專利名稱：改進的生物標本圖象分析儀的制作方法
技術領域：
本發明涉及改進的生物標本圖象分析儀。
在本世紀八十年代，對癌癥的診斷檢測取得了重大突破，誕生了細胞圖象分析技術Image cytometry(簡稱ICM技術)，美國CAS公司在九十年代初期推出了生物圖象分析儀(CAS-200)，見USP4741043，4887892的報道。該分析儀是根據人體正常細胞DNA的含量是一個恒值，質量值為7.18pg(1pg＝10-12)的原理，以7.18pg為基準值(常用Di值＝1表示)來比對測量出Di＞1的異倍體，并用分布直方圖及各種測量數據結果來提供癌變的各種定量特征，專門編制了一套識別挑選軟件程序，以幾何形態與光密度二項參數從數學模式上建立7.18pg標準，然后以形態、面積、光密度大小去找相符合的參照細胞。但是這樣的測定誤差較大，操作繁瑣，不利于臨床診斷。
其主要原因是(1)采用非人體的參照細胞定制的特殊載玻片，操作復雜，成本高，例如在USP4741043中報道了CAS-200采用鼠肝細胞為量值傳遞比對測量的基準。由于作為樣本的鼠肝細胞參照片，是一群離散性很大的單體細胞。其中有二倍體的正常細胞，也有大量異倍體的異常細胞。而儀器是以數學模式來挑選基準細胞的。它必然有一個挑選區間參數，并規定了定標的細胞數大于20個但最多不超過128個，這就是通過大量標準細胞取平均值來達到規范系統量化差異。因此這種基準建立的本身就存在誤差，更何況不能直接反映與人體正常細胞的量值關系，因此在實際應用時，制造企業必須對每套出廠儀器用人體正常細胞作計量，使用該設備的用戶也必須定期與生產廠取得標準計量，是非常繁瑣的，尤其當設備使用中出現故障，更將影響測試的準確性。(2)除了設備本身制造誤差外，還存在量值傳遞標準產生的誤差。由于每次使用儀器檢測均需要一片樣本參照細胞載玻片，每張載玻片的參照細胞不可能是簡單的重復，因此帶來了量值傳遞的誤差。(3)由于采用標準片上制作的已知光密度標記規定儀器背景視場灰度值為195級時，(以0-255級為整個灰度級)該標記灰度值是32級而造成的誤差。這是因為該方法只使投射在載玻片上的光強是恒定的，面透過載玻片的背景光強就會因細胞畫面的內容變化而不同。也就是說只有以載玻片中特殊標記為畫面內容時，其透過背景光的灰度值才是195級。而作為樣本的鼠肝細胞參照片，每幅畫面內容的離散性很大，往往一幅畫面只能挑選個別數量的細胞，因此必須取多幅畫面，大量的選取。由此可見誤差的大小直接跟被選取畫面圖象的內容有關，與操作者的水準、工作態度也相關。(4)由于儀器只能接受鼠肝細胞為基準，因此一旦測量發生爭議時，就無法在儀器上采用其它合理措施了，同時儀器的使用也受鼠肝細胞載玻片所束縛。(5)采用一定數量基準細胞積分光密度峰值與儀器內部預設存貯的光密度區間值產生修正染色差異的因子誤差。同樣是因為基準細胞光密度值的建立也是為被攝取的圖象內容有關，與人為的因素有關，甚至在同一張載玻片中會獲得差異因子，存貯光密度值區間范圍越大，濃度差識別越鈍化。
本發明的目的在于克服上述缺點，設計一種新的ICM分析系統，使該分析儀的成本降低、使用方便、分析層次提高、準確性強。
本發明提供了一種改進的生物標本圖象分析儀，其特點是提供了新的ICM分析系統(即DNA圖象定量分析系統)。該系統取消了參照細胞的特殊載玻片，采用儀器本身儲存的正常人體細胞DNA值為基準的原始起點值傳遞基準，同時改進了原有儀器采用標準片上制作的已知光密度標記灰度，而采用人體正常細胞基準染色灰度或其它輔助組織如雞血細胞、人體正常淋巴細胞、淋巴切片細胞的基準染色灰度完成儀器背景灰度的定標，從面減少了量值傳遞標準產生的誤差，提高了修正濃度差異的準確性。
本發明提供一種改進的生物標本圖象分析儀，該分析儀具有新的ICM分析技術系統，該系統主要由下列部份組成(1)建立人體正常血液組織細胞數據庫a.取人體正常的血液組織細胞，采用DNA染色劑堿性品紅染色，b.儀器從制成的涂片中選取單核細胞，c.選擇至少5只以上的人體正常血液中的單核細胞圖象，并儲存在計算機中，d.在挑選單核細胞的過程中，設定其質量為7.18pg來建立標準細胞群的平均測量基準，并儲存在計算機中，e.用挑選的單核細胞的灰度峰值作為修正染色濃度差異時的基準，編入計算病理細胞質量的程序中，f.系統存儲有至少二種以上染色劑的信息內容，例如堿性品紅或Feulgem Azure A及與其相配的濾玻片入為560nm或630nm(波長)，(2)建立輔助細胞組織數據庫a.輔助細胞制片與選擇的人體正常單核細胞制片同批染色，經處理后分別存儲在計算機中，以供在測量病理片時作比對參考，b.以人體單核細胞為基準，檢測輔助細胞的各項定量參數和質量的直方圖，將此信息同時儲存在輔助細胞組織數據庫，c.將各輔助細胞的質量峰值作為設定值，建立各種輔助細胞的基準檔案存儲在輔助細胞組織的數據庫；(3)儀器背景灰度定標a.檢查系統背景視場灰度值及穩定性采用灰度測試軟件，其測量靈敏度小于1級，取樣時間不大于1秒，并把顯示屏的顯象平面最少劃為512×512個象素點，一次取樣象素面積不小于15×15象素點，系統在正常工作狀態下，檢查幾乎整個顯象平面內反映的視場背景灰度值及穩定性，b.檢查系統線性特征系統在正常工作狀態下，采用多階梯灰度標準片，由灰度測試軟件來檢查顯微鏡光源強度的線性變化，反映在系統高分辨率顯視屏上灰度值的線性變化，c.背景視場灰度的定標以人體正常細胞標準片(本發明是采用經DNA染色的血液涂片中的單核細胞設定重量為7.18pg)來調整顯微鏡光源強度，即顯微鏡的電源電壓大小和攝象頭手控增益電位器的位置，用灰度值測試軟件來調試高分辨率圖象顯視器上的背景視場灰度值，上述灰度值必須低于255級飽和值，一般低30級以上，產品按各自配置的實際情況在調試上是一個定值。這一條與顯微鏡正常工作狀態的調整，(即照明方式不局限于庫勒照明)，作為設定菜單程序中決定背景視場灰度值定標一一對應的基本步驟。也是每次測試狀態的定標基準，對于數據庫中量值傳遞途徑的生物組織，也以此定標方法類推；d.采用輔助細胞制成的標準樣本細胞，(以DNA染色)來檢查修正系統的各項測試指標的誤差。
上述改進的ICM分析系統中所述的輔助細胞可以為雞血細胞、鼠肝細胞、人體正常淋巴細胞或各種分類癌變細胞。
本發明改進的生物標本圖象測試儀比CAS-200的測試效果有顯著的提高，誤差并明顯減少，通過下列比較試驗可以證明
1.測試樣品名稱非哺乳動物的雞血細胞2.測試項目①DNA峰值質量及其誤差②DNA平均值及其偏移值3.測試方法將樣品分別在本發明改進的生物標本圖象測試儀及CAS-200上各測試10次，每次測100只細胞。
4.測試結果①DNA峰值質量及誤差本發明改進的生物標本圖象測試儀，誤差全部＜5％，CAS-200其中誤差＞5％的占60％，最大誤差達15％。
②DNA平均值及其編移值本發明改進的生物標本圖象測試儀的偏移值最大為1.66％，CAS-200的偏移值最小為2.27％。
本發明改進的生物標本圖象分析儀，不僅提高了修正濃度差異的準確性，而且背景視場灰度的定標與被測病理制片所攝取的畫面背景灰度更吻合，更接近實際測試狀態。因其操作方便、成本低、準確性高，能直接應用于臨床，有利于ICM技術設備的推廣普及。據估計每年我國癌癥患者約達400萬人，該儀器將為檢測癌癥創造條件，有益于人類醫學事業的發展。
實例1、1.取人體正常的血液組織細胞制片染色。a)染色劑采用DNA染色劑。b)儀器從制成的涂片中選取單核細胞。c)采取圖象處理技術選擇25只人體正常血液中的單核細胞圖象，并儲存在計算機中。d)在挑選單核細胞的過程中，設定其質量為7.18pg來建立標準細胞群的平均測量基準，并儲存在計算機中。e)用這些單核細胞的灰度峰值作為修正染色濃度差異時的基準，編入計算病理細胞質量的程序中去。
2.建立雞血細胞組織數據庫。a)制備雞血細胞制片。b)把雞血細胞制片與上一條中的人體正常單核細胞制片同批染色，經處理后分別存儲在計算機中，以供在測量病理片時作比對參考。c)以人體單核細胞為基準，檢測出這些雞血細胞的各項定量參數和質量的直方圖，把這些信息同樣存儲在細胞組織數據庫。
3.儀器背景灰度定標。a.檢查系統背景視場灰度值及穩定性采用灰度測試軟件，其測量靈敏度小于1級，取樣時間不大于1秒，并把顯示屏的顯象平面最少劃為512×512個象素點，一次取樣象素面積不小于15×15象素點，系統在正常工作狀態下，檢查幾乎整個顯象平面內反映的視場背景灰度值及穩定性，b.檢查系統線性特征系統在正常工作狀態下，采用多階梯灰度標準片，由灰度測試軟件來檢查顯微鏡光源強度的線性變化，反映在系統高分辨率顯視屏上灰度值的線性變化，c.背景視場灰度的定標以人體正常細胞標準片(本發明是采用經DNA染色的血液涂片中的單核細胞設定重量為7.18pg)來調整顯微鏡光源強度，即顯微鏡的電源電壓大小和攝象頭手控增益電位器的位置，用灰度值測試軟件來調試高分辨率圖象顯視器上的背景視場灰度值。上述灰度值必須低于255級飽和值。一般低30級以上。產品按各自配置的實際情況在調試上是一個定值。這一條與顯微鏡正常工作狀態的調整，(即照明方式不局限于庫勒照明)，作為設定菜單程序中決定背景視場灰度值定標一一對應的基本步驟。也是每次測試狀態的定標基準。對于數據庫中量值傳遞途徑的生物組織，也以此定標方法類推，d.采用輔助細胞制成的標準樣本細胞，(以DNA染色)來檢查修正系統的各項測試指標的誤差。
實例2、按實例1同樣方法操作，但不同的是選用鼠肝細胞建立鼠肝細胞組織數據庫。
實例3、按實例1同樣方法操作，但不同的是選用人體正常淋巴細胞建立人體正常淋巴細胞組織數據庫。
實例4、按實例1同樣方法操作，但不同的是選用肝癌細胞建立肝癌細胞組織數據庫。
權利要求
1.一種改進的生物標本圖象分析儀，其特征在于該分析儀具有一種ICM(Image cytometry)分析技術系統，該系統主要由下列部份組成(1)建立人體正常血液組織細胞數據庫a.取人體正常的血液組織細胞，采用DNA染色劑堿性品紅染色，b.儀器從制成的涂片中選取單核細胞，c.選擇至少5只以上的人體正常血液中的單核細胞圖象，并儲存在計算機中，d.在挑選單核細胞的過程中，設定其質量為7.18pg來建立標準細胞群的平均測量基準，并儲存在計算機中，e.用挑選的單核細胞的灰度峰值作為修正染色濃度差異時的基準，編入計算病理細胞質量的程序中，f.系統存儲有至少二種以上染色劑的信息內容，例如堿性品紅或Feulgem Azure A及與其相配的濾玻片入為560nm或630nm(波長)，(2)建立輔助細胞組織數據庫a.輔助細胞制片與選擇的人體正常單核細胞制片同批染色，經處理后分別存儲在計算機中，以供在測量病理片時作比對參考，b.以人體單核細胞為基準，檢測輔助細胞的各項定量參數和質量的直方圖，將此信息同時儲存在輔助細胞組織數據庫，c.將各輔助細胞的質量峰值作為設定值，建立各種輔助細胞的基準檔案存儲在輔助細胞組織的數據庫；(3)儀器背景灰度定標a.檢查系統背景視場灰度值及穩定性采用灰度測試軟件，其測量靈敏度小于1級，取樣時間不大于1秒，并把顯示屏的顯象平面最少劃為512×512個象素點，一次取樣象素面積不小于15×15象素點，系統在正常工作狀態下，檢查幾乎整個顯象平面內反映的視場背景灰度值及穩定性；b.檢查系統線性特征系統在正常工作狀態下，采用多階梯灰度標準片，由灰度測試軟件來檢查顯微鏡光源強度的線性變化，反映在系統高分辨率顯視屏上灰度值的線性變化；c.背景視場灰度的定標以人體正常細胞標準片(本發明是采用經DNA染色的血液涂片中的單核細胞設定重量為7.18pg)來調整顯微鏡光源強度，即顯微鏡的電源電壓大小和攝象頭手控增益電位器的位置，用灰度值測試軟件來調試高分辨率圖象顯視器上的背景視場灰度值，上述灰度值必須低于255級飽和值，一般低30級以上，產品按各自配置的實際情況在調試上是一個定值。這一條與顯微鏡正常工作狀態的調整，(即照明方式不局限于庫勒照明)，作為設定菜單程序中決定背景視場灰度值定標一一對應的基本步驟。也是每次測試狀態的定標基準，對于數據庫中量值傳遞途徑的生物組織，也以此定標方法類推；d.采用輔助細胞制成的標準樣本細胞，(以DNA染色)來檢查修正系統的各項測試指標的誤差。
2.根據權利要求1所述的一種改進的生物標本圖象分析儀，其特征在于其中所述的輔助細胞組織可以為雞血細胞、鼠肝細胞、人體正常淋巴細胞或各種分類癌變細胞。
全文摘要
本發明涉及一種改進的生物標本圖象分析儀。該儀器的特征是提供了新的ICM(Image cytometry)分析系統，采用儀器本身設有正常人體細胞DNA值的標準及量值傳遞途徑，并建立各種生物組織的數據庫。操作簡便、成本低、準確性高，宜于臨床使用。
文檔編號G01N33/53GK1164648SQ9611635
公開日1997年11月12日 申請日期1996年5月7日 優先權日1996年5月7日
發明者顧康庭, 劉志敏, 鄭建英, 郭鈞鋒, 李玉梅, 陳麗華, 肖翔麟 申請人:德中貿易(上海)有限公司