抗人雌激素受體單克隆抗體及抗人孕激素受體單克隆抗體的制備及應用的制作方法

專利名稱：抗人雌激素受體單克隆抗體及抗人孕激素受體單克隆抗體的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類用于臨床檢測乳腺癌、子宮內膜癌及各種激素依賴性腫瘤患者癌組織中雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)水平的生物檢測試劑。
乳腺癌在發達國家中的發病率高并逐年上升，以美國占首位。70年代其新的發病人數為8萬人/年；美國每年的患病率以3％的速度上升。至92年據不完全統計已達18萬人/年。在我國以北京為例，82年18.4人/10萬人患病，92年為24.3人/10萬人患病，預計2000年，36人/10萬人將患有乳腺癌，也呈上升趨勢。
目前對乳腺癌的治療手段有手術切除、化療、放療及內分泌療法等。化療與放療殺傷癌細胞同時，對人的機體免疫功能亦有很大損害，惡心、嘔吐、脫發、血像改變尤其是白血球降至極低使患者難以耐受以至中斷治療，而內分泌療法具有毒性極微，副作用少，有效時間持續長可明顯改善患者的生活質量，是提高乳腺癌療效的重要途徑之一。自從1971年Jensen等報告了測定乳腺癌標本中的ER能預測病人預后及幫助選擇治療方案以后，有關乳腺癌與ER、PR關系的研究有了很大進展。測定乳腺癌組織中ER、PR含量在臨床上有以下作用(1)為選擇治療方案提供科學依據。(2)預測乳腺癌的臨床進展。(3)預測化療療效。(呂寶璋等，受體學概論P281-283，1991，科學出版社，北京)為此在治療前對乳腺癌的生物學特性進行分類，這對乳腺癌采用何種治療方法及其估測愈后至關重要。
臨床上根據乳腺癌的生物學特性，可將其分為兩類。一類乳腺癌組織含有ER稱為激素依賴性乳腺癌，內分泌治療有效，另一類乳腺癌組織一般不含有ER或含量極低，以至于檢測不到，稱為激素非依賴性乳腺癌，內分泌治療無效，國外報道(Megvire WL，et alEstrogen Receptors in HumanBreast Cancer，An Overview Estrogen Receptors in HumanBreast Cancer，Meguire WL，(eds)，pl，New York RavenPress，1975.)ER陽性者，經內分泌治療有效率可達60％左右，而ER陰性者僅為10％左右。現已達到共識的是檢查ER同時檢測PR表達水平更能提高估測療效及預后的準確率。ER(+)、PR(+)雙陽性者內分泌治療有效率達74-90％(Meguire，WL，etal.Progesterone ReceptorsIntroduction and overviewProgesterone Receptors in Normal and Neoplastictissue，Pl，New York Raven Press，1977；Edwards DP，etalEstrogen and Progesterone Receptor proteins inbreast cancer.Bioc.Biop.Acta.560457，1979)因此為避免盲目用藥，提高乳腺癌的療效，同時測定乳腺癌組織中ER、PR水平是必要的。
目前國內檢測ER的方法有以經典的DCC法(張慧影等。乳腺癌激素受體的研究，中華腫瘤雜志5168，1983)，也有采用酶或熒光標記雌二醇或標記抗雌二醇抗體法(許良中等，腫瘤418，1984；徐薇苓等，腫瘤8160，1988)、后者屬間接反應，且存在熒光淬滅，需熒光顯微鏡等問題，已趨于淘汰，就DCC而言，存在下述缺陷必須用新鮮標本，檢測過程必須保持低溫，所需癌塊大，需液閃等特殊設備，存在同位素污染，另外，每個檢測周期為三天，測定中加入DCC液會破壞激素與受體之間的結合平衡，取材部位不同也影響檢測結果。1986年Guylercq等(CancerRes.464233-4236，1986)報道歐洲多中心研究課題組共8個實驗室分別對同一批臨床乳腺癌病人的組織標本進行了抗ER單克隆抗體的酶免疫試驗(ER-EIA)并同時以生化法做為對照。結果顯示兩種方法在檢測結果上無顯著性差異。但ER-酶免疫試驗的重復性(實驗室內變化系數為6％，實驗室間為11-19％)在一定程度上較生化法(實驗室間變化系數為12-32％)為好。其中六個實驗室ER-酶免疫法和生化法相關分析的結果表明，完全可以用抗ER抗體的ER-酶免疫法替代生化法用于臨床常規ER的檢測。而且ER-酶免疫法能減少DCC法由于基質稀釋和取材部位不當所致的誤差。當標本組織塊對DCC法不適宜或量不夠時，此法提供了重現性強的檢測手段。1987年Thorpe等(Thorpe SM etal Cancer Res.47<24pt1>6572 1987)對191例乳腺癌活檢的新鮮標本也進行了ER-酶免疫法和DCC法比較，兩者高度相關(r＝0.97)，獲得的數據表明，ER-酶免疫法的結果在生物學上更正確，另外Graig Allred于1993年(Am J.Clin.Pathol.991-3，1993)的報告表明檢測ER的免疫組化法(Immunohistochemical method)比DCC法更特異、更敏感。并指出，當標本塊小、腫瘤細胞構成少時，DCC法易造成假陰性；當ER陰性的腫瘤含ER陽性的良性細胞時，DCC法又易造成假陽性。又因PR是E2和ER結合誘導的產物，PR的存在反應了ER的結構和功能均正常，不出現受體后缺陷，這說明檢測PR的重要意義。無論如何應對ER和PR同時檢測雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的檢測方法經典常用的是葡聚糖活性炭包裹吸附法(DCC)法，其原理是利用配基配體結合，以配基標記的同位素顯示結果。(LippmanME，etal，Cancer Res.391447，1979；中華腫瘤雜志，5168，1983)但DCC法存在許多問題，如需要特殊儀器設備測定結果；使用同位素必須具有防護措施；需要癌組織量大，實際工作中約有20-30％的腫瘤手術標本其體積不能滿足DCC法檢測的要求，而且由于取材部位不當或由于腫瘤病理類型不同而導致結果偏差，另外DCC法雖能定量但不能定位觀察，故可能由于系ER、PR陰性的腫瘤含ER、PR陽性的良性細胞而出現假陽性；或是由于腫瘤的異質性以及基質稀釋而致假陰性；該方法費用高又費時；故DCC法不易推廣應用。既使酶免疫法因為是用癌細胞溶液檢測受體水平也不能定位觀察陽性反應成份是癌細胞還是正常(或良性)細胞。而免疫組織化學(IHC)法既克服了上述種種缺點，又廉價快速易于推廣，僅需很少的組織甚至針吸活檢標本或者普通病理石蠟切片即可，鏡下直接觀察ER和PR在組織細胞中的定位和表達水平，能夠排除腫瘤細胞陰性而正常或良性成分是陽性所致的DCC假陽性，敏感性好特異性強。這主要是由于免疫組化法中抗體與其靶抗原—激素受體特異的免疫結合所決定。近十年來，國外經過大量的研究比較證實了測定ER與PR表達水平免疫組化法與DCC法之間高度符合(85-90％)，可以免疫組化法代替DCC法。(Graig Allred，Am J.Clin.Pathol.991-3，1993)免疫組化法雖是半定量，基本可以滿足臨床要求。國外多采用免疫組化法(Marvin T et al Am J.Clin.Pathol.998，1993；Heikki J. Helin etal，Cancer631761，1989).應用免疫組化法首先必須提供抗ER單克隆抗體及抗PR單克隆抗體(McAb)。但因為ER、PR抗原尤其是PR更難以獲得，所以長期以來國內未見有研制抗ER及抗PR抗體的報告。國內只有抗雌二醇(E2)、抗孕酮的抗體，這只能間接檢測ER、PR水平，結果不理想，已趨于淘汰。國外是以合成小肽為抗原制備了抗PR單克隆抗體(DAKO公司172M)以ER的氨基端AB區段為抗原制備抗ER單克隆抗體(ZEMED公司H08-0149B)，用這種抗原制備的抗體檢測ER或PR時，切片標本必須經過微波爐抗原修復處理步驟，在以高溫抗原修復過程中，即使載玻片經過特殊硅化處理后切片標本也非常容易脫落，致使得不到結果，操作繁雜，溫度難以控制；而且，國外制備的抗ER單克隆抗體和PR單克隆抗體售價昂貴。
本發明的目的之一是提供特異敏感、操作簡便又廉價的抗人雌激素受體(ER)及抗孕激素受體(PR)的多克隆抗體與單克隆抗體(McAb)。用于檢測腫瘤患者及激素依賴性的其它疾病患者的ER、PR表達水平。目的之二是建立簡單易行、特異有效的檢測ER、PR的方法。
為了達到本發明目的，本發明人認為必須由抗原入手。首先對ER的分子結構進行分析。ER的C、D段為DNA結合區，C區段高度保守，富含半胱氨酸并折疊形成兩個重復的“鋅指環”結構。其中D段位于ER的配體和DNA結合功能區之間的折疊區段，具有絞鏈結構，即D段位于ER蛋白的表面，用其作抗原制備的抗體，免疫結合反應可能更敏感(Kumar V etal，Cell 1987，51941；受體學概論P276)。B區與保持ER分子生物活性有關。基于上述原理，本研究以ER-BCD區段的表達蛋白產物為抗原，具有結構明確，特異性強，D區處于ER蛋白表面，可提高抗原抗體結合的敏感性。另又根據文獻報道(Glenn S.et al J.Steroid Biochem. Molec.Biol.39(5A)687-692，1991)及從PCGENE微機檢索結果選定PR100-1500bP之間構建表達載體，該區段中含有兩個外露的抗原決定簇。以此表達蛋白產物為抗原制備的單抗可能特異、敏感。基于上述分析基礎，構建PMS-ER，PMS-PR重組質粒，誘導表達的蛋白產物，用此為抗原，制備抗ER、抗PR單抗。
本研究所應用的ER、PR抗原，其制備方法是首先以PCR技術擴增所選定的ER和PR基因片斷→分別再與相同酶切位點的PMS-31表達載體定向連接構成PMS-ER和PMS-PR重組質粒(見圖1.3)→以重組質粒轉化大腸桿菌，使其于25-35℃生長擴增至細菌濁度為0.6-0.8時，再將溫度提高到40-45℃繼續培養≤8小時→收集菌體沉淀→超聲破菌→離心取上清，進行制備性SDS-PAGE電泳，獲取足量的ER、PR，-20℃保存備用。ER、PR表達蛋白產物經免疫結合試驗證實，我們所制備的抗原具有與天然物相同的免疫原性。
用其制備的抗體包括多抗和單抗。ER和PR的多克隆抗體的獲得是用ER、PR表達蛋白產物為抗原加完全和不完全福氏佐劑多次免疫動物，包括兔子、小鼠、大鼠、羊等，獲得與天然ER、PR有結合活性的血清。單克隆抗體的制備方法，是采用雜交瘤技術(Kohler G.and Milstein C.Nature 1975，256495)制備小鼠抗ER單抗和小鼠抗PR單抗，但不限于小鼠，也可用大鼠(Rat Hybridoms and Rat MonoclonalAntibodies P75-115，265-270，Bazin H.CRC Press，Inc.Florida 1990).上述所獲得的多抗及單抗經過三項標準檢測其生物學活性。第一用免疫抗原包板5μg/ml，第二用合成小肽包板，該合成短肽的氨基酸序列取自重組表達蛋白產物(即ER、PR抗原)結構中的一段，包板物濃度5μg/ml，再以常規的ELISA方法檢測自制的抗體與二者均有結合反應；第三用經過DCC法檢測證實ER或PR陽性的乳癌組織的石蠟切片，以自制抗體進行免疫組化染色，產生抗原抗體特異性結合反應。經實驗證實本發明的抗體具有敏感特異，價廉、免疫組化染色時不需要抗原修復處理，操作簡便易行，這是優于國外單抗的特點之一。生產本發明單抗的雜交瘤株保藏于武漢大學CCTCC，其保藏號為96005，96006。
在完成研制具有上述特點的抗ER、抗PR單抗的基礎上，即可達到建立特異有效，靈敏又簡單易行的檢測ER、PR的免疫組化方法。目前，利用進口抗ER、抗PR單抗行免疫組化染色時，組織切片均必需要經高溫煮抗原修復之步驟，而利用本發明研制的抗ER、抗PR單抗進行ER、PR免疫組化染色時，不需要抗原修復，操作步驟簡化，又經實驗證實組織切片經微波爐高溫煮與不煮無差異，均可獲得良好的染色效果。兩種單抗的陽性反應物分別定位于ER和PR陽性細胞的胞核，背景清晰。本發明方法的優點在于步驟簡化，縮短時間，操作簡便易行，重復性好，最大的優點是避免了高溫處理時經常脫片之缺點。其操作程序如下石蠟切片常規脫蠟人水→0.3％H2O2甲醇浸泡，破壞內源性過氧化物酶→常規PBS浸洗，封閉→加抗ER(或抗PR)單抗→常規浸洗后加二抗→浸洗后加酶標記鏈親和素→浸洗后以DAB-H2O2顯色→蘇木精復染，封片。本發明的抗ER單抗和抗PR單抗在科研及臨床均具有廣泛的應用前景及很高的實用價值，不僅能為臨床制定治療方案提供依據，也為進一步研究激素受體與各種疾病的關系提供有效的手段。


圖1.ER-BCD片段與表達載體PMS-31b構成重組質粒示意圖。圖2.重組PMS-ER-BCD表達蛋白電洗脫結果(12.5％SDS-PAGE)1.蛋白分子量標志；2.3.4為重組質粒轉化大腸桿菌，誘導表達4-8小時菌體裂解液電泳圖形；5.6.7將目的帶分別切下，經電洗脫濃縮后電泳圖形；8.9為陰性對照。圖3.PR片段與表達載體PMS-31b構成重組質粒示意圖。圖4.融合蛋白PMS-PR在大腸桿菌中的表達1.蛋白分子量標志；2.3為重組質粒PMS-PR轉化大腸桿菌，未誘導和誘導表達的電泳圖形；4.5.6.7為陰性對照，分別為空載體及大腸桿菌，未誘導和誘導表達的電泳圖形。圖5.重組PMS-PR融合蛋白電洗脫結果(12.5％SDS-PAGE)1.蛋白分子量標志；2.3分別為重組質粒PMS-PR轉染大腸桿菌，未誘導和誘導表達的電泳條帶；4.5.6分別加入10μl、5μl、2μl的電洗脫濃縮的表達蛋白量；7.示5μg牛血清白蛋白的電泳條帶，為參比蛋白定量。圖6.重組PMS-ER表達蛋白Western Blot分析1.蛋白分子量標志；2.3.6.7PMS-ER轉化大腸桿菌；2.6誘導表達；3.7未誘導；4.5為空載體轉化菌未誘導和誘導；2.3正常鼠血清為一抗，陰性對照未見著色條帶。
4.7鼠抗ER-BC血清為一抗，6與4.5.7相比，呈現有明顯增強的蛋白帶，證實ER-BCD蛋白產物具有免疫原性。圖7.免疫親和層析純化兔抗ER-D抗體(12.5％SDS-PAGE)M蛋白分子量標志；1.飽和硫酸銨沉淀的抗ER-D抗體；2.經ER-BCD免疫親和層析柱純化之ER-D抗體。圖8.抗ER-BCD血清Western Blot分析1.經DCC法證實為ER陰性的乳癌組織；
2.3為ER陽性的同一乳癌組織；1.2用抗ER-BCD血清為一抗，3是用ER-BCD表達蛋白產物將抗ER-BCD抗體吸附后作一抗，其它染色步驟與1.2相同；2.在67KD處可見一特異的條帶；3.67KD處條帶消失。圖9.本發明的抗ER單抗免疫組化染色圖10.本發明的抗PR單抗免疫組化染色下面結合實施例對本發明進行詳細描述，意在便于更好地理解本發明而不是限制本發明的范圍。實施例1ER、PR重組蛋白的誘導表達及純化一、ER-BCD重組蛋白的誘導、表達及純化1.ER-BCD重組蛋白的誘導、表達根據對人ER基因全序列的分析設計一對引物，上游序列為5′-CGGC GAATTC ATG GGG GGT TTC CCCC-3’，下游序列為5’-CGGC GGATCC TTA GGC AGC TCT CAT GTC TCC-3’。進行PCR，擴增ER-BCD片段，PCR結束后，進行BamH1、EcoR1雙酶切，制備ER-BCD，再與相同酶切位點的PMS-31表達載體連接構成PMS-ER-BCD重組質粒(ER-BCD表達載體的構建見圖1)。用PMS-ER-BCD重組質粒轉化大腸桿菌，使其于25-35℃生長擴增至細菌濁度為0.6-0.8時，將培養溫度提高到40-45℃繼續培養≤8小時。10000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體，以1ml菌體加0.1ml裂菌液比例，使沉淀復懸。超聲處理，以最大功率處理45秒，沸水中放置10分鐘，于4℃，10000rpm離心10分鐘，取上清20μl+20μlSDS電泳緩沖液，行12.5％的SDS-PAGE電泳，經分析表達蛋白量可達占細菌裂解液中總蛋白量的15％。
2.ER-BCD表達產物的分離及濃縮含重組質粒PMS-ER-BCD的大腸桿菌經25-35℃擴增，40-45℃誘導后，制備超聲裂菌液(見上述)，進行制備性SDS-PAGE電泳純化濃縮PMS-ER蛋白。
(1)制備3mm厚大PAGE膠板，在電泳槽中加入電泳緩沖液。加樣，設置恒流電泳，電流為25mA。
(2)電泳結束后取下膠，將膠置于平皿內，加入4℃，0.1M氯化鉀染色，切下目的蛋白帶并將膠放入透析袋中，在SDS電泳緩沖液中，恒壓200V，電泳4-5小時，將透析袋內的膠條取出，余下的液體在蔗糖中濃縮至適當體積時終止，對PBS透析，紫外分光光度計檢測定蛋白量。
(3)取樣進行SDS-PAGE電泳，分析鑒定。純度較好，呈單一條帶的重組蛋白(見圖2)。圖2中電泳結果，行1為蛋白分子量標志，2、3、4為重組質粒轉化的大腸桿菌40-45℃誘導4-6小時的菌體裂解液的電泳圖形。行5、6、7為將目的帶分別切下，進行洗脫濃縮后電泳，行8、9為陰性對照，分別為大腸桿菌和用PMS-31空表達載體轉化的大腸桿菌，以溫度誘導的結果，無特異的蛋白表達帶。
二、PR重組蛋白的誘導、表達及純化1.PR重組蛋白的誘導、表達(1)根據對人PR基因全序列的分析(受體概論)設計一對引物，上游序列為5’-CGGC GAATTC ATG GCT GCG GTGGAG GTT GAG-3’，下游序列為5’-CGGC GGATCC TTA CTCCGC GCC TTC CTC CTC-3’進行PCR。
(2)將PCR產物用內切酶BamH1、Ecor1進行酶切，再與相同酶切位點的PMS-31表達載體連接構成PMS-PR重組質粒(PR表達載體構建見圖3)用PMS-PR重組質粒轉化大腸桿菌，使其在25-35℃生長擴增至細菌濁度為0.6-0.8時，將培養溫度提高到40-45℃繼續培養≤8小時，10000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體，以1ml菌體中0.1ml裂菌液比例，使沉淀復懸。超聲處理，以最大功率處理45秒，將樣品在沸水中放置10分鐘，于4℃，10000rpm離心10分鐘，取上清10μl+10μlSDS電泳緩沖液，加樣行12.5％SDS-PAGE電泳，剩余樣品保存于-20℃備用。表達蛋白量，經計算機描掃分析，誘導產生的表達產物占細菌裂解液中蛋白總量的15％。(見圖4)圖4中電泳結果第1行為蛋白分子量標志，第2、3行為重組質粒PMS-PR轉化大腸桿菌未誘導和誘導的結果，第4、5、6、7行為陰性對照，第4、5行為PMS-31載體質粒轉化大腸桿菌未誘導和誘導，第6、7行為大腸桿菌未誘導和誘導。
2.PR表達產物的分離及濃縮含重組質粒PMS-PR的大腸桿菌經25-35℃擴增，40-45℃誘導后，以超聲破碎制備裂菌液(方法見上述)。
(1)進行制備性SDS-PAGE電泳，純化、濃縮PMS-PR蛋白(2)電泳結束后取下膠，以0.1M氯化鉀染色。切下目的蛋白帶并將膠條放入透析袋中，在SDS電泳緩沖液中，電泳3-4小時，將透析袋內的膠條取出，余下液體在蔗糖中濃縮至適當體積時終止，PBS透析，紫外分光光度計檢測定蛋白量。
(3)取樣進行SDS-PAGE電泳分析鑒定，呈單一條帶的重組蛋白如圖5，重組質粒表達融合蛋白產物電洗脫結果示意圖。第1行為蛋白分子量標志，第2、3行分別為重組質粒PMS-PR轉染大腸桿菌未誘導和誘導，第3行顯示有明顯增強的表達蛋白帶；第4、5、6行分別加入10μ1、5μl、2μl的電洗脫濃縮的表達蛋白量，第7行示5μg牛血清白蛋白條帶，作為參比蛋白定量。實施例2ER、PR表達蛋白產物性質的鑒定一、ER表達蛋白產物的鑒定主要試劑1.大鼠抗ER-BC血清 (本室自制)2.小鼠抗ER-D血清(本室自制)3.兔抗大鼠IgG血清 (本室自制)4.大鼠單抗PAP (本室自制)5.HRP標記兔抗小鼠IgG(本室自制)6.生物素標記馬抗小鼠(Zymde)7.HRP標記的鏈親和素 (Zymde)8.CNBr-Sepharose 4B (Phamasia)9.TMB顯色底物 (軍事醫學科學院)方法(一)ELISA法鑒定ER-BCD蛋白產物的免疫原性
1.將ER-BCD蛋白產物以包被緩沖液稀釋至5-10μg/ml，包被96孔板，4℃過夜。同樣將BSA、HSA以相同濃度包被。
2.用0.1％的明膠封閉，37℃，30分鐘。
3.分別以小鼠抗ER-D血清和大鼠抗ER-BC血清為一抗，37℃，1小時。
4.以PBS-0.05％Tween20洗滌，3分鐘X3。
5.加入HRP標記的兔抗鼠IgG(1∶100)，37℃，40分鐘。
6.洗滌，方法同上。
7.用TMB底物顯色分別加入A、B液各1滴，室溫顯色15分鐘。
8.加入12.5％的濃硫酸終止反應。
結果ER-BCD表達產物與小鼠抗ER-D血清及大鼠抗ER-BC段血清均顯示特異性結合反應。
(二)Western Blot分析1.將分離純化的ER-BCD蛋白產物，進行SDS-PAGE電泳后，再行電轉移，恒流150mA，2小時，固相支持物為硝酸纖維素膜(NC膜)。
2.封閉，將NC膜置于平皿中，加入3％的BSA-PBS封閉液，4℃，過夜。
3.將NC膜浸于大鼠抗ER-BC血清，陰性對照以正常大鼠血清代替，1∶50-200稀釋，室溫下，緩搖1小時。
4.棄去一抗反應液，PBS洗滌10分鐘/每次X3，緩搖漂洗5.加兔抗大鼠IgG抗血清(1∶100)，室溫下，緩搖30分鐘6.PBS緩搖漂洗，10分鐘/次*37.滴加大鼠PAP(1∶100)，室溫緩搖30分鐘。
8.顯色；NC膜充分漂洗(方法同上)后，侵入新鮮配制的0.5mg/ml DAB，臨用前加H2O21μl/ml，室溫下，當條帶顯色達所需深度時(1-3分鐘)，立刻用水洗膜，再侵入PBS中。結果見圖6重組ER表達蛋白Western Blot分析示意圖。第一條為蛋白分子量標志，第2、3、6、7條為PMS-ER轉化大腸桿菌，誘導，未誘導，4、5條是PMS-31轉化大腸桿菌未誘導和誘導樣品電轉后，2、3條是正常大鼠血清為一抗染色，未見有著色的蛋白帶，4-7是以大鼠抗ER-BC血清為一抗，可見第6與4、5、7相比，呈現有明顯增強的蛋白帶，證實ER-BCD蛋白產物具有免疫原性。
(三)ER-BCD表達蛋白免疫親和層析柱純化抗ER-D血清1.親和層析柱的制備(趙強等，北京醫科大學學報1990，22307)(1)ER-BCD表達蛋白電洗脫純化濃縮后，與PBS及結合緩沖液透析，換液多次。
(2)按10-30mg ER-BCD/g載體的比例，根據需要交聯的量，稱取CNBr-sepharose4B.
(3)操作流程CNBr-sepharose4B↓1mmol/L HCl液浸泡，4℃，15分鐘↓lmmol/L HCl液抽濾洗滌(除去保護劑)↓0.1mol/L碳酸鈉、碳酸氫鈉結合緩沖液快速抽洗至pH中性，與重組ER蛋白液20mg立即混合，加適量結合緩沖液。
↓搖床慢速攪拌，室溫2小時或4℃過夜↓抽濾，測定抽濾液中蛋白含量↓0.1mol/L碳酸鈉、碳酸氫鈉結合緩沖液懸浮裝柱，洗至無蛋白流出(OD280＜0.01)，測定流下液中蛋白量。
↓1mol/L乙醇胺浸泡柱床，封閉剩余反應基團↓0.1mol/L醋酸緩沖液及結合緩沖液循環洗柱二次↓
0.1mol/L甘氨酸一鹽酸緩沖液洗柱↓0.01mol/L PBS洗柱，即為待用狀態(4)偶聯率的計算偶聯率(％)＝(交聯總蛋白量一交聯后抽濾洗下蛋白量)/交聯總蛋白量X100％2.親和層析純化抗ER-D血清取抗ER-D血清以45％飽和硫酸銨沉淀二次→10000rpm離心10分鐘后PBS透析，換液3-4次，紫外分光光度計測蛋白含量。留1/2作對比實驗，另1/2用上述的親和層析柱純化。抗ER-D抗體與柱子作用30分鐘，以PBS洗至OD280＜0.01→2.5mol/L NaCL液洗至OD280＜0.01→2倍柱床體積0.1mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液洗→收集洗下之蛋白液，隨時以1mol/LNaHCO3液中和pH至中性。收集親和柱洗脫下來的抗體蜂，經計算抗體回收率為20.3％。洗脫下來的抗ER-D抗體進行SDS-PAGE檢測，純度大大提高，結果如圖7所示，圖7中的M為蛋白分子量標志，1為經45％飽和硫酸銨沉淀的抗ER-D抗體，有多條蛋白帶；2是經ER-BCD免疫親和層析柱純化后的ER-D抗體，純度明顯提高。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果表明，親和層析純化的兔抗ER-D血清稀釋度較鹽析純提高25倍。免疫組化結果證實，親和層析純化的抗體明顯比血清及鹽析純抗體背景清晰。
經過上述各項鑒定證實ER-BCD表達蛋白具有與天然ER相同結構，并具有與天然ER相同的抗原性。
二、PR表達蛋白產物的鑒定主要試劑1.小鼠抗PR血清(本室自制)以PR合成肽為抗原制備的小鼠抗PR血清。此合成肽氨基酸序列取自重組表達序列中的一段。具體制備方法如下將PR合成肽與蟲戚鑰孔血藍蛋白(KLH)偶聯(分子克隆第二版P856金冬雁等譯，科學出版社，北京，1992)，取此KLH-PR偶聯物20μg/只小鼠/次加等量完全福氏佐劑，充分乳化，皮下多點足塾免疫，每間隔兩周免疫一次，共免疫4次，間歇一個月后，以等量抗原加強，10天后放血取血清，測效價，分裝，-20℃保存備用。
2.過氧化物酶(HRP)標記兔抗小鼠IgG(自制)3.TMB顯色底物，(購自軍事醫學科學院)方法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法鑒定PR蛋白產物的免疫原性1.將PR蛋白產物以包被緩沖液稀釋至5μg/ml，包被96孔板，4℃過夜，同時將BSA，HSA及其無關蛋白以同樣濃度包被
2.棄掉抗原包被液，以0.1％明膠封閉，37℃，30分鐘。
3.加小鼠抗PR抗血清，37℃，1小時。
4.PBS-0.05％Tween20洗滌，5分鐘X3。
5.加HRP標兔抗小鼠IgG(1∶100)，37℃，40分鐘6.PBS-Tween20洗，同4。
7.TMB底物顯色，A、B液各1滴，室溫下，15分鐘。
8.12.5％硫酸終止反應。
結果，PR表達產物與小鼠抗PR血清顯示特異性結合反應，而與對照的無關蛋白不發生反應。
證實PR基因表達產物具有生物活性，可作為抗原制備抗體。實施例3抗ER和抗PR單克隆抗體的制備一、抗ER單克隆抗體的制備1.免疫程序取6-8周齡雌性的BALB/C小鼠5只，取抗原ER-BCD18-60μg/只/次，(制備PR單抗時，以PR表達產物替換ER-BCD)加佐劑(第一次完全，以后用不完全福氏佐劑，并不限于福氏佐劑)皮下多點注射，每間隔7-10日免疫一次，共免疫3-5次，間歇一個月，加強免疫一次，3-5日后取脾融合2.制備免疫小鼠脾細胞懸液。
3.制備普通小鼠飼養層細胞。
4.骨髓瘤細胞的復蘇及培養。
融合前7-10日將細胞由液氮中取出，快速投入37℃水中，用無血清培養基洗一次，加入含小牛血清的完全培養液中，定時換液，使骨髓瘤細胞在融合前處于旺盛對數生長狀態5.融合。
(1)按常規配制選擇培養液HAT、HT及PEG(30％w/v).
(2)將骨髓瘤細胞及免疫脾細胞以1∶5-10比例混合后，將0.5-1ml 30％PEG逐滴加入細胞團中，1分鐘內加完，輕微轉動或彈動離心管。
(3)在不斷轉動離心管時，加入無血清培養液1-5ml，1-5分鐘內加完。
(4)另外20ml無血清培養液在5分鐘內加完。
(5)低速離心500-1000rpm，5-10分鐘，棄上清，加入含有HAT的完全培養液50-100ml，輕輕懸浮混勻。
(6)將(5)細胞懸液種置于帶飼養層的96孔板中，每孔加100-200ul。
(7)置于5％二氧化碳溫箱中培養，2-3周出現雜交瘤細胞集落，要及時檢測、篩選、克隆。
6.雜交瘤細胞檢測、克隆(1)以ER-D段合成肽(檢測PR單抗時PR合成肽包板)包板5μg/ml，50μl/孔，4℃過夜。
(2)PBS洗板，0.1％明膠封閉，室溫30-60分鐘。
(3)棄去多余的封閉液，按標記次序加入有雜交瘤細胞集落生長孔內的上清，50μl/孔，同時設陰性對照及陽性對照孔。室溫反應1小時。
(4)含0.05％Tween-20的PBS洗板3-4次。
(5)加過氧化物酶標記兔抗小鼠IgG，50μl/孔，室溫1小時(6)洗板，TMB底物顯色15分鐘，12.5％硫酸終止反應。
(7)選擇陽性反應孔，取雜交瘤細胞，以有限稀釋法克隆。
(8)以上述方法反復篩選、克隆，至少連續克隆3次，仍穩定分泌單抗的雜交瘤細胞液氮凍存，取其上清，進一步做免疫組化檢測。
(9)免疫組化檢測A.取已知ER陽性及ER陰性的(檢測PR單抗時取已知PR+及PR-)乳癌組織石蠟切片，常規脫蠟入水，0.3％H2O2-甲醇浸泡30-40分鐘，PBS洗。
B. 0.1％明膠封閉，30-60分鐘。
C.棄去多余的封閉液，加待檢上清，37℃，1小時或4℃過夜。
D. PBS洗5分鐘X3。
E.加Bioten標記馬抗小鼠IgG，室溫30-40分鐘。
F. PBS洗5分鐘X3，加HRP標鏈親和素，室溫30-40分鐘G. PBS洗5分鐘X3，加新鮮配制的DAB(0.5mg/ml)+H2O2(1μl/ml)，3-5分鐘。
H.常規脫水、封片、鏡檢。
結果陽性反應物定位于胞核，呈棕黃色染色。
二、抗PR單克隆抗體的制備抗PR單抗的制備方法同ER單抗的制備方法。免疫用的抗原改為PR表達蛋白產物，檢測PR單抗時，用PR合成肽為抗原包板，免疫組化鑒定時取用已知PR陽性及PR陰性的乳腺癌組織石蠟切片，除此外，其它實施步驟同ER。實施例4抗ER單抗、抗PR單抗性能的鑒定一、抗ER單抗性能的鑒定
1.抗ER單抗效價檢測以ER-D合成肽為抗原包板，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測抗ER單抗效價為1∶800-1600。并且ER單抗與無關蛋白呈陰性反應。
2. Western Blot分析將經DCC值證實ER陰性及陽性的乳腺癌標本在TED緩沖液中勻漿，再行SDS-PAGE電泳后再轉膜，一抗分別用(1)小鼠抗ER-BCD抗體(2)用ER表達蛋白產物預吸附以后的小鼠抗ER-BCD其余操作步驟同前。經抗ER-BCD血清染色結果見圖8。圖中1是經DCC法證實為ER陰性的乳癌組織，2、3為ER陽性的同一乳癌組織。1、2均用小鼠抗ER-BCD血清作一抗，3是將小鼠抗ER-BCD血清用ER-BCD表達蛋白產物吸附以后作一抗以后的染色步驟與1、2同步進行。最后1無特異帶顯示出來；2在67KD處可見有一特異的增強帶；而一抗血清經ER-BCD預吸附后，該增強帶消失，如圖中3。
3.免疫組化檢測抗體的性能用抗hER單抗為一抗，其它的免疫組化操作步驟同前。
(1).自制抗ER-BCD血清與進口ER抗體免疫組化結果比較。檢測了17例乳腺纖維腺瘤、乳腺增生和8例乳腺癌石蠟切片。陰陽性總符合率88％(22/25)。本發明的抗體與進口抗體的免疫組化結果呈正相關。(P＜0.001)(2).自制抗ER-BCD抗體免疫組化結果與DCC值的比較。共檢測47例乳腺癌標本。陰陽性符合率為95.5％(43/45)。P＜0.001。陽性反應物定位于ER陽性細胞核，呈棕黃色。(見圖9)圖中乳癌細胞胞核被染成棕黃色。該圖中示為黑色。
二、抗PR單抗性能的鑒定1.抗PR單抗效價檢測以PR合成肽為抗原包板，酶聯免疫吸附法(同前)檢測其效價培養上清效價為1∶100-1000，腹水效價為1∶106-107。與無關蛋白呈陰性反應。
2.免疫組化檢測抗體的性能分別以進口PR抗體及本發明的PR抗體為一抗檢測30例乳腺癌組織石蠟切片，操作步驟分別如下(1)進口抗PR單抗操作步驟石蠟切片常規脫蠟入水→0.3％H2O2甲醇溶液浸泡30分鐘→PBS浸洗5分鐘X3→枸櫞酸緩沖液中于92℃-98℃，8-10分鐘后在室溫冷卻10分鐘→0.1％明膠封閉→PBS洗5分鐘X3→加一抗PR抗體，4℃過夜，以后步驟同前。
(2)本發明的抗PR單抗操作步驟平行檢測兩個標本，一個標本完全按進口抗體的操作程序，將切片予以抗原修復，高溫處理(以下簡稱煮片)，另一標本不進行抗原修復(以下簡稱不煮片)。其它步驟同上。其結果是自制抗PR單抗對煮與不煮的標本染色效果無差別，而進口抗體要求標本必須煮，使之操作復雜，致使經常脫片。自制抗PR抗體免疫組化染色結果與DCC值與進口抗體結果符合率達90-95％。PR免疫組化陽性反應物定位于PR陽性細胞胞核，呈棕黃色。如圖10所示。圖中心及右上角處圓形或近圓形的黑色著染的即是乳癌細胞胞核。
經上述各項檢測，證實本發明的抗ER單抗及抗PR單抗性能良好，與天然ER、PR具有特異結合能力。用其進行免疫組化染色時操作步驟比進口同類產品簡單易行，染色效果好，具有廣泛的臨床及科研應用前景。
權利要求
1.一類檢測激素依賴性腫瘤及其它疾患的雌激素受體(ER)水平之生物試劑，包括由具有96005鑒定特征的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞，它是由用PMS-ER-BCD抗原免疫的小鼠之脾細胞與骨髓瘤細胞融合、篩選、克隆而成。
3.根據權利要求2所述的PMS-ER-BCD抗原，是以ER之BCD段片與表達載體構建PMS-ER-BCD重組質粒，誘導表達的蛋白產物。
4.一類檢測激素依賴性腫瘤及其它疾患的孕激素受體(PR)水平之生物試劑。包括由具有96006鑒定特征的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
5.根據權利要求4所述的雜交瘤細胞，它是由用PMS-PR抗原免疫的小鼠之脾細胞與骨髓瘤細胞融合、篩選、克隆而成。
6.根據權利要求5所述的PMS-PR抗原，是以PR之片段與表達載體構建PMS-PR重組質粒，誘導表達的蛋白產物。
7.一種檢測ER、PR水平的免疫組化方法，其特征在于用此權利要求1、4所述的ER、PR兩種單克隆抗體，進行對ER、PR水平的免疫組化檢測。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于對病理組織切片不需要進行高溫處理的抗原修復之步驟。
全文摘要
本發明涉及一類用于臨床及科研檢測雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的生物試劑,包括有多克隆抗體、單克隆抗體,其意義在于可用于臨床檢測乳癌及多種激素依賴性疾病患者的ER、PR水平,指導臨床實施內分泌治療及估測預后,亦可用于研究ER、PR與腫瘤及各種疾病的關系。
文檔編號G01N33/577GK1183560SQ9612072
公開日1998年6月3日 申請日期1996年11月26日 優先權日1996年11月26日
發明者孫素蓮, 張蕾, 何洛文 申請人:北京市腫瘤防治研究所, 北京盛京高科技開發公司