專利名稱：腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物的克隆及其應用的制作方法
腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物的克隆及應用，涉及基因工程生物技術，特別涉及分子生物學中的病毒基因克隆技術。
腎綜合征出血熱(HFRS)是由肯尼亞病毒漢坦病毒屬(HantaVirus)中某些病毒引起的人類急性傳染病。近年來迅猛發展的基因檢測法(PCR法)是從核酸水平上檢測病毒。此法靈敏度高，特異性強，能在早期的臨床標本中直接檢測病原體，如肺炎桿菌、結核桿菌、幽門螺桿菌、各型肝炎病等，其基因診斷試劑盒已進入了臨床實驗室。然而迄今為止，尚未有以病人血清為標本，用PCR法直接檢測腎綜合征出血熱病毒的技術。
由上海市南匯縣南華醫院即我院申請的申請號為96116395.x、發明名稱為腎綜合征出血熱病毒的基因檢測方法及檢測試劑盒的發明專利所提供的方法是直接以病人血清為分析樣品，提取出血熱病毒的RNA，經過逆轉錄(RT)、CDNA的合成，PCR擴增，然后對PCR的擴增產物進行電泳鑒定，如果標本擴增帶與陽性參照物擴增帶同一位置上出現光帶，則可判定標本為陽性，顯示出血液中存在出血熱病毒，反之則無。該發明專利中所提供的檢測試劑盒中的陽性參照物是采用(1)已確診患有出血熱病的病人血清，(2)市售的PCR marker。用病人血清作為陽性參照物，存在著如下問題1、來源較困難，固出血熱病毒血癥期短，不易得到早期標本；2、病人血清，不易較長時間保存；3、采用病人血清經PCR擴增后，電泳鑒定時可能會出現雜帶而給結果的判斷帶來困難。而用市售PCR marker作為陽性參照物價格又很昂貴。出血熱病毒的克隆當然是很好的陽性參照物，然而迄今為止尚無有此種技術。
本發明的目的在于提供一種腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物的克隆，它是采用由我院申請的申請號為96116395.x發明專利所提供的方法，對所獲得的漢坦病毒基因的PCR擴增產物進行克隆，這種克隆可放在腎綜合征出血熱病毒的檢測試劑盒中作為檢測的陽性參照物。
本發明的目的通過如下技術實現。
克隆是選擇一種質粒為載體，用內切酶切開環狀的質粒載體，所需插入于被切開的質粒的插入物用酶補平其末端，再用連接酶把經酶切的質粒載體和插入物重新連接成環狀得到重組質粒，再把它轉化到宿主菌，通過細菌培養獲得大量的重組質粒，可用于PCR陽性對照。本發明的技術特征在于，連接到已酶切的質粒載體中的連接物(或稱插入物)即PCR產物是直接以病人血清為分析樣品，以異硫氰酸胍為裂解液、醋酸鈉作為RNA沉淀劑，提取腎綜合征出血熱病毒的RNA，經過逆轉錄、合成CDNA，做第一次PCR擴增，再做巢式PCR，進行第二次擴增，然后以電泳檢測后(可以PCR marker對照)，確定為具有出血熱病毒基因的擴增片斷在390Bp-430Bp的PCR擴增產物。
做第一次PCR擴增的擴增引物采用核苷酸位置 引物序列primer1 30-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631 AAT ATC AAA GAT CCC ATG第一次PCR擴增需在擴增儀中循環35次，擴增片段為618Bp，將第一次PCR擴增產物做巢成PCR。進行第二次PCR擴增，第二次PCR擴增的擴增引物是核苷酸位置 引物序列primer130-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT取得擴增片段為430Bp的PCR產物。
在做第二次PCR擴增時，擴增引物也可以核苷酸位置 引物序列primer4 70-89GCC AGT TTA GTA TGG GCTprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT組成一對引物，則得到擴增片段為390Bp的PCR產物。
克隆時選用雙鏈環狀的PGEM-3zf(+)質粒作為載體，用內切酶smaI切開環狀載體，直接從腎綜合征出血熱病人血清中獲得的漢坦病毒的PCR產物用klenow修飾酶補平其末端，再用T4DNA連接酶把已酶切的載體和根據上述方法制備的PCR產物重新連接成環狀，得到重組質粒，將它轉化至宿主菌，宿主菌采用大腸桿菌JM109感受態細胞，通過細菌培養獲得大量重組質粒。所述的大量重組質粒是否確已獲得可通過以未克隆的PGEM-3zf(+)質粒為對照走瓊脂糖電泳來鑒定。該大量重組質粒即可用作為腎綜合征出血熱漢坦病毒檢測試劑盒的陽性參照物，將它與應用申請號為96116395.x所提供的PCR方法獲得PCR產物，共同走電泳，可用于出血熱病的診斷。
本發明的優點在于1、以經克隆的重組質粒作為陽性參照物易于保存，用于電泳鑒定時易于判斷。2、克隆得到的重組質粒還可用來檢驗試劑盒的質量及操作是否正確。因為重組質粒克隆了漢坦病毒的基因擴增產物，它的電泳結果應該肯定呈陽性，如果呈陰性則可判定為試劑盒的試劑質量或操作有問題。
下面提供詳細的實施例以對本發明的技術方案作進一步說明。
1、質粒載體酶切選用PGEM-3zf(+)質粒，用smaI酶切取PGEM-3zf(+) (2ug/ul)(ug為微克、ul為微升) 2ul
SmaI (lou/ul) 1ulBufferI 2ul蒸餾水15ul共20ul混和液在25℃溫度下保溫1小時后置70℃保溫10分鐘以滅活SmaI。取出4ul上述混和液走瓊脂糖電泳，以未切過的PGEM-3zf(+)質粒為對照，判斷是否酶切完全，然后于-20C保存。
2、PCR產物處理采用由我院申請的申請號為96116395.x、發明專利所提供的方法，出血熱漢坦病毒基因擴增產物即PCR產物用klenow酶補平其末端。
取PCR產物40ul klenow(5u/ul)(u為單位)在37℃下保溫30分鐘，加4ul、3mol(摩爾)、PH為5.2的醋酸納，再加入80ul無水乙醇，置于-70℃保溫15分鐘，以轉速為10000rpm，離心15min(分鐘)，用70％乙醇洗滌，經真空干燥，溶于5ul無菌水，于-20℃保存。
3、連接取酶切過的PGEM-3zf(+)1ul處理過的PCR產物 5ulT4DNA連接酶(3u/ul) 2ul10×連接酶緩沖液 1ul無菌H2O 1ul共10ul混和液在22℃保溫3hrs(小時)后于-20℃保存。
4、轉化應該說至上述步驟已完成了克隆過程，但為了驗證PCR產物已克隆到了質粒載體，取得了重組質粒，需要將其轉化到宿主菌，經細胞培養，以獲得大量的重組質粒，再進行鑒定。
把已連接了PCR產物的質粒載體轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞。從-20℃取出JM10g感受態細胞，置于冰上5min至融化。取100ulJM109感受細胞至預冷的載菌玻璃試管。加入10ul已連接了PCR產物的質粒載體，輕輕敲打混勻后置于冰上10min，于42℃保溫45-50sec(秒)，立即置于冰上2min，加入900ul∠B(培養液)，于37℃，225rpm振蕩培養1hr，取100ul涂布于含100ug/ml氨芐青霉素、0.5MIPTG(指示劑)，40ug/ml×-gal的∠B平板，37℃培養過夜。
5、鑒定挑出白色菌落進行酶切鑒定。已連接了PCR擴增片段的重組質粒是呈白色的菌落，而呈藍色的菌落則是未連接PCR擴增片段的質粒。挑出白色菌落，接種于21ul含100ug/ml氨芐青霉素的∠B培養液，37℃、225rpm振蕩培養過夜。留出一點菌種后其余用promga(上海普洛麥格生物產品有限公司)生產的Wizand Minipreps DNA純化系統抽提質粒。取一部分走瓊脂糖電泳，以未克隆的PGEM-3zf(+)質粒作對照看分子量是否變大，可初步確定重組質粒。
為了進一步確定是否已取得了重組質粒還可以雙酶切鑒定。
小量抽取重組質粒10ul(-1ug)，以ECORI(12u/ul)1ul、HindIII(10u/ul)1ul二個內切酶雙酶切，加Muticore Buffer 2ul，無菌水6ul共20ul于37℃下保溫1-2小時，走電泳，同時以PCR產物為對照，看有否比PCR產物分子量大51Bp的片段。該片段比PCR產物分子量究竟大多少，取決于所選擇的二個內切酶，該二個內切酶決定了質粒被酶切的位置。最后，以重組質粒為模板，進行PCR擴增，產生的片段與血清PCR產物比較(對照市售的PCRmark)，二者的分子量應相一致。
上述的重組質粒可作為出血熱病毒基因檢測試劑盒中的陽性參照物，用以對出血熱病人的確診。其電泳鑒定的方法如下吸第二次腎出血熱病毒PCR擴增產物的下層水相10ul和3ul溴酚蘭染色液混勻，在2％瓊脂糖凝膠上點樣(凝膠含0.5ug/ul溴乙錠)，以腎綜合性出血熱病毒PCR產物的克隆為陽性參照物經TAE電泳緩沖液電泳20-30分鐘，電壓為5V/cm，在暗室中用紫外透視儀檢測結果，如果標本擴增帶與陽性參照物擴增帶同一位置上出現光帶，可判定標本為陽性，顯示血液中有出血熱病毒，反之則無。
權利要求
1.腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物的克隆，選擇一種質粒為克隆載體，用內切酶切開環狀的質粒載體，需連接的PCR產物用酶補平其末端，用連接酶把經酶切的質粒載體和需連接的PCR產物重新連接成環狀取得重組質粒，再把它轉化到宿主菌，通過細菌培養獲得大量的重組質粒，其特征在于連接到已酶切的質粒載體中的PCR產物是直接用病人血清作為分析樣品、經PCR擴增后，鑒定為陽性病人的血清PCR產物，是擴增片段為390Bp-430Bp的PCR產物，它通過如下方法獲得直接以病人血清作為分析樣品，以異硫氰酸胍為裂解液、醋酸納作為RNA沉淀劑，提取腎綜合征出血熱漢坦病毒的RNA，經過逆轉錄、CDNA的合成，做第一次PCR擴增，擴增引物是核苷酸位置引物序列primer1 30-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer2 648-631 AAT ATC AAA GAT CCC ATG擴增片段約為600BP，經循環擴增后，將第一次PCR擴增產物做巢式PCR，進行第二次PCR擴增，第二次PCR的擴增引物是核苷酸位置 引物序列primer1 30-49CAA TCA GCA ACA TGG GGA TAprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT經循環擴增，取得擴增片段約為430Bp的PCR產物；做第二次PCR擴增時，擴增引物采用下列一對引物核苷酸位置 引物序列primer4 70-89GCC AGT TTA GTA TGG CCT GTprimer3 460-443 GGC TTG CAG TAA GTG CT經循環擴增，則取得擴增段為390Bp的PCR產物。
2.根據權利要求1所述的腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物的克隆，其特征是克隆的載體采用雙鏈環狀的PGEM-3zf(+)質粒，用內切酶SmaI切開環狀載體，直接從病人血清中獲得的腎綜合征出血熱漢坦病毒的PCR產物用Klenow修飾酶補平其末端，再用T4DNA連接酶把已酶切的載體扣PCR產物重新連接成環狀，獲得已插入PCR產物的重組質粒。
3.腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物克隆的應用，其特征在于克隆了該病毒基因PCR產物的重組質粒可用作為出血熱病毒基因檢測試劑盒中的陽性參照物，用以對出血熱病人的確診。
全文摘要
腎綜合征出血熱漢坦病毒基因擴增產物的克隆及其應用。以PGEM-3zf(+)質粒為載體，用內切酶切開該環狀質粒。將直接以病人血清作為分析樣品，以擴增片段為390Bp-430Bp的PCR產物用酶補平其末端，用連接酶把它連接到已酶切的質粒上成為環狀的重組質粒，重組質粒可作為出血熱病毒基因檢測盒中的陽性參照物，用以對出血熱病人的確診。基因檢測法靈敏度高，特異性強，該陽性參照物易于保存，用于電泳鑒定，易于判斷，且可用于試劑盒的質量及操作正確與否的檢驗。
文檔編號G01N33/569GK1152030SQ9611658
公開日1997年6月18日 申請日期1996年11月21日 優先權日1996年11月21日
發明者儲峰, 季青, 嚴潤民, 王霞明 申請人:上海市南匯縣南華醫院