專利名稱：新的幽門卷旋桿菌膜蛋白質p76的制作方法
技術領域：
本發明的目的具體地是新近獲得的基本純化的幽門卷旋桿菌(Helicobacter pylori)蛋白，及含有該蛋白藥物組合物。
卷旋桿菌是特征為革蘭氏陰性螺旋型細菌的細菌屬。幾個種定居于哺乳動物胃腸道中。應特別提及的是幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae。雖然幽門卷旋桿菌是最常見的與人類感染相關的種，在一些稀有情形下表明，亦可能從人中分離H.heilmanii和H.felis。
卷旋桿菌在發達國家感染多于50％成年人群，在發展中國家幾乎是100％，因而使之成為世界范圍內一個主要感染因子幽門卷旋桿菌至今排他性地發現于人胃粘膜表面上，特別是胃病灶和十二指腸潰瘍病灶周圍。該細菌目前被看做胃竇炎的致病因子，似乎是潰瘍發生所需的輔因子之一。而且，胃癌的發生可能與幽門卷旋桿菌的出現相關。
因而看來開發一種用于預防或治療幽門卷旋桿菌感染的疫苗是令人想望的。這樣的疫苗最可能是亞單位性質的。
迄今已有多種幽門卷旋桿菌蛋白質被表征和分離。具體地，它們是，脲酶，和兩個分別為30和67kDa的A和B亞基組成(Hu和Mobley感染免疫學(1990)58992；Dwn等人生物化學雜志(1990)2659464；Evans等人，微生物發病機理(1991)1015；Labigne等人，J.Bact.(1991)1731920)；87 kDa的液泡細胞毒素(VacA)(Cover&Blaser，生物化學雜志(1992)26710570；)Phadnis等，感染免疫學(1994)621557，WO 93/18150)；與細胞毒素相關的128 kDa的免疫優勢抗原(CagA，亦叫TagA)(WO93/18150；USP 5 403924)；分別為13和58kDa的熱休克蛋白HspA和HspB(Suerbaum等，分子微生物學(1994)14959；WO 93/18150)，54kDa過氧化氫酶(Hazell等，J.Gen Microbiol(1991)13757)，20kDa原纖維血細胞凝集素(HpaA)；15kDa的富含組氨酸的蛋白(Hpn)(Gilbert等，感染免疫學(1995)632682)；30kDa的外膜蛋白(Bolin等，臨床微生物學雜志(1995)33381)；20kDa的膜相關脂蛋白(Kostrcynska等，細菌學雜志(1994)1765938)，以及分子量在48至67kDa之間的孔蛋白家族HopA、HopB、HopC和HopD(Exner等，感染免疫學(1995)631567)。
這些蛋白質的幾種包被提議為潛在的疫苗抗原。具體地，脲酶已被承認用于此用途的最優選的抗原(WO 94/9823；WO 95/3824；WO95/22987；Michelti等，胃腸道學(1994)1071002)。事實仍然如此對于新抗原的研究必須持續下去，特別是因為業已發現為了獲得最佳疫苗效應，可能必須將幾種抗原參入到疫苗之中。
總之，似乎必須鑒定另外的抗原，以將其參入到高效力疫苗之中。
因此，本發明的目的具體涉及一種基本純化形式的幽門卷旋桿菌蛋白，能夠從幽門卷旋桿菌膜部分獲得，在10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，其分子量看來是76kDa左右。
“基本純化形式”應被理解為意謂著該蛋白從其天然存在的基質中分離。特別地，它可以是一種缺乏幽門卷旋桿菌胞質和周質蛋白的制劑。
其表觀分子量為76kDa左右的膜蛋白可通過以下過程獲得(i)幽門卷旋桿菌細菌用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取，然后離心；(ii)收集上清，將其用75mM PBS pH7.2透析，然后離心；(iii)回收由離心沉淀構成的膜級分，將其重懸于水性介質，優選含有5％兩性離子洗滌劑3～14的pH9.5的碳酸鹽緩沖液；(iv)膜級分在Q-Sepharose柱上用0-0.5M NaCl梯度進行陰離子交換層析，含有0.1％兩性洗滌劑3-14的pH9.5的碳酸鹽緩沖液是有利的；(v)回收以0.25-0.45M NaCl，例如以0.25M-0.35M NaCl，或優選以0.35-0.45M NaCl洗脫的級分，在S-Sepharose柱上用0-1M NaCl梯度進行陰離子交換層析，優選地，該梯度包含于含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的pH9.5的碳酸鹽緩沖液(優選地，用0.25-0.45M NaCl，例如用0.25-0.35M NaCl，或用0.35-0.45M NaCl洗脫的組分，首先用含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的pH 5的乙酸鹽緩沖液透析)；和(vi)回收0.15-0.2M NaCl，優選用0.15M NaCl洗脫的級分。
為明晰起見，應說明用0.25-0.45M NaCl洗脫的級分這一措詞應被如下理解在-0.25至0.45M的NaCl濃度下洗脫的級分。因而洗脫級分可能包括0.25和0.45M間洗脫的物質或在0.25至0.45M范圍如0.35-0 45M內的兩個濃度之間洗脫的物質。
應該說明施加于S-Sepharose柱的NaCl梯度優選階梯濃度。例如用采用0.1M、0.15M、0.2M和1M NaCl階梯。
推測76kDa脫蛋白的生物學功能是孔蛋白，可能位于外膜水平上。Exner等，感染免疫(1995年4月)631567表征了一個孔蛋白家族，無論它們在95℃或其他溫度加熱(經典方法)，在SDS-Page電泳時都展現了不同的遷移圖譜(profile)。就本發明的76kDa蛋白質而言，情形不是如此，確實，其凝膠遷移不因樣品在60℃，亦不因在95℃加熱而改變。
一種幽門卷旋桿菌菌株(ATCC 43579)的76kDa蛋白質的N-末端序列如下(單字母密碼)EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.這一信息并不排除如下事實能夠按上述方法純化而得的等價蛋白可有略微不同的N末端序列，因為它們可以衍生于其他細菌菌株。這一差異確實反應了同一種內普遍發生的等位變異的現象。例如，細菌的種通常由細微等位特征彼此不同的一組菌株體現。在不同菌株中完成同一生物學功能的多肽可能具有不同于所有菌株的氨基酸序列。這一等位變異亦存在于DNA中。
在氨基酸序列水平上的等位變異可由一個或多個不改變生物學功能的氨基胺替代，缺失，或加成組成。
“生物學功能”被理解為意謂著參預了該蛋白質天然存在于此的細胞的存活的蛋白質功能(即使該功能不是絕對必需的)。例如，孔蛋白的功能是允許存在于外部基質的化合物進入細胞內，生物學功能不同于抗原功能。一種蛋白質可以有不止一種生物學功能。
本發明的目的是一種基本純化的蛋白質，它可以按照上述方法之一從卷旋桿菌屬的細菌中如幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae中純化。
本發明的另一目的是，能夠按照上述方法純化的卷旋桿菌蛋白的在抗原性意義上的類似物范圍內的任一基本純化的蛋白質或多肽。至于多肽，特別涉及將天然存在的且其純化形式可由上述方法獲得的蛋白質進行片段化或通過缺失，加成或替換而突變一個或多個氨基酸衍生而來的多肽。這些多肽具體地可借助于蛋白酶例如胃蛋白酶或胰蛋白酶酶促消化而得。就這些多肽而言，不需按上述方法純化。
本說明書所用的術語“蛋白質”和“多肽”不依賴于分子的大小(氨基酸鏈長度)，亦不依賴可能的轉錄后修飾。在說明書的剩余部分，術語“多肽”意指由蛋白質片段化或突變衍生的產物。
本發明的蛋白質或多肽能夠被制備用于抗可按上述方法純化的卷旋桿菌蛋白質的單特異性抗體識別。具體的抗原性可按照一系列的方法揭示，例如通過Western印跡(Towbin等，PNAS(1979)764350)，斑點印跡和ELISA。
在Western印跡中，待測產物如無論是以純化的制備物的形式或以細菌提取物的形式，按Laemmli U.K.，Nature(1970)227680描述的方法進行SDS-Page凝膠電泳(10％聚丙烯酰胺)。轉移到硝酸纖維素膜之后，將膜與稀釋范圍為1∶50至1∶5000，優選1∶100至1∶500的稀釋的單特異性超免疫血清溫孵。在包括于上述范圍之一的稀釋度下，特異的抗原性一經展示出對應于測試產物的一條帶的反應性便得以證實。
在ELISA反應中，待測產物優選用于包被反應孔。純化的制劑是優選的，雖然總提取物亦可使用。簡言之，含10μg蛋白質/ml的100μl制劑被分布于96孔板的孔中。該板于37℃溫孵2h，然后于4℃過夜。該板用含有0.05％Tween 20的PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)(PBS/Tween緩沖液)洗滌。孔用含1％牛血清白蛋白的250μl PBS飽和。將其于37℃溫孵1小時然后用PBS/Tween緩沖液洗滌。單特異性兔抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween系列稀釋。將100μl稀釋液加入每一孔中。按標準方法將板進行可視化。例如，將抗兔免疫球蛋白的過氧化物酶偶聯羊免疫球蛋白加到孔中。溫孵于37℃持續90分鐘，然后洗滌板。將反應物用合適的底物顯色。用比色法測量反應(用分光光度計測量吸光度)。這種條件下，當稀釋度為至少1∶50，優選至少1∶500，而OD值為1時，便為陽性反應。光密度測量的合適的波長依賴于底物。
在斑點印跡中，純化的制劑是優選的，雖然總提取物亦可使用。簡言之，含有100μg蛋白質/ml的待測產物制備物在50mM Tris-HCl，pH 7.5中系列稀釋兩次。從每一稀釋液取100μl通過96孔斑點印跡儀(Biorad)點樣到0.45μm硝酸纖維素膜上。置于真空以除去緩沖液。加入50mM Tris-HCl pH7.5以洗滌孔，將膜空氣干燥。將膜用封閉緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5、0.15M NaCl，10g/l脫脂奶粉)飽和，然后用單特異性抗血清溫孵，該抗血清在1∶50至1∶5000，優選1∶50至1∶500范圍內稀釋。該反應按標準方法可視化。例如，將抗兔免疫球蛋白的過氧化物酶偶聯羊免疫球蛋白加到孔中。溫孵于37℃持續90分鐘，然后洗滌板。反應用合適的底物顯色。通過比色或化學發光測定反應。此種條件下，當硝酸纖維素片的斑點在通過比色法而可視化的水平上直接觀察到顏色，或通過化學發光法而于照相膠片上可視化，且這時稀釋度為至少1∶50，優選為至少1∶500時，反應為陽性。
根據具體的實施方案，根據本發明的蛋白質可從卷旋桿菌中純化獲得，或在異源系統中由重組途徑而表達(就根據本發明的多肽而言，情形亦如此)。在后一情形下，蛋白質可以展現出的轉錄后修飾不同于來源于起始菌株的相應蛋白質的轉錄后修飾。
根據本發明的蛋白質或多肽的治療或預防效力可根據標準方法評價，例如采用小鼠/H.felis模型和Lee等描述的方法(歐洲胃腸道學和肝學雜志(1995)，7303或Lee等傳染病學雜志(1995)172161)測量粘膜免疫應答的誘導和具有治療和預防效應的免疫應答的誘導，其前提是已采取如下預防措施當蛋白質來源于H.feis以外的種時，H.felis菌株應被屬于由此衍生蛋白質的種的卷旋桿菌菌株替代，且適用于最終目的(其他實驗條件是一致的)。例如，由幽門卷旋桿菌蛋白質經片段化而衍生的多肽誘導保護性或治療性效應的能力通過替代幽門卷旋桿菌菌株而測試。這樣的菌株為Kleanthous等人提議，其摘要在1995年7月7-9日，蘇格蘭愛丁堡舉行的第8屆國際胃十二指腸病理學研討會上披露。與對照組相比，胃組織中的感染一經減弱，但可以觀察到保護性效應。感染通過檢測脲酶活性，細菌量或白細胞浸潤而評價。例如當攻擊之后，觀察到胃組織中脲酶活性降低時，即使不能完全消除脲酶活性，也有理由斷言有不完全的保護。
因此，本發明亦涉及(i)含有本發明的蛋白質或多肽及稀釋劑及載體的物質的組合物；特別是(ii)含有治療或預防有效量的作為活性成分的本發明的蛋白質或多肽的，試圖具體用于卷旋桿菌感染預防或治療的藥物組合物；(iii)本發明的蛋白質或多肽的作為治療或預防劑的應用；(iv)本發明的蛋白質或多肽在試圖用于卷旋桿菌感染預防或治療的藥物生產中的應用，以及(v)一種用于在動物體內誘導針對卷旋桿菌，如，幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae的免疫應答的方法，按照此方法，免疫有效量的本發明的蛋白質和多肽被施用于所述動物以發生免疫應答；特別是(vi)一種用于保護或治療卷旋桿菌感染的方法，向個體施用預防或治療有效量的本發明的蛋白質或多肽。
本發明的方法和藥物組合物可治療和防止卷旋桿菌感染，因而，可治療和防止這一感染相關的胃腸疾病。具體地，它們是慢性和萎縮性急性胃炎；消化性潰瘍，如胃和十二指腸潰瘍；胃癌；慢性消化不良；難治性非潰瘍性消化不良；腸組織變形和一些淋巴瘤(如低級MALT淋巴瘤)。
本發明的組合物可用疫苗領域內任一傳統途徑給藥，特別是通過粘膜(如眼、鼻、口腔、胃、腸、直腸、陰道或尿道)表面或胃腸外(如，皮下，經皮，肌內，靜脈內或腹膜內)途徑。給藥途徑的選擇取決于很多參數，如與本發明的蛋白質或多肽相關的佐劑。例如，假如使用粘膜佐劑，鼻內或口腔給藥是優選的。假如使用脂質制劑，將選擇胃腸外途徑，優選皮下或肌內途徑。
本發明的組合物除包含本發明的蛋白質或多肽之外，還至少包含另一卷旋桿菌抗原例如脲酶脫輔基酶、或脲酶的亞單位，片段，同系物，突變體或衍生物。
為用于本發明的組合物，根據本發明的蛋白質或多肽可以配制于脂質體中，或與脂質體一同配制優選中性或陰離子脂質體，微球體，ISCOMS或病毒樣顆粒(VLPs)，以提高蛋白質或多肽的尋靶機能，或增進其免疫應答。本領域技術人員可輕松地獲得這些化合物。例如，參見脂質體一種可行的探索，RRC New ED.IRL press(1990)。
除脂質體之外，還可采用佐劑。本領域技術人員熟知很多佐劑。這些佐劑參見下述就胃腸外給藥而言，可特別提及鋁化合物例如氫氧化鋁，磷酸鋁和羥基磷酸鋁。按標準方法，抗原可以吸附到或沉淀到鋁化合物上。其它佐劑例如RIBI(購自Immunochem(Hamilton. MT))亦可用于胃腸外給藥。
就粘膜給藥而言，可特別提及細菌毒素，例如，霍亂毒素(CT)，熱不穩定大腸桿菌毒素(LT)難辨梭狀芽孢桿菌毒素和百日咳毒素(PT)以及這些毒素的解毒形式(亞基，類毒素或突變體)例如，含有CT的B亞基(CTB)和小量CT的制劑亦可使用。因為保留了佐劑活性，這些毒素的片段，同系物和衍生物看來是適用的。優選地，采用具有減低的毒性的突變體。這些突變體在例如WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突變體)，WO 95/34323(Arg-9-Lys，Glu-129-GlyPT突變體)和WO 96/6627(Arg-192-Gly LT突變體)。其他佐劑，例如，大腸桿菌，明尼蘇達沙門氏菌，傷寒沙門氏菌或弗氏志賀氏菌的主要脂多糖(MPLA)可用于粘膜給藥。
可用于粘膜和胃腸外給藥的佐劑特別包括polyphosphazine(WO95/2415)，DC-膽(3-β-〔N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)氨甲酰基〕膽固醇(USP 5 283 185和WO 96/14831)和QS-21(WO88/9336)。
給藥可以單劑量或一定時期之后，重復一次或幾次劑量進行。合適的劑量依多種參數變動，例如受治療的個體(或人或兒童)，疫苗抗原本身，給藥的途徑與頻率，是否有佐劑出現，假如有的話，佐劑的類型和期望的效應(例如，保護或治療)，這可由本領域技術人員決定。一般說來，本發明的抗原可以10μg至500mg，優選1mg至200mg的量施用。特別是，已表明胃腸外劑量不應超過1mg，優選不超過100μg。較高劑量可以遵醫囑使用于例如口服應用。不依賴于制劑，口服施用于人的蛋白質的量是例如1至10mg每劑量數量級，且推薦在4周間隔內至少3個劑量。
本發明的組合物可用傳統方法生產。具體地，本發明的蛋白質或多肽可與可藥用的稀釋劑或載體組合使用，例如，當組合物試圖用于口服或胃內給藥時，可采用水或鹽溶液例如磷酸鹽緩沖液(PBS)，任選地補充碳酸氫鹽，例如碳酸氫鈉，例如0.1至0.5M。一般地，基于給藥的方式和途徑及標準的藥物學實踐而選擇稀釋劑或載體。可藥用稀釋劑和載體，以及所有藥物學制劑中所必需的都在Remington氏藥物科學中描述，這是該領域標準的教科書，及USP/NP中亦有描述。
在更詳盡的描述方式中，提議例舉由口服途徑施用本發明的蛋白質或多肽，為此目的，本發明的蛋白質和多肽可以單獨或者在其它幽門卷旋桿菌蛋白質的出現情況下，包裝到明膠膠囊中，以保護抗原免受胃液降解，或者和碳酸氫鈉共同施用。這樣的制劑已用于藥物組合物。(Black等，Dev.Biol.Stand.(1983)，539)。該蛋白亦可根據別處描述的方法(Eldridge等，Curr.Top.Microbiol.Immuno(1989)14659)包裝到PLGA微球(羰基乙酸乳酸共聚物)；該蛋白質亦包裝到按照廣泛描述的方法制備的脂質體中(脂質體一種可行的探索，D.Rickwood和B.D.Hame編，1990，牛津大學出版社，ISBN 0-19-963077-1)。
替代地，本發明的蛋白質和多肽可經胃腸外途徑給藥。為此目的，本發明的蛋白質和多肽可按照完全傳統的方法吸附到氧化鋁凝膠上。在pH約為6.5的緩沖液中的1mg/ml蛋白質溶液，與Al+++量為10mg/ml的氫氧化鋁接觸1小時。最終的制劑組合物如下蛋白質5-μg/ml，Al+++250μg/ml，硫柳汞1/10,000，以上各組分均在PBS中。在口服施用時，推薦使用3次劑量，每一劑量與前一劑量相距4周。
本發明的多肽可用做診斷試劑，例如，用于在生物學樣品中，如血樣中，檢測到抗-卷旋桿菌抗體的存在。為此目的，這樣的多肽優選地包含5至80氨基酸，優選10至50氨基酸。本發明的多肽試劑被標記或者是，按診斷方法使用。診斷方法已在本文中前述部分描述。
另一方面，本發明提供了能夠識別本發明的蛋白質或多肽的單特異性抗體。
“單特異性抗體”應理解為意味著一種能夠主要地與一種單一的卷旋桿菌蛋白質反應的抗體。這種抗體僅在使用基本純化的蛋白質做為免疫原時才能獲得。本發明的抗體可能是多克隆的或單克隆的，單克隆抗體可以嵌合的(例如，由鼠的可變區與人的恒定區相聯)，或者人源化的(僅有高變區是來源于動物的，如來源于鼠)和/或一條鏈。多克隆抗體，如同單克隆抗體，可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)′2或Fab片段。本發明的抗體可以是任意同種型的，例如IgG或IgA；多克隆抗體可以是單一同種型，或者是所有的或某些同種型的混合物。
下文中，術語“單特異性抗體”和“單特異性抗血清”可交互使用。
一種抗本發明的蛋白質的抗體可以被制備，然后用標準免疫學試驗鑒定，例如Western印跡，斑點印跡或ELISA分析(例如，參見Goligan等人，當代免疫學方法(1994)John Wiley和Sons Inc.紐約，NY)；抗體，實驗室手冊，D.lane，(1988)Harlow編)。
本發明的抗體可用于診斷，以及用于大規模親合層析純化本發明的蛋白質或多肽，在被動免疫過程中，這一抗體亦可潛在地用作治療劑。
因而，本發明亦提供了(i)用于檢測生物樣品中卷旋桿菌出現的試劑，包含根據本發明的抗體和多肽，和(ii)一種用于檢測生物學樣品中卷旋桿菌出現的診斷學方法，按照此種方法，生物學樣品與本發明的抗體或多肽接觸，因而形成了免疫復合物；任選地，去除未結合物質，檢測在樣品和本發明的抗體或多肽之間形成的免疫復合物，該復合物是樣品中，或樣品來源器官中卷旋桿菌出現的指征。
可以容易地理解根據本發明的抗體使得檢測胃提取液中卷旋桿菌的出現成為可能。
就用于診斷測試而言，試劑可以游離的形式或固定化于固體支持物；支持物可以是本領域普遍應用的任一支持物，例如試管，玻珠，或反應孔。固定化可以直接或間接方式完成。直接方法包括被動吸附(非共價鍵)或支持物和試劑之間的共價鍵。“間接方式”意謂著能夠與試劑相結合的抗-試劑化合物首先與固體支持物相連。例如，如果采用一種多肽試劑，一種能夠與其結合的抗體可用作抗-試劑，其前提是該抗體結合到多肽的一個不參予出現于生物學樣品中的抗體識別的表位上。間接方式也可以通過配基-受體系統完成，例如將一個分子例如維生素移植到多肽試劑上，然后固定化到固體形式的相應受體上。這可以由生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統來說明。替代地，間接方法可采用，例如，向試劑加一肽尾，例如，床用化學方式，且通過被動吸附或通過共價鍵合肽尾而固定化移植產物。
本發明亦涉及一種用于從生物學樣品中純化本發明的蛋白質或多肽的方法。按照此方法，采有本發明的單特異抗體將生物學樣品進行親和層析處理。
為此目的，抗體可能是多克隆或單克隆的，優選地為IgG型。純化的IgG可按照普遍使用的方法制備(參見，例如Coligan等)。
傳統的層析支持物，和移植抗體的標準方法一樣，在例如抗體實驗室手冊，D.Lane.Harlow編(1988)中被描述。
簡言之，生物學樣品，優選緩沖溶液，被加樣到層析材料上，該材料優選地以用來稀釋生物學樣品的緩沖液平衡，致使本發明的蛋白質或多肽(抗原)吸附到材料上。這種層析材料，例如與本發明的抗體相聯的凝膠或樹脂可以床或柱的形式提供。未結合的組分被洗去，然后以合適的洗脫緩沖液洗脫抗原，例如甘氨酸緩沖液，或含離液劑的緩沖液，如鹽酸胍，或高鹽濃度(如3M MgCl2)。收集洗脫級分，檢測抗原的出現，例如，通過測量280nm吸光度。
本發明的抗體的治療或預防實用性可按Lee等人在上文中就本發明的蛋白質和多肽提出的保護性實驗得以證實。因而，本發明的目的還有(i)一種包含本發明的單特異性抗體，和一種稀釋劑或一種載體的物質的組合物；特別是，(ii)一種含有治療或預防有效量的本發明的單特異性抗體的藥物組合物；(iii)本發明的單特異性抗體在用于治療或防止卷旋桿菌感染的藥物生產中的應用；以及(iv)一種用于治療或防止卷桿菌感染(例如，幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis或H.mustelae)的方法，按照此方法，治療或預防有效量的本發明的抗體被施用于需要此種治療的個體。
為此目的，單特異性抗體可以是單克隆的或多克隆的，優選IgA同種型(占優勢的)。在被動免疫方法范圍內，抗體通過粘膜途徑施用于動物，例如通過口服或胃內途徑施用于胃粘膜，在碳酸氫鹽存在下施用是有利的。本發明的單特異性抗體可以作為活性成分單獨施用，亦可作為含有至少一種特異于每一種卷旋桿菌多肽的單特異性抗體的混合物施用。本方法所采用的抗體劑量可由本領域專業人員輕松地決定。例如，提議的劑量特征如下，每日施用100至1000mg抗體一周，或每日施用三次含100至1000mg的抗體的劑量施用二至三天。
根據上述含有本發明的蛋白質或多肽的組合物的制備原則，含有本發明的抗體的藥物組合物可按照上述原則制備。而且，采用同樣的藥物指標。
參考附圖，以在后文中說明本發明。
圖1，泳道4表示經10％聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯藍染色而分析膜級分Cs2d。泳道1是分子量標志物。
圖2，泳道4表示經10％聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯藍染色而分析由制備膠純化的76kDa蛋白。泳道1和8是分子量標志物。
圖3表示，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯藍染色之后，由膜級分Cs2d經Q-Sepharose柱層析獲得的級分D(泳道3)、由級分D經S-Sepharose柱層析獲得的級分D′(泳道4)。泳道1對應于分子量標志物，泳道2對應于膜級分Cs2d。實施例1. 膜級分制備1A-培養幽門卷旋桿菌菌株ATCC 43579在10升發酵罐中于液體培養基中進行培養。
一種于甘油中的冰凍微生物樣品用于接種含有所謂“兩相”培養基的75-cm2三角瓶(固相是含有6％新鮮綿羊血的哥倫比亞瓊脂，液相是含有20％胎牛血清的胰酶(trypcase)水解大豆)。在微需氧環境下培養24小時之后，培養物的液相用于接種幾個盛有缺乏羊血的兩相培養基的75-cm2三角瓶。培養24小時之后，液相能夠用于接種盛有含有10g/l β環糊精的液體大豆胰酶水解培養基的2升生物發酵罐。培養物達到OD 1.5至1.8時，接種到盛有液體培養基的10升發酵罐。培養24小時之后，于4000×g，4℃離心30分鐘收集細菌。發酵罐中10升幽門卷旋桿菌ATCC 43579培養物可獲得20至40g(濕重)細菌。1B-用正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷萃取以上獲得的微生物沉淀用500ml PBS(磷酸鹽緩沖液；NaCl7.650g，磷酸氫二鈉0.724g，磷酸二氫鉀0.210g每升；pH7.2)/升培養物洗滌。在同樣條件下再次離心微生物。
獲得的細菌沉淀(C1)重懸于1％OG溶液(Sigma)中(30ml/升培養物)。將細菌懸液在磁力攪拌下于室溫溫孵1小時，然后于4℃，17,600×g離心30分鐘。
獲得的上清液(S2)在4℃透析(MWCO＝10000Da，Spectra/por)過夜，透析在磁力攪拌下，用稀釋到1/2的1升PBS進行兩次。透析過程中形成的沉淀于4℃，2600×g離心30分鐘而收集，去除上清。含有膜蛋白的沉淀(Cs2d)貯存于-20℃。
沉淀重懸于20mM Tris-HCl緩沖液pH 7.5和100μm Pefabloc(buffer A)。1C-膜級分分析按Laemmli方法將膜級分Cs2d用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。蛋白質經考馬斯藍染色可視化。
膜級分的蛋白質圖譜展示了在76，67，50和30kD出現的4條主帶(圖1，泳道4)。實施例2通過制備性SDS-PAGE純化76kDa蛋白按照Laemmli的方法(1970)用5％濃縮膠和10％分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。膜級分重懸于緩沖液A中，用2×樣品緩沖液對半稀釋。混合物于95℃加熱5分鐘。大約19mg蛋白質上樣于16×12cm大小，5mm厚的膠。50V預遷移2小時，然后于65V遷移過夜。用考馬斯藍R250(0.05％于超濾水)染色凝膠，使帶清晰可見。
用刀片切下76kDa主帶，置于盛有10或20ml萃取緩沖液的Ultra-turrax中，萃取緩沖液中含25mM Tris HCl pH8.8，8M尿素，10％SDS，100μm苯甲基磺酰氟(DMSF)和100μm Peflabloc(緩沖液C)；然后助借于一個擠壓機于7巴壓力下，于室溫用Millipore AP20預過濾器(φ濾器＝4.7cm，φ孔＝20mm)過濾；然后用5至10ml緩沖液C洗滌，如上述過濾。合并由這兩個基礎產物而得的兩份濾液。
用3倍體積的50∶50的75％甲醇和75％異丙醇混合物沉淀濾液，然后用70 TFT轉頭(J8-55，Beckman)，于240,000×g 10℃離心16小時。
將沉淀溶于2ml增溶緩沖液，增溶緩沖液含有10mM NaPO4pH7.0，1M NaCl，0.1％十二烷基肌酸鈉，100μm PMSF，100μmPefabloc和6M尿素(緩沖液D)。增溶樣品用100ml含4M尿素和0.1％十二烷基肌酸鈉的緩沖液D，100ml含2M尿素和0.5％十二烷基肌酸鈉的緩沖液D，2次100ml不含尿素和含0.5％十二烷基肌酸鈉連續透析。透析于室溫下磁力攪拌進行1小時。最終的透析物于冰浴保溫30分鐘，然后于4℃，低速離心10分鐘(Biofage A，Heraeus Sepatech)。回收上清液，用0.45μm Millipore濾器過濾并于-20℃貯存。
進行SDS-PAGE分析(圖2，泳道4)。級分的電泳圖譜分析表明它是純化的，僅有一條帶。實施例3從膜級分Cs2d中純化76kDa膜蛋白3A-膜級分Cs2d蛋白在Q-Sepharose柱上分離140mg上述增溶的膜級分Cs2d蛋白質上樣于如下制備的Q-Sepharose柱。
按生產商(Pharmacia)推薦方案制備Q-Sepharose柱，柱體積是40ml(φ＝2.5cm，h＝8cm)。洗柱然后用含100μM Pefabloc和0.1％兩性離子洗滌劑3-14的pH9.5的NaCO3緩沖液。通過UV于280nm檢測柱流出而監測層析結果。
平衡緩沖液(50mM NaCO3pH9.5，100μM Pefabloc和0.1％兩性離子洗滌劑3-14)洗柱，直至獲得基線之后，用含有0.1M NaCl的平衡緩沖液洗滌，直至獲得基線(級分A)，然后用含有0.1至0.5MNaCl梯度的平衡緩沖液洗脫(級分B、C、D和E)，然后用含1M NaCl的平衡緩沖液洗滌(級分F)。結果見下表。
蛋白質洗脫表明55％的蛋白質在0.1-0.5M NaCl梯度洗脫，15％在用0.1M NaCl洗滌過程中洗脫，15％在用1M NaCl洗滌過程中洗脫。
膜級分經Q-Sepharose柱層析所得每一級分的SDS-PAGE圖譜是不同的。而且，較之于起始的膜級分Cs2d，一些蛋白質被富集。在圖譜上觀察到對應于級分D或優選對應于級分E。76kDa蛋白質被富集，其純化如下完成。3B-來自由Q-Sepharose柱獲得的D或E級分的76kDa蛋白質在S-Sepharose柱上的純化根據制造商的推薦方案制備S-Sepharose柱，柱體積大約是10ml(φ＝1.5cm，h＝5cm)(最多10mg蛋白/ml凝膠)。洗滌柱然后用含有100μM Pefabloc和0.1％兩性離子洗滌劑3-14的50mM乙酸鹽緩沖液pH5.0平衡。
預先用平衡緩沖液(50mM乙酸鹽pH5.0，100μM Pefabloc和0.1％兩性離子緩沖液)透析的級分D或E上樣于S-Sepharose柱。用同一緩沖液洗柱直到280nm處的吸光度穩定。大約需3倍柱體積才能返回基線。蛋白質用0至0.5M NaCl梯度的平衡緩沖液洗脫(10×VT)，然后用含有0.5和1M NaCl的平衡緩沖液洗滌(4×VT)。分析收集的級分，合并且如前述貯藏。
回收在0-0.5M NaCl梯度，在0.15和0.20M NaCl之間，優選于0.15M NaCl濃度下流出的D′或E′級分。通過SDS-PAGE和Western印跡對此級分進行分析。結果如圖3所示。
結果表明經兩次離子交換柱層析之后，富集了76kDa；但其仍被54kDa或67kDa蛋白質污染(泳道4)。54kDa蛋白質不與抗過氧化氫酶抗體反應；因而其不對應于過氧化氫酶；類似地，在Western印跡中67kDa蛋白質不與抗-ure B抗體反應，因此，其不對應于脲酶的亞單位。用抗-76kDa抗血清進行的Western印跡分析表明，在76kDa帶下方的微弱的帶對應于76kDa蛋白質的降解產物，因為它們與抗血清反應較弱(泳道7)。實施例4制備抗膜蛋白76kDa的抗血清分別以制備性SDS-PAGE純化的抗原超免疫兔，獲得了特異于幽門卷旋桿菌主要膜蛋白的多克隆血清。在D0，用含有50μg乳化于完全弗氏佐劑的膜蛋白的制劑進行首次注射(皮下多個位點和肌內)。然后于D21和D42通過注射25μg完全弗氏佐劑中的膜蛋白進行加強免疫。于D60處死動物。獲得的血清于56℃，30分鐘去補體，通過用孔徑為0.22μm的濾膜(Millipore)過濾而滅菌。
抗血清與如圖3描述而分離的76kDa蛋白質反應。
單特異性抗血清可用等價方法獲得。其中采用按3.B描述方法從Q-Sepharose層析后獲得的級分E(3.A)純化的、且對應于S-Sepharose于0.15M NaCl洗脫的級分的制劑。實施例5用免疫親和層析純化76kDa膜蛋白5.A-IgG類的純化如實施例4制備的超免疫血清上樣于預先用100mM Tris HClpH 8.0平衡的Protein A Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia)。樹脂用10倍柱體積的100mM Tris·HCl pH8.0，然后10倍柱體積的10mM Trisl·HCl pH8.0洗滌。IgG類以0.1M甘氨酸緩沖液pH3.0洗脫。IgG類以5ml級分收集，向其中加入0.25ml 1M Tris·HClpH8.0。于280nm處測量光密度然后合并含有IgG的級分，如果需要，于-70℃冷凍。5.B柱制備Pharmacia生產的適量的CNBr活化的Sepharose 4B凝膠(ref17-0430-01)(已知1g干膠給出3.5ml水化膠，膠的密量是5至10μgIgG/ml膠)懸浮于1mM NaCl緩沖液中。借助于buchner通過加入小量1mM HCl洗滌膠。所用1mM HCl的總體積是200ml每克膠。
純化的IgG于20+5℃對50倍體積的500mM磷酸鹽緩沖液pH7.5透析4小時。然后稀釋于500mM磷酸鈉緩沖液pH7.5，終濃度為3mg/ml。
IgG類與膠于5+3℃振搖保溫過夜，將膠裝入層析柱并用2倍柱體積的500mM磷酸緩沖液pH7.5洗滌。然后將膠轉移至試管中于100mM乙醇胺pH7.5于室溫下振搖保溫過夜。然后用2倍柱體積PBS洗滌。膠貯存于含1/10,000硫柳汞的PBS中。偶聯到膠上的IgG的量通過測量起始IgG溶液和直接洗脫物加洗滌物之間的280nm處光密度的差值而確定。5.C抗原的吸附和洗脫制備于50mM Tris HCl pH8.0，2mM EDTA的蛋白制劑，如1B中獲得的級分Cs2d經0.45μm膜過濾，然后加樣于預先用50mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA平衡的柱上，流速為大約10ml/h。柱用20倍體積的50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA洗滌。另選地，吸附可發生于床，保溫于5+3℃持續保溫過夜，并振搖。
膠用2至6倍體積10mM磷酸鈉緩沖液pH6.8洗滌。然后用100mM甘氨酸緩沖液，pH2.5洗脫抗原。洗脫物以3ml級分收集，向其中加入150ml pH8.0的磷酸鹽緩沖液。每一級分的光密度于280nm測量；合并含有抗原的級分并貯于-70℃。實施例6凝集試驗用于-70℃凍存于甘油中的幽門卷旋桿菌No.ATCC 43579(可從ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville MD-USA獲得)接種一盛有兩相培養基的25cm2三角瓶。兩相培養基包括由補充了6％新鮮綿羊血的10ml哥倫比亞瓊脂(BioMerieux)組成的固相，和由含有20％胎牛血清的3ml大豆胰酶水解肉湯(Difco)的液相。三角瓶置于稱為“generbag”(BBL)的密封袋中，在借助于Microaer System(BBL)獲得的微需氧條件下(8-10％CO2，5-7％O2和85-87％N2)于37℃溫孵48小時。
這一48小時的培養物被再次用于接種含有兩相培養基的三角瓶。該培養物的起始600nm吸光度應為0.15至0.2。三角瓶在一致于上述條件下溫孵。
48小時后，細菌懸液轉移到測試管中。測量培養物的600nm吸光度，其應在3.0至3.5之間。革蘭氏染色后鏡檢微生物的出現。6.B 抗血清在使用前，如實施例4獲得的抗血清經0.45μm膜過濾，以去除小的聚集物。6.C 凝集試驗在一黑底免疫沉淀板上(Prolabo ref.10050)，在第一孔中加入20μl生理鹽水，中央孔中加入20μl免疫前收集的血清，在第三孔中加入抗血清。向三孔中的每孔加入20μl幽門卷旋桿菌細菌懸液，將液滴借助于帶有密封吸頭的巴氏吸管混合。
混合后，至多5分鐘就可在放大鏡下觀察到凝集反應的開始。當混合物以含有大的聚集體的澄清溶液形式出現時，凝集反應完成。陰性對照，無論是生理鹽水，還是免疫前血清，均保持混濁，表明細菌懸浮是完整的。
抗-76kDa抗血清具有強烈的凝集反應。在測試條件下，幽門卷旋桿菌細菌快速凝集，而一分鐘后完成。結果表明76kDa蛋白質可能暴露于卷旋桿菌表面。實施例776kDa膜蛋白的保護效應的證實用1、5、25、50或100μg 76kDa抗原經胃內途徑免疫一組約10只6至8周齡Swiss Webster小鼠(Taconic Labs，Germantown，NY)，其中抗原以實施例3所述層析方法純化，然后稀釋于PBS或含有0.24M碳酸氫鈉的PBS。抗原補充了5或10μg霍亂毒素(CT)(Calbiochem，San Diego)或熱不穩定毒素(Berna Products，Coral Gables FL)。首先用異氟烷麻醉小鼠，然后借助于插管施用體積為0.5ml的劑量。以7-10天為間隔，給每只小鼠施用4個劑量。在末次施用抗原之后的兩周，用單劑量幽門卷旋桿菌ORV 2002菌株(每200μl PBS中有1×107活菌；OD550約為0.5)經胃內途徑施用而攻擊小鼠。沒有接受抗原的對照組亦同樣攻擊。攻擊后兩周處死小鼠。或通過測量尿酶活性，或通過組織學評價細菌荷載(如Lee等描述，見上文)，或直接定量培養幽門卷旋桿菌來確定保護百分比。在此種條件下，與對照組相比，可能觀察到多數以25μg免疫的小鼠中，感染性荷載的極大降低，由此可以得出結論，76kDa的卷旋桿菌抗原是至少部分保護性的(保護率為大約60-70％)。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Pasteur Merieux Serums et Vaccins(B)街道58 avenue Leclerc(C)城市Lyon(D)國家France(E)郵編69007(G)電話72737931(H)電傳72737850(ii)發明名稱新的幽門卷旋桿菌膜蛋白質p76(iii)序列數1(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型帶(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設的非(iv)反義非(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO1Glu Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ser Val Gly Tyr Gln1 5 10Ile Gly Glu Ala Ala Gln Met Val1520
權利要求
1.一種基本純化形式的幽門卷旋桿菌蛋白質，能夠從幽門卷旋桿菌膜級分中獲得，在SDS存在下進行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，其表觀分子量大約是76kDa。
2.權利要求1的蛋白質，其表觀分子量大約是76kDa，且能夠按這樣一種方法獲得，在此方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡萄糖苷萃取幽門卷旋桿菌細菌，然后離心；(ii)回收上清，該上清經75mM PBS pH7.2透析，然后離心；(iii)回收由離心沉淀組成的膜級分，且重懸于水性介質中；(iv)以0-0.5M NaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；(v)回收以0.25-0.45M NaCl洗脫的級分，以0-1M NaCl，梯度，將其在S-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；以及(vi)回收以0.15-0.20M NaCl洗脫的級分。
3.權利要求2的蛋白質，其現觀分子量大約是76kDa，且能夠按這樣一種方法獲得，在此方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡萄糖苷萃取幽門卷旋桿菌細菌，然后離心；(ii)回收上清，該上清經75mM PBS pH7.2透析，然后離心；(iii)回收由離心沉淀組成的膜級分，且重懸于水性介質中；(iv)以0-0.5M NaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；(v)回收以0.35-0.45M NaCl洗脫的級分，以0.1-1M NaCl，梯度，將其在S-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；以及(vi)回收以0.15M NaCl洗脫的級分。
4.權利要求1，2或3的蛋白質，它具有作為孔蛋白的生物學功能。
5.權利要求1至4之任一的蛋白質，它具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的N末端。
6.以基本純化形式存在的卷旋桿菌蛋白質，能夠按這樣一種方法獲得，在此方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡萄糖苷萃取幽門卷旋桿菌細菌，然后離心；(ii)回收上清，該上清經75mM PBS pH7.2透析，然后離心；(iii)回收由離心沉淀組成的膜級分，且重懸于水性介質中；(iv)以0-0.5M NaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；(v)回收以0.25-0.45M NaCl洗脫的級分，以0-1M NaCl，梯度，將其在S-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；以及(vi)回收以0.15-0.20M NaCl洗脫的級分。
7.權利要求6的蛋白質，且能夠按這樣一種方法獲得，在此方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡萄糖苷萃取幽門卷旋桿菌細菌，然后離心；(ii)回收上清，該上清經75mM PBS pH7.2透析，然后離心；(iii)回收由離心沉淀組成的膜級分，且重懸于水性介質中；(iv)以0.1-0.5M NaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；(v)回收以0.35-0.45M NaCl洗脫的級分，以0.1-1M NaCl，梯度，將其在S-Sepharose柱上進行陰離子交換層析；以及(vi)回收以0.15M NaCl洗脫的級分。
8.一種由權利要求1至7之任一的蛋白質經突變或片段化衍生而來的，.基本純化形式的多肽，該多肽能夠被制備用于抗權利要求1至7之任一的蛋白質的單特異性抗體識別。
9.一種用于防止或治療幽門卷旋桿菌感染的藥物組合物，它含有作為活性成分的權利要求1至8之一的蛋白質或多肽。
10.一種能夠識別權利要求1-8之一的蛋白質或多肽的單特異性抗體。
11.一種試圖用于防止或治療幽門卷旋桿菌感染的藥物組合物，它含有作為活性成分的權利要求10的單特異性抗體。
12.一種使檢測生物學樣品中卷旋桿菌的出現成為可能的診斷方法，根據此方法，生物學樣品與權利要求10的抗體或權利要求8的多肽相接觸，致使免疫復合物形成，未結合物質被任選地除去，并檢測樣品和抗體或多肽間形成的免疫復合物。
13.一種從生物學樣品中純化權利要求1至8的蛋白質或多肽的方法，根據此方法，采用權利要求10的單特異性抗體將生物學樣品進行親合層析。
全文摘要
本發明的目的是以基本純化形式存在的幽門卷旋桿菌蛋白質,能夠從幽門卷旋桿菌膜級分中獲得,在SDS存在下,經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,其分子量看來是76kDa左右。
文檔編號G01N33/569GK1173876SQ9619177
公開日1998年2月18日 申請日期1996年10月4日 優先權日1995年10月4日
發明者L·利索羅 申請人:巴斯德梅里厄血清及疫苗公司