測定各種痕量樣品中生物活性物質的熒光定量分析方法

專利名稱：：測定各種痕量樣品中生物活性物質的熒光定量分析方法表發明涉及用熒光分析測定各種痕量樣品中生物活性物質的方法，它包括用鑭系螯合物進行標記，形成一種強熒光凝聚微粒并采用時間分辨熒光進行測量。將含有鑭系金屬離子(Eu3+，Tb3+和Sm3+)的鑭系螯合物作為標記物，用熒光特別是時間分辨熒光光譜測定生物活性物質的分析方法已眾所周知。美國專利No.4,058,732和No.4,374,120敘述了在以生物親和反應為基礎的分析測試中時間分辨熒光的應用。在時間分辨熒光中，以短的光脈沖激發熒光標記物，待由任何干擾源而來的熒光消逝后再檢測熒光。某些鑭系螯合物如銪，鋱和釤的螯合物具有長壽熒光，所以它們是時間分辨熒光分析的適宜標記物。標記物熒光的測量可以在它們結合于抗原或抗體時進行，也可以將鑭系元素從抗原或抗體上分離出后進行，即在測量前加入一種含有β-二酮，協同化合物和表面活性劑的低pH值溶液解離鑭系離子并將其轉變為新的熒光螯合物(美國專利No.4,565,790)。美國專利No.5,316,909敘述了一種改進方法，即在熒光測量前，將鑭系元素螯合物的分子轉變成具有很強熒光的凝聚微粒，該微粒既含有鑭系螯合物，也含有一種熒光增強離子螯合物。在凝聚微粒中，特異的鑭系螯合物的熒光得到了極大增強，這就是所謂的共熒光增強。本發明乃是基于將共熒光增強與控制標記組份含量在低水平相結合，通過生物親合反應和時間分辨熒光分析定量測定各種痕量樣品如耳血或指血或其他體液中生物活性物質，本發明的目的是通過上述結合和采用相應的技術實現在痕量樣品中進行生物活性物質的定量測定，其測定靈敏度應滿足臨床要求。根據本發明所擬定的方法，既可適用于一種痕量樣品，也可同時適用于多種痕量樣品。這將促進臨床檢測生物活性物質向微量，靈敏，方便和安全的方向發展。利用親合反應來測定生物活性物質時，測定靈敏度可用下式表示影響劑量響應曲線的斜率的因素有1.親合反應中，反應物對的親合常數Ka；2.標記物及其標記比活性；3.親合反應后，檢測標記物的方法，包括測量儀器和測量前對標記物的化學處理；4.用于測定的樣品量。影響零劑量時信號測量誤差的因素有1.零劑量時的信號水平(對非競爭法而言)；2.測量儀器的穩定性；3.分析人員的實驗誤差。任何以同樣倍數放大或縮小S和ΔR的方法和手段均不能改變靈敏度的大小。已提出的共熒光增強法(美國專利No5,316,909)，就是在測量前對標記物作了某種特殊的化學處理，使得標記物的熒光得到了很大增強，從而提高了S值。表1列出了用一種共熒光增強法和DELFIA直接熒光增強法測定純Eu3+離子得到的熒光水平，背景熒光，檢測限及兩者的比較。表1</tables>與直接熒光增強法相比，共熒光增強法雖然可以提高熒光強度71倍(也提高s值71倍)，但是檢測限(靈敏度常以檢測限表示)卻只改進了15.6倍，這是因為背景熒光也提高了4.6倍，使ΔR也提高了大約相同倍數。當將共熒克增強法用于以Eu3+標記和雙抗體夾心法為基礎的時間分辨免疫熒光分析時，并不是總可以明顯地提高靈敏度，這種情況往往出現在非特異結合較高的測定中。這時，雖然特異的標記物的熒光得到了很大增強，由非特異結合而來的熒光也得到了很大增強，使零劑量時信號水平上升很多。在試劑儀器條件和測定方法均已固定的情況下,提高靈敏度的一個最簡單有效的方法是增加取樣量，例如將取樣量從25μl增加到100μl甚至200μl。但這種做法受到進行親合反應的總體積和樣品來源的限制。就DELFIA系統而言，總反應體積一般為200～250μl，最大不能超過300μl。本發明的目的就是開發出一種痕量(1～5μl)樣品的熒光定量分析方法，其靈敏度可以與常規時間分辨熒光法(如DELFIA法)相比較。DELFIA法的一般取樣量為25μl或50μl血清，當將取樣量下降到1～5μl全血(約0.5～2.5μl血清)時，若要仍維持其原有的測定靈敏度，不采取某些特殊而有效的手段是不行的。對非競爭法而言，在熒光測量前采用共熒光增強法，固然可以將標記物的熒光水平提高幾十倍之多，而零劑量時的信號水平也大大提高了，從而使ΔR明顯上升，這嚴重影響靈敏度的提高。零劑量時的信號主要有兩個來源1.所使用的共熒光增強液的背景熒光。2.親合反應進行過程中產生的非特異結合。前者可以通過選擇合適的試劑和合適的配制方法控制在合理的水平，如表1所示的1,450cps。但是要將非特異結合控制在較低水平卻往往不易做到。我在一個采用了共熒光增強法的測定LH的時間分辨免疫熒光分析中考察了標記抗體用量對非特異結合和LH信號水平的影響，結果見表2和圖1.當標記抗體用量下降時，一定量LH的特異信號和非特異結合均呈下降趨勢，但非特異結合的下降速度卻比LH信號快得多。這就提示，控制標記抗體用量在低水平，例如1～20ng，最好為2～10ng，可以提高靈敏度。我發現，將共熒光增強法與控制標記組份含量在低水平相結合是使靈敏度不致下降而又能定量測定痕量(0.5～10μl，最好為1～5μl)樣品中生物活性物質的一個巧妙選擇，這一做法的成功也意味著通過上述結合，提高了測定的絕對靈敏度。表2對競爭法而言，上述結合對提高靈敏度同樣可以起到很好的作用。在競爭法中，影響靈敏度的最重要因素是親合常數Ka值的大小。在Ka值足夠大的情況下，可以通過控制標記抗原的量在低水平，以提高靈敏度，但這要受到下述因素的限制，即反應體系的總的信號水平不可太低，否則測量誤差太大。在控制標記抗原量在低水平的同時，又采用共熒光增強法，就大大減輕了這一限制因素的作用，使得能夠以合適的靈敏度測定極少量樣品中生物活性物質。本發明的重要意義是顯而易見的。目前尚沒有一個常規臨床分析方法能夠應用生物親合反應在1～5μl全血等各種痕量樣品中定量測定多種生物活性物質。一般常規的方法如放射免疫分析(RIA)，酶免疫分析(EIA)和熒光免疫分析(FIA)等，其做法一般是由靜脈穿刺取血數毫升。分離出血清后用于各種化驗。在某些新生兒篩查的特殊測定中，可采用少量干血作為樣品，但由于靈敏度的限制，這種類型的測定尚不能用于測定許多其他生物活性物質。當采用耳血或指血作為樣品時，則可以避免穿刺靜脈即可進行常規定量測定許多生物活性物質，這無疑將會受到廣大患者的歡迎。而且，用于測定的樣品不限于液態，可以將樣品采于濾紙上，干燥后，用穿孔器取下一個3～5mm直徑的紙片干樣用于分析，采用紙片干樣作為樣品的好處是樣品便于保存和運輸，甚至可放在信封中郵寄。這種做法給某些疾病(例如癌癥)的普查和早期診斷提供了一個切實可行的方法，而且特別適用于邊遠山區的人群，只要是郵政能達到的地方，即可進行本發明所提供的常規定量化驗檢查，其化驗檢查的項目數量并不會亞于RIA，EIA和FIA等。另外，本方法還可以設計成同一個方法同時適用于多種痕量樣品(血清，血漿，全血，尿和其他體液的液態樣品或紙片干燥樣品，這給臨床應用進一步帶來方便。以下實施例對本發明作進一步說明例1用時間分辨免疫熒光分析測定耳血中hAFP單克隆抗-hAFP抗體的標記在pH9.5的碳酸鹽緩沖液中以50倍克分子過量的N1-(對-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸的銪螯合物進行標記。用凝膠過濾將標記抗體從游離標記試劑中分離出來。用單克隆抗-hAFP抗體包被樣品板用于包被的單克隆抗-hAFP抗體與標記用抗體不同，它是直接針對hAFP分子上不同的特異抗原結合位點的。包被在pH9.5的碳酸鹽緩沖液中進行，每孔加1μg抗體，在室溫下溫育過夜，洗滌后用0.1％BSA飽和封閉。樣品收集血斑樣品的獲取是通過穿刺耳垂將耳血滴到濾紙上，使血全部覆蓋和浸透濾紙上的取樣圓圈，平放濾紙至少2小時以使血斑干燥。采用液態耳血作為樣品，可取耳血68μl加入到500μl試驗緩沖液(見下)中，混勻后取25μl作為樣品進行測定。免疫分析在pH7.7的0.05MTris-HCl試驗緩沖液中進行免疫反應，緩沖液還含有9g/lNaCl，0.05％NaN3，0.5％BSA，0.05％牛球蛋白和0.01％吐溫40.在包被孔中加入不同量的標準hAFP或直徑為3mm的干血紙片樣品(含全血3.0μl)或上述稀釋后的25μl液態耳血，在上述介質中作第一次溫育(室溫下1小時)，洗滌后每孔加入5ngEu標抗體作第二次溫育(室溫下1小時)，洗滌6次后每孔加入200μlEa溶液(Ea溶液組成30μMTTA，1.5μMY3+，0.06％(W/V)曲拉通X-100，20％乙醇，溶液用乙酸調節pH至3.2)，振蕩3分鐘以解離Eu3+離子，然后每孔加入20μlEb溶液(Eb是含有0.4mM鄰菲羅啉的0.2MTris溶液)，振蕩7分種以提高熒光強度，用時間分辨熒光儀測定每孔熒光強度，熒光儀測量參數激發光脈沖固期1ms，延遲時間400μs，計數時間400μs。圖2是本測定的標準曲線。從同一個人靜脈取血分出血清，并取耳血制干血紙片樣品和稀釋的液態樣品(見上)，用DELFIAhAFP商品試劑盒測定血清樣，用本法(CFES)測定紙片干血樣品和液態樣品，分析63人樣品所得到的結果的比較如圖3，圖4和圖5所示。這三個圖表示了DELFIA血清法(DELFIA.CFES干血法(CFES(干))和CFES液態樣品法(CFES(液))兩兩之間的相關性。相關方程分別為DELFIA＝0.165+1.933CFES(液)，r＝0.98；DELFIA＝0.139+2.101CFES(干)，r＝0.94；CFES(干)＝0.151+0.863CFES(液)，r＝0.97。例2用時間分辨免疫熒光分析測定耳血紙片樣品中CEA標記和包被方法，樣品收集和免疫分析過程均與例1類似，只是標記和包被抗體均為單克隆抗-CES抗體，它們分別針對CEA分子上不同的結合位點。測定CEA的標準曲線如圖6所示。圖1標記抗體用量對非特異結合和LH信號水平的影響非特異結合LH信號水平圖2用時間分辨免疫熒光分析測定耳血中hAFP的標準曲線圖3測定hAFP的液態全血CFES法與DFLFIA血清法的相關性圖4測定hAFP的干血CFES法與DELFIA血清法的相關性圖5測定hAFP的液態全血CFES與干血CFES法的相關性圖6用時間分辨免疫熒光分析測定耳血紙片中CEA的標準曲線權利要求1.一種用于測定各種痕量樣品中生物活性物質的熒光定量分析方法，其特征在于它包括下列步驟(1)用鑭系螯合物標記一個或幾個生物親合性組份；(2)標記組份參加生物親合反應，反應中控制標記組份的含量在低水平，以下降非特異結合；(3)解離鑭系螯合物，并形成具有強熒光的凝聚微粒；(4)用熒光特別是時間分辨熒光測定鑭系離子的含量。2.按照權利要求1，標記組份的低水平為1～20ng，最好為2～10ng。3.按照權利要求1，生物活性物質是抗原，抗體和體液中其他生物活性物質。4.按照權利要求1，樣品的痕量是指0.5～10μl，最好是1～10μl。5.按照權利要求4，樣品是包括干血在內的全血，血清，血漿，尿和其他體液。6.按照權利要求1，鑭系離子是Eu3+，Tb3+，Sm3+和Dy3+。7.按照權利要求1，凝聚微粒是將Eb加入到Ea中形成，Eb是含有1，10-菲羅啉和緩沖劑的水溶液，Ea是含有一種β-二酮，一種熒光增強離子和一種表面活性劑的水溶液或水-乙醇溶液。8.按照權利要求7，β-二酮是噻吩甲酰三氟丙酮或三甲基乙酰基三氟丙酮。9.按照權利要求7，熒光增強離子是Y3+，Gd3+或Tb3+。10.按照權利要求7，表面活性劑是曲拉通類型的表面活性劑。11.按照權利要求1，熒光定量分析方法可設計成只適用于一種痕量樣品測定，也可以設立成同時適用于兩種或更多種痕量樣品的測定。全文摘要本發明涉及測定各種痕量樣品中生物活性物質的定量分析方法。它基于使用熒光,特別是時間分辨熒光來定量測定生物活性物質,例如抗原,抗體等。本分析法包括用鑭系螯合物標記一個或幾個參與生物親合反應的生物親合性組分,反應中控制標記組分的含量在低水平以下降非特異結合,反應后形成可用于熒光測量的鑭系螯合物,然后測定該螯合物的熒光,在熒光測量前,形成一種由鑭系元素參與的鑭系螯合物和熒光增強離子螯合物所組成的具有強熒光的凝聚微粒。文檔編號G01N33/53GK1181501SQ96120258公開日1998年5月13日申請日期1996年10月30日優先權日1996年10月30日發明者楊祺,徐照紅申請人:楊祺,徐照紅