疫苗的3個病毒株，本文簡稱為H3N2，H1N1和B。對照抗原破傷風類毒素(非鋁吸附的；Lederle)。ELISA板GreinerEIA板655001F-型，或CostarEIA板3590。用含10μg/ml蛋白的PBS溶液以100μl/孔4℃覆蓋過夜，破傷風10Lf/ml。用MEDIUM在室溫下封閉1小時。用PBS洗滌一次。試驗對于3個流感抗原中的每一個和破傷風對照抗原以2個平行組向3份孔中加入100μl懸浮于MEDIUM中細胞稀釋液。一組孔在起始步驟加入50μl終止溶液進行抑制。在含5％CO2的空氣的培養箱中37℃培養3小時。培養后，ELISA板用PBS洗滌一次，用含0.05％Tween20的PBS洗滌2次。加入50μl/孔的合適稀釋的免抗人Ig過氧化物酶連接物(Sigma)并在室溫下靜置1小時。平板隨后使用鄰苯二胺(OPD；Sigma)底物顯色并在492nm下讀數吸光率。[可經過使用1小時Extravidin/過氧化物酶步驟(Sigma)在底物前增加一個步驟來修改試驗以增強敏感性。這需要使用生物素標記的連接物來代替過氧化物酶連接物(Sigma)]。代表性實驗結果(無extravidin)接種7天后(2個受試者，#1和#2)細胞培養時間3小時，0小時＝抑制的孔。細胞數H3N2H1N1B破傷風0/3小時105#1063/410055/269206/258046/050#2045/077048/242182/207040/046所有項目是三個孔吸光率×1000的平均值，變動范圍±16％受試者是青少年(16歲)。已知年輕人對A/H1N1流感疫苗的反應特別好。從上面可清楚地看到，受試者#1和#2反應較好。然而，通常接種者對各種疫苗成份的反應不同，因此可預期吸光率的差別增加。這從受試者#1與B病毒發生微弱反應，而#2僅與H1N1病毒發生明顯的反應可得到證實。正如預期的，他們中沒有一個與破傷風類毒素發生反應。然而，如果用類毒素在體外刺激細胞幾天時間，其免疫學早期記憶(通過兒童時接種)可能導致破傷風抗體產生。在使用本發明的診斷實驗室試驗中的一個真實的感染例子中，只有一個試驗感染原/抗原產生了陽性信號。實施例3一般方法細胞在接種6天后從接受滅活的流感疫苗亞基的成人(24歲的男性)和兒童(3歲的男孩)取加有肝素的血液。按實施例1和2所述分離淋巴細胞。將細胞與實施例1和2所述的攜帶抗原H3N2，H1N1和B的固相在37℃下接觸3小時，按上面所述進行試驗(在本實驗中不使用終止溶液或對照抗原)。表1顯示了2個個體的結果，其中各抗原的讀數是三個孔中吸光率×1000的平均值。表1這些結果表明僅接受過一次早期流感抗原決定基，A/H3N2感染的年幼兒童對三種成份的疫苗中的A/H3N2成份產生非常強的免疫反應。正如對該兒童所預期的，對A/H1N1和B成份無反應。這類年幼的兒童通常需要以幾周的間隔接受2個劑量的疫苗以產生滿意的免疫反應。大約70,000個淋巴細胞(相應于大約70μl體積的全血)是以產生明顯的陽性反應。對于接受了多種流感抗原決定基的成年受試者，反應雖然不如上面強烈，但對該疫苗的三種成份都有明顯的反應，盡管程度有所變化。對于B成份，大約100,000個淋巴細胞對于產生陽性反應是必須的，而2種A成份最少需要100,000個細胞，優選200,000個細胞。實施例4以經典的和血漿急性試驗方法檢測單皰純疹2型病毒一般方法組織培養和血清學分析從具有認為是生殖皰疹病毒感染的癥狀的5個受試者生殖器取材進行常規組織培養程序以打算從樣品中檢測復制病毒(由Bergen；Haukeland大學醫院病毒實驗室進行)。使用檢測IgG和IgM的含HSV抗原的通用ELISA試劑盒(BehringerEnzygnost，Behringer，德國)在相同的實驗室對血清樣品進行常規血清學分析。淋巴細胞的分離對與醫院樣品同時取樣的具有認為是生殖皰疹病毒感染的癥狀的5個受試者的加有肝素的血液進行Lymphoprep(Nycomed)密度梯度離心分離淋巴細胞。在PBS中洗滌細胞三次并重懸于含20％FCS，1mML-谷氨酰胺，50IU/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM培養基(DMEM/FCS)中。經苔盼藍排斥(0.2％)計數活細胞。使用BehringerEnzygnost抗HSVIgM和IgGELISA的血漿急性試驗以含有用來自HSV感染的永久性猴腎細胞的抗原覆蓋的8個孔及用來自未感染的細胞的對照抗原覆蓋的8個孔的平板提供BehringerEnzygnost抗HSVIgM和IgG。用200μl/孔的DMEM/FCS在5％CO2中37℃封閉平板1小時。加入100μl/孔的適當稀釋的淋巴細胞并在37℃5％CO2中培養3小時。所有下面的程序嚴格按照試劑盒供應商提供的說明書進行。使用同一供應商提供的連接物，試劑和緩沖液使平板顯色。底物四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB)需要使用可獲得的TitertekMultiskanMcc/340平板閱讀器(Flow實驗室)在450nm下讀數OD。使用BioelisaHSV-2IgG進行血漿急性試驗以含有用滅活HSV-2抗原覆蓋的8個孔的平板提供BioelisaIgGHSV-2ELISA(BIOKIT，Spain)。平板用200μl/孔的DMEM/FCS在37℃下5％CO2中封閉1小時。加入100μl/孔的適當稀釋的淋巴細胞，37℃下5％CO2中培養3小時。所有的下面程序嚴格按試劑盒供應商提供的說明書進行。使用相同供應商提供的連接物，試劑和緩沖液對平板顯色。底物四甲基聯苯胺鹽酸(TMB)需要使用可獲得的TitertekMultiskanMCC/340平板閱讀器(Flow實驗室)在450nm下讀數OD值。使用BioelisaHSVIgM(免疫捕獲)試驗的血漿急性試驗以含有用兔抗人IgM抗體覆蓋的8個孔的平板提供BioelisaHSVIgM(免疫捕獲)試驗(BIOKIT，Spain)。平板用200μl/孔的DMEM/FCS在37℃5％CO2中封閉1小時。加入100μl/孔的適當稀釋的淋巴細胞并在37℃5％CO2中培養3小時。所有程序按廠家說明書進行。具體地說，用100μl/孔的辣根過氧化物酶標記的HSV抗原(已在人成纖維細胞中體外增殖的純化且滅活的HSV)檢測結合的抗體，為了減少非特異性反應，使用由未感染的細胞成份(以試劑盒提供)，10μlHSV抗原和10μl對照抗原/平板組成的未標記的對照抗原。平板在TitertekMultiskanMCC/340平板閱讀器中在450nm下閱讀(Flow實驗室)。實驗結果在表2中顯示。表2概括了病人1-5的數據。Haukeland大學醫院的診斷實驗室嘗試從臨床標本中分離了該病毒并使用BehringerEnzygnostELISA試劑盒也進行了血清IgG和IgM的常規ELISA試驗。注明了分離的病類型，-ve指陰性分離物。血清ELISA臨界值由試劑盒的廠家限定；+＝OD＞0.2，界線＝OD0.1-0.2，由試驗廠家定義為可疑結果，--＝OD＜0.1。對于血漿急性試驗，我們使用OD＞0.2作為陽性，并將產生該反應所必需的淋巴細胞數在表中列出。只有BioelisaIgG試驗要求鑒定HSV2抗體，而其它表示用HSV(1和/或2)感染。結果病人1具有初始HSV-2感染的臨床癥狀。在醫院試驗中未能從臨床樣品分離出病毒且經標準ELISA試驗發現無IgM。經標準醫院ELISA試驗發現臨界值的血清IgG抗體。為證實這些結果，在血漿急性試驗中發現沒有細胞產生IgM抗體。在BehringerIgG和BioelisaIgG血漿急性試驗中檢測到生產抗HSV的IgG抗體的細胞。在Behringer血漿急性試驗中產生臨界吸光率需要205000個淋巴細胞，而在BioelisaIgG中產生臨界吸光率需要103000個淋巴細胞。病人2進行初次感染，這經過以HSV-1型分離病毒得到證實。醫院實驗室未檢測到血清IgM，但檢測到IgG抗體。在血漿急性試驗中未檢測到產生IgM的細胞，而Behringer和Bioelisa血漿急性試驗檢測到產生IgG的細胞，且分別需要223000和111000個細胞。病人3具有回復HSV-2感染，這經過從臨床標本中分離出了HSV-2病毒得到證實。IgG存在于臨床癥狀發作2天后取的血清樣品中，然而此時檢測不到血清IgM。在血漿急性試驗中臨床癥狀發作2天后檢測不到IgM，而Behringer和Bioelisa血漿急性試驗檢測到產生IgG的細胞(需要48000-96000個細胞)。醫院在臨床癥狀發作20天后取的血清樣品中檢測到IgM血清抗體。在血漿急性BehringerIgM試驗中需要182000個細胞產生臨界吸光率，然而以BioelisaIgM血漿急性試驗檢測不到細胞。病人4被HSV初次感染。在送到醫院實驗室的臨床樣品中檢測不到病毒。檢測到臨界值血清IgM抗體且發現陽性水平的血清IgG抗體。使用Behringer和Bioelisa試劑盒在臨床癥狀發作后5和19(未檢測到BehringerIgM)天取的血液樣品中進行血漿急性試驗時都檢測到IgM和IgG抗體。在血漿急性試驗中，BioelisaIgM試驗需要不超過8000個細胞，BehringerIgM試驗需要60500個細胞，兩者都需要不超過100μl加肝素的血液。病人5懷疑被HSV初次感染。然而從實驗室未分離出病毒，且檢測不到血清抗體。在血漿急性試驗中檢測不到產生抗HSV的IgG或IgM抗體的細胞。討論已證實血漿急性試驗對初次和復發皰疹病毒感染均有效。在所有情況下實施血漿急性試驗至少與本文使用的傳統ELISA方法一樣好。特別是對于病人1，盡管從臨床樣品中未分離出病毒，以醫院常規試驗僅評價為臨界陽性(即，不確定)，但血漿急性試驗(BioelisaIgG和BehringerIgG)顯示出大約100,000個細胞和200,000個細胞分別產生不容質疑的陽性結果。可能該病人具有雙重感染(HSV1和HSV2)，其中從病毒分離位點只回收到HSV1。然而，這不能排除陽性HSV結果(BioelisaIgG)由血清學交叉反應引起。對于病人4的2個時間間隕樣品，從中未分離出病毒，血漿急性試驗顯示從感染早期到晚期生產皰疹特異性IgM和IgG的淋巴細胞數的變化與熟知的初次感染后的動態一致，這清楚地證實為主動免疫反應。BioelisaIgM血漿急性試驗特別敏感，在前2個樣品中需要不超過8000個淋巴細胞產生陽性信號。在本實驗中，我們顯示了血漿急性方法對人類病毒感染的臨床病例有效。實施例5多重盤-用對IgG，IgA和IgM抗體特異性的捕獲抗體覆蓋硝酸纖維素盤。實施本實驗以確定多盤系統是否能用于血漿急性試驗以檢測不同特異性的抗體。一般方法從2個健康的成年受試者抽取加有肝素的全血樣品。由于這些受試者不處于任何感染的急性期，我們打算分析與其(未知)抗原特異性無關的IgG，IgM和IgA自發性抗體分泌。受試者1用于確定使用以3種不同抗原覆蓋的盤系統是否能用于血漿急性試驗的單個孔中。一個孔(No.1)。受試者2用于確定在存在許多用相同抗原覆蓋的盤時是否會削弱信號。在血漿急性試驗中有3個分離的孔(孔號No.2，3和4)。淋巴細胞的分離經過對加有肝素的血液進行Lymphoprep(Nycomed)密度梯度離心分離淋巴細胞。這些細胞在PBS中洗滌3次并重懸于含20％FCS，1mML-谷氨酰胺，50IU/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM培養基(DMEM/FCS)中。以臺盼藍排斥(0.2％)計數活細胞。使用盤作為固相的血漿急性試驗具有8μM孔徑的混合酯的纖維素盤(MilliporeSCWP01300)用10μg/ml在PBS疊氮化物(0.001％)中稀釋的山羊抗人類特異性抗體(Sigma，抗-IgGI-3382，抗-IgAI-0884，抗-IgMI-0759)在室溫下覆蓋過夜。在37℃下5％CO2中用DMEM/FCS封閉盤1小時。將淋巴細胞加入到具有0.4μM孔徑的12mm清晰的穿透孔(Costar3460)中，盤放于其下面，并在37℃下5％CO2中培養3小時。將單個盤轉移到24孔平板(Costar)的分開的孔中并用PBS洗3次，用PBSTween(0.05％)洗3次。用在DMEM/FCS中稀釋的200μl/孔的山羊抗人類特異性過氧化物酶連接的抗體(SigmaIgGA-6029，IgAA-4165，IgMA-4290)檢測結合的抗體并在室溫下培養2小時。如前所述洗滌盤以去掉未結合的抗體并使用溶于0.05M磷酸鹽檸檬酸緩沖液(PH5.0)中的200μl/孔鄰苯二胺二鹽酸(OPD)(SigmaP-7288)顯色。加入底物30分鐘后，使用100μl/孔的1MH2SO4終止顯色。將100μl/孔轉移到96孔ELISA平板(GreinerEIA平板655001F-型)并在TitertekMultiskanMCC/340平板閱讀器(Flow實驗室)上在492nm下讀OD值。實驗結果在表3中顯示，其中各捕獲抗體的讀數是以吸光率×100表示的三個孔中的平均值。表3受試者1受試者2孔1孔2孔3孔4盤號抗人捕OD獲抗體(492nm)1IgG4052IgA1403IgM854IgG4105IgA1256IgM647IgG3758IgA1689IgM61細胞盤號抗人捕OD獲抗體(492nm)1IgG1482IgG1823IgG1124IgG1575IgG1426IgG1237IgG1448IgG125細胞盤號抗人捕OD獲抗體(492nm)1IgA1822IgA2023IgA2214IgA2635IgA1906IgA2097IgA1728IgA151細胞盤號抗人捕OD獲抗體(492nm)1IgM822IgM1073IgM1244IgM1455IgM1196IgM1277IgM1388IgM134細胞</table></tables>孔1含2百萬個淋巴細胞，孔2-4含1百萬個淋巴細胞。“細胞”參考是為了表明盤號位于與細胞層最近處。結果用受試者1進行的試驗表明甚至9個盤可容易地用于含淋巴細胞的孔。對3個IgG盤，3個IgA盤和3個IgM盤的反應用于與各組相同的實際目的，從而顯示了盤相對于分泌抗體的淋巴細胞的實際位置不是關鍵的。用受試者2的淋巴細胞進行的試驗表明至少8個相同覆蓋的孔可放在一個含淋巴細胞的孔中以產生實際上相同的讀數。因此，本發明允許在一個孔中對相同的淋巴細胞制品進行多個試驗。權利要求1.一種檢測血液樣品中與靶抗原反應的主動抗體生產的方法，所說的方法包含a)在蛋白質合成抑制劑存在和不存在時，在允許淋巴細胞生產和分泌抗體的條件下將所說樣品，或另選直接從所說樣品中分離的淋巴細胞的等份試樣與固相接觸；b)檢測溶液中與固相上所說抗原結合的抗體；及c)比較在蛋白質合成抑制劑存在或不存在時所說的抗體結合，從而獲得與所說抗原反應的主動抗體分泌的測定量。2.權利要求1所要求的方法，其中所說的固相攜帶一種或多種被待測的一種或多種抗體識別的抗原。3.權利要求1所要求的方法，其中所說的固相攜帶被待測的一種或多種抗體識別的一種或多種抗體。4.權利要求1至3中任意一項所要求的方法，其中用于該方法的所說的血液樣品或淋巴細胞制品具有不超過1ml的體積。5.權利要求1至4中任意一項所要求的方法，其中對新生兒或嬰兒血液樣品實施該方法以區分新合成的抗體和被動傳遞的母體抗體。6.權利要求1至5中任意一項所要求的方法，其中所說的血液樣品經過從病人直接取的血液進行純化或富集程序而獲得。7.權利要求1至6中任意一項所要求的方法，其中直接從所說樣品中分離的淋巴細胞用于該方法。8.權利要求1至7中任意一項所要求的方法，其中在權利要求1的接觸步驟前封閉固體支持物。9.權利要求1至8中任意一項所要求的方法，其中的蛋白質合成抑制劑是以50-500μg/ml濃度使用的亞胺環己酮。10.權利要求1至9中任意一項所要求的方法，其中ATP酶抑制劑用于與蛋白質合成抑制劑連接。11.權利要求1至10中任意一項所要求的方法，其中權利要求1的檢測步驟以免疫測定進行。12.權利要求11中所要求的方法，其中的免疫測定是ELISA。13.權利要求3至12中任意一項所要求的方法，其中被固定于所說固相上的待測一種或多種抗體識別的一種或多種抗原與所說的固相接觸。14.權利要求2和4至12中任意一項所要求的方法，其中識別固定于所說固相上的一種或多種抗體的一種或多種抗體與所說的固相接觸。15.權利要求1至14中任意一項所要求的方法，其中可溶性底物用于權利要求1的檢測步驟，且產生分光光度術上可檢測的信號。16.權利要求1至15中任意一項所要求的方法，其中使用陰性參照抗原。17.權利要求1至16中任意一項所要求的方法，其中檢測針對皰疹病毒的主動抗體生產。18.權利要求2和4至17中任意一項所要求的方法，其中采用分別攜帶不同靶抗原的多個固相。19.一種實施權利要求2和4至18中任意一項所要求的方法的試劑盒，包含至少一種用抗原覆蓋并適當封閉的固相支持物。20.一種實施權利要求3至18中任意一項所要求的方法的試劑盒，包含至少一種用抗體覆蓋并適當封閉的固相支持物。21.權利要求19或20所要求的試劑盒，它另外還包含至少一種下列成份a)蛋白質合成抑制劑；b)ATP酶抑制劑；c)用于檢測抗體的酶-抗體連接物；d)用于檢測抗體的酶-抗原連接物；e)、c)或d)的酶的可溶性底物；和f)陰性對照抗原，細胞培養(接觸)步驟和結合抗體的檢測步驟中所需的材料和工具。22.一種檢測血液樣品中非特異性感染指示物存在的方法，所說的方法包含在蛋白質抑制劑存在和不存在時，在允許淋巴細胞生產和分泌感染指示物的條件下將所說的樣品或另選直接從所說樣品分離的淋巴細胞的等分試樣與固相接觸；檢測溶液中與固相上結合配體結合的感染指示物；及比較在蛋白質合成抑制劑存在或不存在時所說的感染指示物的結合，從而獲得在所說的樣品中感染指示物的測定量。23.一種實施權利要求22所要求的方法的試劑盒，包含至少一種用所說的感染指示物的結合配體覆蓋的和適當封閉的固相支持物。全文摘要本發明提供了檢測血液樣品中主動抗體生產的方法,所說的方法包含在蛋白質合成抑制劑存在或不存在時,在使淋巴細胞生產和分泌抗體的條件下將所說的樣品的等分試樣與固相接觸;檢測溶液中固相上所說的抗原與抗體的結合;并比較在蛋白質合成抑制劑存在或不存在時所說的抗體結合,從而獲得與所說抗原反應的主動抗體分泌的測定量;且提供了實施該方法的試劑盒。也可以修改該方法使能夠進行對非特異性感染指示物的檢測。文檔編號G01N33/569GK1176000SQ9619204公開日1998年3月11日申請日期1996年2月21日優先權日1995年2月21日發明者L·R·哈海姆申請人:L·R·哈海姆