專利名稱：放射流動檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測試劑、方法和設備。進而言之，本發明涉及在各種檢測中提供對被檢測物的快速和靈敏的放射流量檢測設備和方法。與本發明相關的背景技術免疫檢測可以用于檢測流體樣品中所存在的不需要的物質，例如，體液中的細菌和水中的污染物等等。它們還可以用于檢測體液中存在的抗體，作為確定感染物、癌細胞和自體免疫疾病的指標。
用于免疫檢測的用品已經有眾多種類，其中的一些應用了流體通過多孔介質的毛細流動原理。采用這種毛細流動現象的檢測有時已被不準確地稱作“色譜檢測”，而且有些則僅為一步檢測程序。例如，1990年9月11日授予Gorden等人的美國專利第4,956,302號所揭示的檢測用品包括一種色譜介質，并且該介質上的反應位點固定有特異性結合試劑，在靠近該結合位點的上游方有樣品添加井，在該反應位點的下游方有液體吸收點域。樣品被加入添加井內，再通過色譜介質，通過反應位點而到達點域，然后將反應位點與標記的特異性結合物質相接觸，洗去未結合的物質，再檢測標記物。
英國專利申請第8809867號，在1988年11月9日以公開號第2204398A號被公開，揭示了硝化纖維素介質，包括樣品添加區，在其下游方的對第一種被分析物為特異性的并已被標記的非固定化結合試劑，更下游方的對第二種被分析物為特異性的未被標記的固定化結合試劑。流體中的被分析物被流體運載去與標記的試劑接觸，流體還將被分析物與標記的試劑一起運載去與固定化的未被標記的試劑相接觸。檢測結束時，如在固定化區觀察到標記物。就指示在樣品中存在著被分析物。
在以上所述的各種用品中，色譜介質起到的作用是過濾樣品中不需要的顆粒物，使流體的流過速度減慢以便特異性結合的發生，并運載非固定化的試劑到其它固定化試劑的位點。但是，這種緩慢的流動也促進非特異性的結合，而且要等待以分鐘計的時間才能得到結果。
多孔介質，例如硝化纖維素已經被用來對大量的血清和血漿進行過濾。但是，要想完成這種過濾，就必須在硝化纖維素兩邊造成顯著的壓力差。
多孔介質已經被用來制備檢測設備中的所謂“預過濾器”，并且這種預過濾器將樣品從局部添加區擴散到更大的檢測表面區域。1990年3月27日授與Kalra等人的美國專利第4,912,034號描述了這種預過濾器。這些預過濾器一般由玻璃纖維構成，能迅速濕潤檢測表面，但過濾效果關差，如果選用能提供適度過濾的孔徑的預過濾器，則其就會顯著地降低濕潤過程的速度。也就是說，使用先胡技術的預過濾器，就使良好的過濾與對檢測表面的迅速濕潤的互相排斥的。此外，玻璃纖維很大的空腔體積(滯留)，所以，可以吸收大量的樣品。因此，如果只有少量的樣品，就要對其給以足夠的稀釋才能檢測表面得到適當的濕潤。所以，為了提高靈敏性，通常都使用酶標記物。
雖然很多的這類檢測都對以往的確定樣品中存在著的物質的方法有著明顯的改進，但是，建立快速和靈敏的免疫檢測仍然是所追求的目標。現在使用的幾乎所有免疫檢測中共存的缺陷是速度慢(5～30分鐘)，或速度較快而靈敏度不足(或兩種缺點同時存在)。當對疾病進行檢測時，靈敏度的降低是無法接受的，而且現有的那些最靈敏的檢測也顯得麻煩和緩慢。本發明的有益效果本發明的目的是提供可用于眾多檢測的產品和方法，用提高的靈敏度對很少量樣品中的被分析物進行測定，本發明還能對樣品中的被分析物進行快速檢測，省去先有技術的檢測中的許多步驟，例如清洗步驟。本發明的目的本發明的上述目的可以通過將樣品快速地分布在膜上，然后將該膜與檢測表面均勻接觸而實現。
根據本發明的一個方面，提供了將樣品傳遞到檢測表面的傳遞部分。該傳遞部分包括具有樣品接收表面的預過濾器。該預過濾器還包括將樣品傳遞到檢測表面的樣品傳遞表面。在預過濾器的樣品接收表面上有擴散材料，用于在樣品被加到傳遞部分時，將樣品迅速地水平分散開來。根據本發明的優選實施方案，傳遞部分為基本上圓形的，并將樣品加到接收表面的中心。然后樣品就迅速地從其加入位置被擴散開來。
擴散材料可以是例如膜或表面活性劑。因此，傳遞部分可以由一對膜組成并處于面對面的位置，其中一個膜起擴散材料作用，另一個起預過濾器作用。該擴散膜的孔徑和厚度為能將流體樣品迅速水平擴散到預過濾器接收表面。該預過濾器基本上是平面膜，其孔徑和厚度要能在對樣品中以大于預定尺寸的顆粒物過濾的同時也能將樣品從接收表面轉移到傳遞表面。在一具體方案中，擴散材料是孔徑為約5～25微米的膜，傳遞材料是孔徑為約0.1～約1.0微米且厚度為約50～約300微米的膜。
如果擴散材料是表面活性劑，則傳遞部分的結構就可以按以下所述的本發明的各種實施方案來進行。但是，不論如何，傳遞部分的構造都優選能將樣品迅速地水平擴散到預過濾器的接收表面，并隨后將樣品均勻地傳遞到檢測表面。
根據本發明的另一方面，提供了將樣品傳遞到檢測表面的傳遞部分的制造方法。另外，還提供了基本上為平面的多孔的并且具有樣品接收表面的預過濾器。在樣品接收表面上加一層擴散材料，該擴散材料可以是圓周形的，并且具有能將所加在其接收表面上的樣品迅速水平擴散開的多孔結構擴散膜。此時，該擴散膜是與預過濾器處于面對面的關系，優選用與預過濾器和擴散膜的外周相近似的連接器將它們裝配在一起。
根據本發明的另一方面，提供了一種將樣品傳遞到檢測表面的方法。預過濾器的傳遞表面被與檢測表面吻合接觸。然后將流體樣品加到預過濾器接收表面上的擴散材料上，由此使流體樣品迅速平面流到接收表面，這樣流體樣品就在與平面流動為垂直的方向上滲透到預過濾器中。換句話說，樣品首先是按照與接收表面和檢測表面所限定的平面為平行的方向上流動，然后按與該方向為垂直的方向而流過預過濾器而到達檢測表面。
根據本發明的另一方面，提供了確定被檢測物的檢測試劑盒。該檢測試劑盒是這樣一種包裝，其中含有檢測固相，該檢測固相具有固定化的被檢測物的結合配體的檢測表面。該包裝還含有包括樣品接收表面和樣品傳遞表面的預過濾器，其中樣品傳遞表面與檢測表面處于面對面的關系，并且是可以移去的，在其樣品接收表面上有擴散材料。該包裝還包括將預過濾器的傳遞表面和檢測表面吻合接觸的壓緊部分。該壓緊部分可以是一種吸收材料，并與檢測固相相接觸。最優選的預過濾器是平面的纖維素膜，擴散材料是基本上為平面的纖維素膜，檢測表面是平面膜的表面，該檢測表面具有比被分析物尺寸更大的孔徑，傳遞部分具有比檢測表面小的孔徑。該包裝還可以進一步包括本文所述的檢測試劑，其又包括被標記的檢測試劑。傳遞部分的詳細構造可以是如上所述的。該檢測試劑藥盒還可以包括有將預先確定的數量的樣品加到傳遞表面的指示。
根據本發明的另一方面，提供了一種確定被檢測物的檢測試劑藥盒。該試劑藥盒包括這樣一種包裝，其中含有用于支持檢測反應的檢測表面，以及多孔纖維素預過濾器，該預過濾器的孔徑為0.1～約1.0微米，并且有與檢測表面處于面對面的傳遞表面。
根據本發明的另一方面，提供了檢測被分析物的檢測藥盒的制備方法。該方法包括在檢測表面上使被分析物的結合配體固定化；在基本上為平面的預過濾器的樣品接收表面上添加擴散材料而構制成傳遞部分；并且為了使傳遞表面與檢測表面處于吻合接觸而放置壓緊部分。然后將檢測表面、傳遞部分和壓緊部分包裝在一起而形成該檢測藥盒。在將這些材料裝入該包裝之前，可以使壓緊部分與多孔傳遞部分或檢測固相之一相吻合接觸，該方法還可以包括制備含有被標記的被檢測物結合配體的檢測試制。
根據本發明的另一方面，還提供了測定被分析物的檢測方法。被懷疑含有被分析物的流體樣品加到多孔性傳遞部分的接收表面上，該傳遞部分還具有與檢測表面吻合接觸的傳遞表面。該流體樣品首先迅速地平面流動，然后該流體樣品就滲透到傳遞部分并被均勻地轉移到檢測表面。
根據本發明的另一方面，提供了測定被分析物的測試方法。被懷疑含有被分析物的流體樣品加到多孔性傳遞部分的接收表面上，該傳遞部分還具有與檢測表面吻合接觸的傳遞表面，該檢測表面上載有被固定化的被檢測物的結合配體。該流體樣品迅速地在與接收表面基本平行的方向上平面流動。這樣該流體樣品就滲透到傳遞部分并被均勻地轉移到檢測表面。然后將該傳遞部分從檢測表面上移去。檢測表面是與含有標記的被分析物的一種結合配體或被固定化的結合配體標記的結合配體的檢測試劑相吻合接觸。然后對標記物進行檢測。優選的是檢測表面具有的孔徑大于被分析物的尺寸，而且傳遞部分的孔徑大于檢測表面的孔徑。
根據本發明的另一方面，提供了一種確定被分析物的檢測方法，樣品是加到具有能夠發生非特異性結合的檢測表面上。該樣品包括僅能夠部分封閉結合區的有效量的封閉劑。然后將該結合區與包括有標記物的檢測試劑相接觸。隨后測定被標記的物質所產生的均勻分布的非特異性結合，在此處，均勻性是用來確定樣品加到檢測表面上的平均程度。優選的是在這些區域中沒有任何被固定化的生物制劑。
根據本發明的另一方面，提供了具有檢測表面的檢測固相。該檢測固相可以按此前所述的本發明的方法而使用。檢測表面包括具有化學功能性的區域，該區域可以使被標記的檢測試劑發生非特異性的結合，且該非特異性結合的程度能夠指示加到該區域上的樣品的程度。因此，當把樣品首先加到該區域并達到某一程度時，然后添加標記的試劑，則標記的試劑就表現出某一相應程度。當把樣品在該區域上以不同于第一程度的第二程度加入并隨后加入標記的檢測試劑時，那么標記的結合試劑在該區域發生的非特異性結合就是與第一程度相區別的第二程度。該檢測固相表面還可以包含固定有被分析物結合配體的第二區域。
根據本發明的另一方面，提供了將流體樣品加到檢測表面的方法。該方法包括將預過濾器的傳遞表面與檢測表面吻合接觸的步驟，在預過濾器的接收表面上形成流體樣品膜的步驟，并允許該流體樣品膜滲透過預過濾器并將檢測表面均勻濕潤的步驟。
根據本發明的另一方面，還提供了包括使用預過濾器的檢測試劑藥盒和裝置的改進型免疫檢測。其改進之一是使用孔徑為約0.1～1.0微米的預過濾器，其另一處改進是使用了一對面對面相處的膜的預過濾器。改進的另一處是具有樣品接收表面的預過濾器，而且其構造和安排使流體樣品可以迅速地在接收表面上平面擴散，并使樣品滲透過預過濾器而且均勻地傳遞到檢測表面上。改進的再一處是這樣一種預過濾器，其具有樣品接收表面以及將樣品傳遞到檢測表面的傳遞表面，并且在預過濾器的樣品接收表面上有擴散材料。本發明的這些和其它各方面都將在以下結合附圖給以詳細描述。附圖的簡要說明
圖1表示的是根據本發明一個實施方案的傳遞部分以及包括檢測表面的檢測固相；圖2a～2f表示的是根據本發明的一個實施方案的使用檢測試劑藥盒進行檢測的程序，以在一個樣品中確定IgG和IgA或IgM之一、或它們的組合；圖3a～3c表示的是根據本發明的一個實施方案在進行了圖2所示的檢測之后分別為錯誤、陰性和陽性結果的檢測表面的外表；圖4是根據本發明的一個實施方案的檢測試劑藥盒的俯視圖；圖5是圖4中沿5-5的剖面圖。本發明的技術方案很多成對的生物物質表現出相互間的親和力或相互間的結合力，一般被定義為特異性或非特異性的結合或相互作用。這種相互作用一般是在成對的分子間發生，其中的一個成員具有一個或多個暴露出來的可與另一個成員的一種或多種特定的暴露區相結合的特定區。所述的可以進行結合的暴露區域一般是受特定空間結構和/或極性限定的。在本說明書中，“結合配體(binding partners)”定義的是表現出這種相互親和力的一對成員。例如這種結合配體包括抗體/抗原、抗體/半抗原、酶/底物、酶/抑制劑、酶/輔助因子、生物素/抗生物素蛋白、結合蛋白/底物、載體蛋白/底物、外源凝集素/碳氫化合物、受體/荷爾蒙、受體/效應物、核酸的互補鏈、阻遏物/誘導物等等。
在很多檢測中，都需要一對具有相互親和力的生物物質中的一員來捕捉和確定被分析物。已經有很多免疫檢測是按照捕獲這種被分析物而設計和發展出來的，例如捕捉在動物中相應于抗原而產生的抗體。根據這種免疫檢測的一例，抗原是被固定在檢測表面上，將血清樣品與該檢測表面相接觸，則該表面就捕捉到對該固定化的抗原為特異性的抗體，然后包括有標記的被分析物抗體的結合配體的檢測制劑就與檢測表面相接觸，這樣，在該表面上固定下來的標記物就只存在著被分析物。
本發明的檢測是快速靈敏的，并且可以用于很少量的樣品。其中所提供的傳遞部分可以起到過濾作用，并且能迅速均勻地將檢測樣品傳遞到檢測表面。此外，在檢測中還使用了檢測固相。該檢測固相將檢測表面選擇性地暴露出來，從而能夠有效地測定樣品在檢測表面上的分布情況。
在本文中術語“樣品”定義的是被懷疑含有需要經過檢測而確定的被分析物的溶液或流體混合物。當在生物檢測中使用本發明的各種成分時，則樣品一般都是按照水性溶液或水性懸浮液而使用。根據本發明的另一實施方案，在檢測試劑盒中可以同時包括傳遞部分和檢測表面，這兩部分可參見圖1。
在圖1中，根據本發明的多孔傳遞部分表示為20，包括預過濾器18，在該預過濾器上有樣品接收表面24和樣品傳遞表面22。在預過濾器28的接收表面24上有擴散材料26。檢測固相11包括檢測表10，而且預過濾器28的傳遞表面22是與檢測表面10相吻合的。根據本發明預過濾器28和檢測固相11基本上都是平面型的，但是也不一定必須如此。最重要的是傳遞部分20的結構要能使樣品均勻地濕潤檢測表面10，因此只要傳遞表面22和檢測表面10是相吻合的形狀和/或傳遞表面22以及檢測表面10相互吻合就可以了。
預過濾器28以及檢測固相11(可任選的)是由多孔材料構成的，該材料應該是對樣品成分、檢測制劑和其它的與在檢測中與其發生接觸的成分為惰性的，或者是可以將其轉化為惰性的材料。在本文中術語“惰性”定義的是這樣一種化學或生物學狀態，即該材料并不與檢測樣品中的任何成分相互作用而使全體一對結合配體間在檢測中發生相互作用或防礙進行所需的檢測反應。當檢測成分與預過濾器28或檢測固相11的材料發生非特異性結合時，則本發明的特征之一就是這種非特異性的結合相對特異性結合來講是很小的，在此，特異性結合指的是在流體樣品中對被分析物按照本發明所述的檢測方法來確定。正如以下更為詳細的討論所述，在根據本發明的一個方面中標記的試劑與檢測固相發生某一程度的非特異性結合是有利的。
此外，用于構成預過濾器28以及檢測固相11的材料應該在與檢測流體介質接觸時表現出毛細現象，并且具有用流體運送非固定化的試劑和樣品成分的能力。術語“毛細現象(capillarity)”定義的是多孔材料同檢測樣品流體介質之間的關系，其中樣品的流體介質與多孔材料的接觸角度是準確的；或者是指這樣一種關系，即樣品流體通過多孔材料并不與重力對流體樣品的作用相關。
適合于預過濾器28以及檢測固相11(可任選的)的材料舉例有用于色譜的紡織型或無紡型纖維材料、用于微孔或微顆粒薄層色譜的基質、多孔聚合材料包括聚鏈烯例如聚乙烯和聚丙烯；聚氯乙烯；聚酰胺如尼龍；聚芳基化合物例如聚苯乙烯；聚芳基砜；聚鹵乙烯和聚偏鹵乙烯；聚乙烯醇和聚偏乙烯醇；聚碳酸酯；多糖類包括纖維素例如乙酸丁酸纖維和硝化纖維素；聚酯例如聚對苯二甲酸乙二醇酯；聚酰亞胺和聚氨基甲酸乙酯例如聚醚聚氨基甲酸乙酯或它們的結合，此外，也可以對它們進行預處理(例如對固相11)，從而提供在1988年7月12日授權的美國專利第4,757,014號中所述的結合能力，該專利通過在此引述合關于本文；纖維素水合物例如在1986年8月5日授權的美國專利第4,604,208號中所述的發生電荷改變的微孔膜，該專利通過在此引述結合于本文；氟化的聚合物例如聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯；多孔的芳香聚合物包括多芳基化合物例如聚甲基丙基酸甲酯；多孔的稱作生物馬賽克的聚合物，即含有至少一種可聚合單體的乳化液在有生物活性材料存在的條件下而聚合形成的聚合物，例如在歐洲專利申請第90312532.6號、以公開號0430517A2號在1991年6月5日公開的文本中所述，該文通過在此引述合并于本文；硅石；礬土；硅藻土；硫酸鎂或其它的無機的細微物質并可以被均勻地分布在多孔聚合材料上；天然或合成性布料；瓊脂糖；糊精；凝膠等等。適用于預過濾器28的材料還可見1982年12月28日授權給Tom等人的美國專利第4,366,241號，該專利通過引述合并于本文。適用于預過濾器28和檢測固相11(可任選的)的多種微孔膜可以從Amicon、Geleman、Millipore、Schleicher and Schuell和Pall Corporation獲得。
根據本發明的一個實施方案在預過濾器28的接收表面24的擴散材料26是表面活性劑。在本文中術語“表面活性劑”指的是那些可以被連接到或涂布在接收表面24上并且能夠造成加在接收表面24上的流體樣品的表面張力或界面張力的降低的物質。因此，該術語就包括潤濕劑和乳化劑以及洗滌劑。表面活性劑可以被選擇性地與接收表面24化學結合或以吸收的方式涂布到表面24上。要想將表面活性劑穩固地化學連接到接收表面24上，還可以另外采用已知的化學或物理方式，或對預過濾器進行適當時間的加熱。雖然選擇那些能夠與接收表面24穩固地結合并使其在樣品通過預過濾器28時被洗掉的表面活性劑是有意的，但也不一定必須如此。如果選用一次性或可丟棄的預過濾器，則在加入樣品時對表面活性劑的去除程度就不是非常關鍵的，只要表面活性劑能夠迅速地將樣品在接收表面24上平面擴散開來并且對檢測中的反應活性和測定不產生影響就可以了。表面活性劑可以滲透過預過濾器28而超過其接收表面24，但是優選的是表面活性劑基本上都停留在接收表面24。
有眾多的表面活性劑可以被選擇為本發明傳遞部分20的擴散材料26。可選擇的但并不僅局限于此的實例有烷基硫酸酯和烷基季酯類，包括不均勻的聚氧乙烯類、葡糖胺、毛地黃皂苷、膽酸、硫代內銨鹽、內銨鹽、烷基二甲基胺氧化物、烷基葡糖苷、烷基麥牙糖苷、卵磷脂、溶血卵磷脂、均勻的聚氧乙烯和烷基硫代葡糖苷。具體而言，有聚乙二醇十二烷基醚，辛酰-N-甲基葡糖胺，壬酰-N-甲基葡糖胺，癸酰-N-甲基葡糖胺，壬基葡糖苷，壬乙二醇辛基苯醚，辛基葡糖苷，辛基硫代葡糖苷，聚乙烯聚丙烯二醇，牛磺膽酸一鈉，脫氧牛磺膽酸鈉，壬基乙二醇單十二烷基醚，壬基乙二醇辛基酚醚，壬基乙二醇辛基環己基醚，庚乙二醇辛基苯醚，庚乙二醇環己基醚，聚氧乙烯山梨糖醇單月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇一油酸，正辛基硫代內銨鹽，正癸基硫代內銨鹽，正十二烷基硫代內銨鹽，正十四(烷)基硫代內銨鹽，正十六(烷)基硫代內銨鹽，N，N，雙(3-D-葡糖胺丙基)乙醇胺，聚氧乙烯月桂基醚，辛基乙二醇單十二烷基醚，壬乙二醇單十二烷基醚，cetrimmonium bromide，3-[(3-乙醇胺丙基)二甲基胺]-1-丙烷磺酸酯，3-[(3-乙醇胺丙基)二甲基胺]-2-羧基丙烷-1-磺酸酯，膽酸(一鈉鹽)，癸基葡糖酐，癸基麥牙糖酐，N，N-雙(3-D-葡糖胺丙基)脫氧乙醇胺，脫氧膽酸(鈉鹽)，毛地黃皂苷，十二烷基麥牙糖酐，N-十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸，二辛基硫代琥珀酸鈉，月桂基二甲基氨氧化物，癸氧乙烯單月桂醚，辛乙二醇異三癸基醚，聚氧乙烯異三癸基醚，甘胺膽酸(鈉鹽)，甘胺脫氧膽酸(鈉鹽)，庚基葡糖酐，己基葡糖酐，庚基硫代葡糖酐，N，N-二甲基-N-十二烷基氨氧化物，十二烷基硫酸鈉，還可以選用其它的表面活性劑等同物。此外，還有眾多的適合的表面活性劑出售，例如商標為TRITON，TWEEN，ZWITTERGENT，MEGA，PLURONIC，GENAMINIOX，GENAPOL等可購置于Calbiochem Corporation，La Jolla California。
當以表面活性劑作為擴散材料26時，則最好使傳遞部分20的接收表面向上，也就是說基本與地面平行。這樣就可以使樣品被在各方向上以放射形式均勻擴散。此外還可將傳遞部分處于與地面不平行的狀態，并將樣品加到接收表面的非中心部分，這樣也可以使樣品在重力的作用下擴散于接收表面。
當本發明的傳遞部分20是由表面活性劑作為預過濾器28的接收表面24的擴散材料26時，則應理解的是擴散材料/預過濾器的組合方式可以選用多種方式之一。其中的一種方式是將擴散材料由僅僅涂布在預過濾器28的接收表面24上的表面活性劑來限定，而預過濾器28的其余部分并不涂布有表面活性劑。在另一方式中，第一表面活性劑或封閉劑可以涂布在預過濾器28的多孔網絡的全部或一部分上，而用第二表面活性劑涂布接收表面24并限定擴散材料26。根據這種安排，在接收表面24存在的第二表面活性劑就可以使加到預過濾器上的液體樣品的表面張力比該預過濾器的其余部分低。例如，可以使用比第一表面活性劑性質更好的潤濕劑來作為第二表面活性劑，或者使其用量大于第一表面活性劑。根據另一種安排，用一種表面活性劑涂布預過濾器28的任何一部分或全部，并用同樣的表面活性劑以過量的方式涂布在接收表面24上，這樣就可以使接收表面24上的流體樣品的表面張力遠遠低于該預過濾器28的其余部分。在另一種安排中，用一種表面活性劑涂布接收表面24，并且用同樣的表面活性劑或另外的表面活性劑來涂布預過濾器28的其余部分，但是在接收表面24所涂布的表面活性劑與預過濾器28其余部分所涂布的表面活性劑之間保留至少一段空間使其沒有表面活性劑。例如接收表面24可以涂布有第一種表面活性劑，傳遞表面22可以涂布有同樣或另外的表面活性劑，而在它們兩者之間的預過濾器28上的那一部分則不涂布任何表面活性劑。這樣當擴散材料26被表面活性劑限定時，就可以使一種或多種的表面活性劑被涂布在預過濾器28的一個或更多的部分。只要是傳遞部分20的構造和安排方式能使流體樣品的表面張力在接收表面24上遠遠地低于預過濾器28上的緊挨著該接收表面24的部分，并使樣品在到達檢測表面以前被迅速地平面擴散開來。
根據本發明的另一實施方案，預過濾器28的接收表面24上的擴散材料26是多孔的惰性材料并且具有對所加樣品產生毛細現象的能力，優選的是能通過毛細作用使流體樣品迅速地平面擴散于接收表面24上的多孔膜，根據本實施方案，擴散材料26就被認作是擴散膜26。擴散膜26可以是用以上所述的構造預過濾器28的材料中的一種或數種結合而構成。此外，還可以使用玻璃料或尼龍材料來構造。在一個傳遞部分20中，預過濾器28和擴散膜26可以用相同的或不相同的材料構成。
擴散膜26可以用很多的方法與預反應器28的接收表面并置起來，例如通過化學或物理的結合如通過粘接即優選在很小的獨立區將膜連接起來，或者通過縫紉以及微型鉚釘(microrivets)等方法將它們連接起來，優選的傳遞部分20包括連接器例如標簽或供懸掛用的小突出物(在圖1中沒有表示出來)，將預過濾器28的邊緣與擴散膜26的邊緣連接起來并使擴散膜與預過濾器的接收表面24處于面對面的位置。在本文中術語“面對面地位置”指的是很靠近的、相并列的一種位置關系，但是也并不一定完全吻合地接觸。在本文中術語“吻合接觸”指的是這樣一種關系，即某一部件的表面被施加在其上的恒定力壓迫到與另一部件的表面相接觸，例如一種彈性部分的情況那樣，因此兩個表面就可以在它們的全部操作區吻合地相接觸。當本發明的膜被處在面對面的位置時就可以用一種外力將它們吻合地相接觸，即不需要通過重力而將外力作用在膜中的一個或它們兩者之上而完成這一步驟。從以下可以清楚看出，擴散膜26和接收表面24可以在傳遞膜20將流體樣品轉移到檢測表面10上的過程中被吻合地接觸。
在使用擴散膜26將流體樣品迅速地平面擴散到預過濾器的接收表面24時，有諸多的因素需要被考慮以對擴散膜26和預過濾器28進行選擇。這些因素包括多孔性、毛細現象、空腔體積、厚度和可濕潤性。在本文中術語“多孔性”指的是對膜的多孔材料的特性的定義，包括孔徑、孔的方向、孔的封閉度和開放度等等。擴散膜26和作為預過濾器28的膜之間的組合的例子之一是擴散膜26的孔徑比預過濾器28的孔徑大。在這種安排中，并參見圖1，在擴散材料26的中央部位加入樣品就可以使流體樣品被迅速地平面滲透過膜26，造成這種迅速平面擴散的部分原因是相對較大的孔徑可以使樣品以相對較快的速度在膜26內流動，以及由于預過濾器28的相對較小的口徑而使樣品在其中的流動速度較慢而共同造成。當樣品接觸到預過濾器28的接收表面24時，它就被迫平面流過擴散膜26。在另一種安排中，擴散膜26具有與接收表面24基本平行方向的孔，即孔的方向性分布有利于在該膜內產生水平毛細流動。以這種方式，擴散膜26就造成樣品的迅速平面擴散。根據另一種安排，擴散膜26的毛細作用大于預過濾器28的毛細作用，其原因是在擴散膜26內流體樣品的表面張力被更大地降低了。
在任何情況下，當傳遞部分20由擴散膜26和預過濾器28構成時，則對膜26和預過濾器28的選擇就要使在將樣品加入到擴散膜26時能夠在預過濾器28的接收表面24上迅速形成流體樣品膜，并且要使這層液體膜可以滲透過預過濾器28而將檢測表面10均勻相等地潤濕。在本文中，術語“液體膜”指的是與接收表面24和檢測表面10基本平行的液體表面。這一點是要與先有技術中在其接收表面上沒有擴散材料時加入流體樣品所形成的液體表面以示區別。在先有技術的預過濾器中加入流體時，就會發生流體在預過濾器的各個方向上同等的放射滲透，這樣該流體就會在完全平面滲透到該預過濾器各個邊緣之前首先滲透過該預過濾器而到達其傳遞表面并與檢測表面相接觸，而且流體就會從中心部位開始逐漸地以放射形將檢測表面10潤濕。當把這種先有技術的預過濾器與本發明的檢測表面和檢測制劑共同使用時，就會在檢測表面10上造成不均勻的標記物分布。這一現象將在以下給予更詳細的描述。
對本發明的預過濾器28和擴散材料26的選擇，是要使傳遞部分20將檢測表面10的整個表面基本上均勻地同時濕潤，其原因是在接收表面28上形成了樣品液體膜，并且使該液體膜滲透過預過濾器而到達檢測表面。這就保證了使樣品中的被分析物是均勻地加到檢測表面上。
為了要使流體樣品迅速地平面流動在預過濾器28的檢測表面24上，特別是當擴散膜26和預過濾器28是由相同材料構成時，則對擴散膜26的孔徑以及其厚度就可以按此前所述的相對于預過濾器28的孔徑關系范圍內進行選擇。同樣地，為了在將樣品從接收表面24以與該表面相垂直的方向迅速地傳遞過預過濾器26并均勻地接觸檢測表面10，則預過濾器28就可以按此前所述的范圍對孔徑進行選擇。此外，傳遞部分20的構造要使很小量的未稀釋過的流體樣品可以被迅速地均勻地傳遞到檢測表面10。要達到這一目的可以采用的方法有例如選用孔徑尺寸為0.1～約1.0微米的預過濾器28，較優選的是孔徑為約0.2～約0.7微米，更優選的是孔徑為約0.33～約0.53微米，而且擴散膜26的孔徑為約5～約40微米，優選約8～約30微米，更優選的是約10～約20微米。根據對構成預過濾器28和擴散膜26的材料的一個具體的最優選擇，它們兩者都是由纖維素膜材料構成，優選硝化纖維素，預過濾器28的厚度為約50～約300微米，優選的是約110～約185微米，擴散材料26的厚度為約105～約165微米。
如果選擇的預過濾器的直徑與在此所述不相同，可能就需要在構造傳遞部分20時考慮對預過濾器28的接收表面24上的擴散材料26的數量進行相應的調整。例如，如果接收表面26包括表面活性劑，則在預過濾器28的直徑增大的時候就要增大加在接收表面24上的表面活性劑的數量。或者在構造傳遞部分20時，在預過濾器28的接收表面24上以不均勻的方式加入表面活性劑，在該表面的中央部分多加一些表面活性劑并由該中央部分向周圍放射形逐漸降低表面活性劑的用量。
當選用膜作為擴散材料26時，傳遞部分20的構造就可以選用這樣一種膜來作為擴散材料26，即其厚度是由中心向外放射形地逐漸降低。這樣，在預過濾器28的中心部厚度較大，而其邊緣部位厚度較小。或者在需要增大預過濾器28的直徑來覆蓋更大的檢測表面時，就需要增大擴散膜26的厚度。此外，擴散材料26可以包括這樣一種組合，即一種膜以及加到該膜的任何部位上的表面活性劑，或將該表面活性劑加到預過濾劑28的接收表面24上。也就是說傳遞部分20可以包括預過濾器28、加到該預過濾器的接收表面24上的表面活性劑，以及在使用了表面活性劑以后在接收表面24上施加擴散膜26。這樣做在構造直徑很大的傳遞部分時是很有利的。預過濾器28的厚度在很大的直徑變化范圍內都可以保持基本不變，如果選擇的擴散材料26是能夠使樣品被迅速均勻地傳遞到該直徑很大的預過濾器28的接收表面24上。然而，預過濾器28的厚度還可以進行調整以便于獲得較大的或較小的樣品表面張力、較大的或較小的過濾、或針對于其它不同的原因進行調整。
當傳遞部分20按照將樣品轉移到檢測表面10而確定其位置時，則傳遞部分20就應該是按照與檢測表10基本平行的位置而定位，而且傳遞表面22要與檢測表面10吻合相接觸。參見圖1(在該圖中，為了表達清楚起見，傳遞表面22并沒有按照與檢測表面10吻合相接而表達出來)，表示的是將樣品在靠近擴散材料26的中央部位添加時，樣品被迅速均勻地平面擴散或從中心放射擴散，其在擴散材料26上的方向以箭頭30表示，并且將樣品在預過濾器28的整個接收表面24上迅速均勻地分散開來。擴散材料26和預過濾器28的選擇是使平面擴散相對于樣品對預過濾器28的滲透而言是足夠快的，并能在接收表面24上形成樣品液體膜。預過濾器28在對樣品中的小顆粒進行過濾的同時，能夠將樣品迅速均勻地以液體膜的形式從接收表面24按照與接收表面24基本垂直的方向轉移到檢測表面10上。在此術語“膜”的定義是流體樣品的薄層而且其液面被保持在與檢測表面10基本平行的狀態，因而樣品在接觸表面10時就是以幾乎同時的形式進行的，并且在表面10的任何一個部分都施加了相同數量的樣品。
對傳遞部分20的材料的選擇可以同所選用的檢測介質的流體的情況結合起來考慮。當檢測流體介質是水時，纖維素特別是硝化纖維素就是優選的預過濾器28和擴散膜26的材料。當用傳遞部分20來轉移生物樣品，例如血清或血樣到達檢測表面時，傳遞部分20(包括預過濾器28以及傳遞膜26，在一個具體實施方案中)最好被封閉起來以防止樣品中的組分與它們之間發生結合。為達到這一目的的封閉劑是能夠對以溶劑轉移樣品成分或本發明的制劑造成不利影響的結合位點進行封閉的物質。對樣品中任一成分為惰性的封閉劑都可以被選用，也就是說，要避免使用那些與樣品中某一成分發生特異性相互作用的制劑。適宜的封閉劑可以包括有天然性的或合成性的、蛋白質的或非蛋白質的。這種適宜的封閉劑的非局限性名單包括酪蛋白、明膠、清蛋白例如牛血清蛋白、α球蛋白、脫鐵鐵蛋白、卵清蛋白、抗生物素蛋白、肽、聚氨基酸和合成性聚氨基化合物、全血清、非蛋白質聚氨基酸和合成性聚氨基化合物。此外，預過濾器28和傳遞膜26可以按以上所述用表面活性劑涂布來達到封閉。
加到傳遞部分20的接收表面24上的任何樣品應該結合該傳遞部分的尺寸及其滯留(空腔)體積來考慮，即要求樣品的體積不能超過傳遞部分20的對所需流動特性產生有害作用的數量。當以多孔材料作為固相11時，則選用的樣品量就不能超過使固相11和傳遞部分20的滯留體積被完全充滿的數量。優選的是樣品的量要能夠滲透過傳遞部分20，對固相11的檢測表面10進行濕潤，而且正好完成該免疫檢測。例如，如果所有被固定化的檢測試劑都基本上處于檢測表面10的表面上，而不是處于檢測固相內，則最好不要使樣品在檢測固相11中產生非常巨大程度的滲透。而另一方面，當被固定化的檢測制劑是處在固相11內時，即處在表面10的下面，則最好要使樣品能夠滲透到檢測固相11中并達到與固定化試劑相接觸的程度。此外，最好要使檢測流體對檢測表面10的濕潤程度能夠產生所需程度的后加被標記制劑的非特異性的結合。對此，在以下給予更詳細的描述。
此外，在選用樣品的體積時最好要使該體積能夠促進由毛細作用而非重力作用造成對傳遞部分20的滲透。優選的樣品體積是在擴散材料26的幫助下能夠迅速并均勻地在接收表面24上形成液體膜，并且隨后由毛細作用而使其迅速均勻地滲透到預過濾器28中，并均勻地幾乎同時地將檢測表面10的各部分潤濕。對這種流動特性產生有害影響的這種樣品數量會依據樣品中所含的顆粒物質的數量而不同。當采用血樣品時，其數量就要根據對血樣品的處理來決定。如果在將該樣品加到接收表面24之前先經過處理并去除了大部分的顆粒形物質時，就可以使用比較大的數量的樣品。一般而言，優選的樣品體積是傳遞部分20的滯留體積的1～3倍，優選約1～2倍，最優選約1.1～1.4倍。
傳遞部分20在免疫檢測程序中是非常有用的，但是并不僅限于這種免疫檢測，它還可以廣泛地應用于其它各種檢測中，只要該檢測中需要將流體樣品迅速均勻地傳遞到某一表面，其中對該樣品的過濾是可有可無的。一般來說，流體樣品中含有被檢測物，包括各種的物質，包括藥物、荷爾蒙、大分子物質、微生物(所有這些物質都可以在臨床或生理液體中發現，例如腦脊液、眼液、全血、血清、血漿、唾液、眼淚、尿液)、合成性化合物、水中或空氣中的污染物、微量化合物、食品中的毒素和微生物、以及它們的稀釋品。流體載體可以是水性或有機性的，用于構造傳遞部分20的材料可以在很大程度上根據流體載體來選擇。可以對樣品中的各種被檢測物的存在及其數量進行確定，例如，在以上所引述的1982年12月28日授予TOM等人的美國專利第4,366,241號中所述。
檢測固相11，特別是表面10的選擇是要使其能夠將檢測試劑方便地固定在其上面。表面10可以包括一個或多個將一種或多種檢測試劑固定在該處的特定區域。一般而言，被固定的檢測試劑都選擇為一對結合配體中的一員。
對一對結合配體中的一員在檢測表面10上的固定化是通過共價鍵或吸收性連接而實現的。根據本發明的一個實施方案，檢測表面10包括被暴露出來的功能性基團，例如但不僅限于羧基、磺酸基、氨基、硫基、羥基、吡啶基、磷酰基及它們的衍生物，或者是本技術領域的技術人員所熟知的那些能夠促進固定化的功能性基團。這些功能基團可以按活化的形式存在，通過加入取代物而對其進行活化，這些取代物包括有例如鹵素、苯基、羧基或磺酰基等等。檢測固相11的構成可以包括在其上或其中固定有被檢測物的結合配體，這種方法可見于1978年7月4日授權的美國專利第4,098,645號，該專利通過在此引述而合并于本文。此外，將蛋白質用等離子固定化方法固定到合成性基質上的方法可見于1991年7月2日授權的美國專利第5,028,657號，該專利通過在此引述而合并于本文，而且這種固定化是在本發明的范圍之內。DNA、RNA和某些抗原都可以通過對溶劑轉移的烘焙而加到檢測表面10上。一般而言，當檢測表面10包括硝化纖維素或為硝化纖維素酯的混合物，則將檢測試劑被固定化時就不需要特殊的化學連接。也就是說，這種固定化可以是吸附性的。本發明的最佳實施例如圖1所述，表面10包括有固定著第一檢測試劑14的第一區域12(在圖中為蛋白質A)以及固定著第二檢測試劑18的第二區域16(在圖中為HIV)。在檢測表面10上可以有任何數目的載著固定的檢測試劑的區域，而且這些試劑可以作為被分析物的結合配體、對照的結合配體或它們兩者的結合。對檢測固相11的檢測表面10可按照本發明進行封閉，但不一定如此。
應該注意的是在本發明的一個實施方案中，檢測固相11是多孔的，而且可以用以上所述的適于構造預過濾器28的材料來構成。根據該實施方案，特別是當檢測固相11和預過濾器18由同種材料構成時，固相11的孔徑可以同預過濾器28的孔徑一樣大或更大。另外，固相11的孔徑可以依照使樣品和檢測試劑迅速流過的標準來選擇，從而使在檢測表面10上發生的非特異性結合最小化。具體而言，固相11的孔徑可以是1～100微米，優選的是約5～40微米，更優選的是約8～約30微米，最優選的是約10～約20微米。
傳遞部分20和檢測固相11的尺寸和形狀可以在很寬的范圍內變化，例如傳遞部分20和檢測固相11并不一定要為相同尺寸和型號。只有固相11的一部分暴露出來的表面可以限定檢測表面10，或者由整個暴露出來的表面來限定檢測表面。此外，傳遞部分20的傳遞表面22可以由一部分的或全部的傳遞部分20的暴露出的表面來限定。重要的一點是限定傳遞表面22的任何傳遞部分20的部分要與限定檢測表面10時的整個暴露出來的固相11的表面相吻合接觸。
根據所述的實施方案，傳遞部分20和檢測固相11都基本上是圓形的，各自的直徑約為1.5厘米。檢測固相11的厚度在本發明中并不是非常關鍵的，但是如果選用了多孔的固相11，則就要按照滯留體積等于或大于所加樣品體積與傳遞部分20的滯留體積之差來選擇。按照這種方法，固相11就有助于將流體樣品從接收表面24迅速并均勻地轉移到檢測表面10。
參見圖2a～2f，給出的是檢測的實例，使用的是本發明的檢測試劑藥盒。在所有圖中，在數個圖內為相同的各部分都以同一數字表示。該藥盒包括(圖2a)傳遞部分20，并且使用了本申請的共懸未決美國專利申請“使用蛋白質和抗體的檢測”中所充分描述的檢測試劑。圖中所示的是根據本發明的靈敏度很高的HIV檢測分析。在圖2中，該檢測包括將蛋白質A作為第一固定化檢測試劑14并用HIV作為第二檢測試劑18，并分別位于檢測表面10上的第一區域12和第二區域16。
在圖2中，傳遞部分20是圖示性的，擴散材料26沒有在圖中表示出來。因而，預過濾器28(未標出)的接收表面24是代表著傳遞部分20的接收表面這一整體。傳遞部分20放置在檢測固相11上并使傳遞表面22與檢測表面10相吻合接觸。樣品加入到傳遞部分20的接收表面24(圖2b和2e)，優選將樣品加入到表面24的中間部位，并在此使樣品通過擴散材料26(在圖中沒有具體給出)被迅速地以放射形狀擴散并形成液體膜，并進而將該液體膜均勻地轉移到檢測表面時，以便幾乎同時地接觸表面時的所有部分。傳遞部分20包括預過濾器(在圖中沒有給出)，該預過濾器將比其最小孔徑還大的顆粒物質32過濾出來。
當把樣品通過傳遞部分20傳遞到檢測表面11后，第一或第二固定化試劑14和18的任何結合配體就與其結合。如圖2b所示，含有HIV特異性的全部IgG，IgA和IgM的樣品就被第二固定檢測試劑區16上所固定HIV捕獲。并且IgG也被第一固定檢測試劑區12上所固定的蛋白質A所捕獲，由于IgG在所有的血清樣品中都是大量存在的，因而可以將這一現象作為對照。如果沒有疾病存在，也就是說，如果在樣品中沒有HIV的抗體，則樣品中的物質就不會在區域16與固定化的HIV相結合(圖2e)不可避免的是，樣品中的一些成分會停留在檢測表面10上，但又不與任何固定化的檢測試劑相結合，以數字34表示。
此后，將傳遞部分20移去，并將過量的檢測試劑加到檢測表面10上(圖2e、2f)。根據這一檢測，檢測試劑包括偶聯有疏水標記物的蛋白質A36，具體的標記物是靛藍，它同表面10的區域12上的與蛋白質A相結合的IgG發生結合，并同表面10的區域16上的與HIV相結合的IgG發生結合。該檢測試劑還包括抗-IgA-IgG38，其與表面10的區域16上的與HIV相結合的IgA發生結合，并與表面10的區域16上的與HIV相結合的IgM發生結合的抗-IgM-IgG40。靛藍是與抗-IgA-IgG38和抗-IgA-IgM40相疏水偶聯的，同時起到標記物和封閉劑的作用，封閉的是它們各自與蛋白質A36的結合位點。
如上所述，檢測固相11的孔徑最優選為約10～20微米。檢測固相11的相對較大的孔徑以及由此而造成的過量檢測試劑迅速通過固相11的流動速率，就可以使外源物質34同檢測表面10通過固相11時發生的非特異性結合被降低，并且可以省去在加入樣品和加入檢測試劑之間的清洗步驟。再者，快速地加入樣品到檢測表面10以及快速地加入檢測試劑都使得非特異性結合的發生無法獲得足夠的時間。
當加入檢測試劑后，在第一固定化檢測試劑區12和第二固定化檢測試劑區16都存在著肉眼可見的靛藍標記物，都指示樣品中含有HIV抗體(圖2c)。如果僅在第一固定化檢測試劑區12上存在有標記物(即在區域16沒有標記物)表明沒有HIV抗體的存在(圖2f)。
該檢測的一個方面是確定樣品在檢測表面上的分布的均勻性。檢測試劑被固定在區域12和16，還可以固定在另外的區域(未標出)，但表面10的其他區域則不固定任何檢測試劑。對表面10的選擇是在不含有固定化的檢測試劑的區域上暴露出化學功能團，并且使表面10在第一次加入樣品到第一程度時發生被標記的檢測試劑的某種程度的非特異性結合，并且，在表面10與樣品以第二程度接觸時發生另一程度的結合。換句話說，在加入了樣品以后，被標記的檢測試劑與表面10的低水平的非特異性結合也還會發生。如果樣品是非均勻地加到表面10上，那么那些加入較少樣品的區域就會發生較多的與標記物的非特異性結合。這樣，在表面10上的均勻的徑跡就表示樣品的均勻分布，而不均勻的徑跡就表示不均勻的分布。根據本發明，如果在某一區域沒有加入樣品則在該區域就會有很強的標記物的非特異性結合，并且表面10上就會有暗癍。優選的是，樣品只部分地封閉標記物的非特異性結合以提供對樣品分布的絕對測量值和相對測量值。由于血清樣品在檢測過程中對表面10進行封閉，因而過量的靛藍42在檢測表面10上的分布的均勻性就指示著傳遞部分20將血清樣品在表面10上所進行的分布的均勻性。因此，這一指示也可以用來確定某一測試的可靠性。
參見圖3a～c，在進行了圖2所示的檢測后，檢測表面10的外表分別指示錯誤結果(a)，陰性結果(b)和陽性結果(c)。圖3a表示的是錯誤結果，染料被不均勻地且非特異性地結合到檢測表面10，指示著血清被不均勻地加到表面10。另一個對錯誤結果指示的(未給出)是檢測表面完全黯淡，指示染料徹底地涂布了表面10。這種情況也可能是在加入檢測制劑之前血清沒有對表面10進行適當的涂布。在圖3b中，區域12上存在染料以及整個表面10存在著淡淡的染料背景，并且在區域16上沒有染料存在都表示沒有感染發生。IgG與區域12上所固定的蛋白質A相結合并進而與檢測試劑中的染料偶聯的蛋白質A相偶聯。然而，在區域16沒有HIV的抗體被固定下來，這一點是由在區域16上缺少被固定的標記檢測試劑而指明的。在圖3c中，檢測試劑中的標記物被結合到區域12和16上，指明有感染發生，也表明在區域16上的與固定化的HIV結合的血清樣品中的HIV抗體的存在。在所有這些情況下，依據本發明所展示的檢測，在區域12上結合的標記物都被作為對照。
在圖4和圖5中，表明了根據本發明的檢測試劑盒的安排，其整體以44來表示，包括基座46，該基座有空腔48。空腔48在其底表面有向上的凸起60，空腔48內裝有彈性吸收部件50，例如棉花球，該棉花球的安排是在其發生自然膨脹時會向上頂起該基座46的上部。彈性的吸收部件50在空腔48的頂部支持著檢測固相11，也就是說當外力向下壓迫部件50的擴張力時，它就與基座46的上表面平行。樣品傳遞部分20被裝在其中，并且與四邊形的突出52為一整體，該整體是延伸在基座46的一部分上并跨過腔體48以使傳遞部分20位于檢測固相11之上。當膜限定了預過濾器28和擴散部分26(在圖4、圖5中沒有標出)，突出52就起到將預過濾器28的邊緣和擴散膜26的邊緣連接起來的作用，并將預過濾器28的接收表面與擴散膜26面對面地放置在一起。蓋54將突出52和傳遞部分20連接在一起，蓋54可以通過鉚接、緊箍56或超聲焊接等方式與基座46連接起來。蓋54上有一個開孔58能將大部分的傳遞部分20暴露出來，且其周邊與吸收部分50通過檢測固相11向上傳遞到傳遞部分20的力相抗衡。這樣，傳遞部分20的傳遞表面22就與檢測固相11的檢測表面10吻合相接。如果是用膜限定擴散部分26，則擴散膜26和預過濾器28的接收表面24就會在此時吻合相接。蓋54的開孔58的周邊就對傳遞部分20的擴散材料26的周邊產生向下的力，而彈性吸收部分50就作為壓緊部件對檢測固相11產生向上的力。突出52從蓋54下面向外伸展，以使得傳遞部分20可以被方便而又快速地從蓋54和檢測固相11下面移去。
當把樣品加到傳遞部分20的接收表面24(預過濾器28沒有被標示出來)，則樣品就被過濾并且由傳遞部分20迅速而均勻地傳遞到檢測表面10，這一點在進行檢測時就是所觀察到的接收表面24(或擴散膜26的上表面的)放射形濕潤。當表面24被徹底濕潤后，需要經過幾秒鐘的時間才可以使樣品液體膜完全滲透過預過濾器28并潤濕檢測表面10。此后，可以將突出52從蓋54下移出，彈性的吸收部件50就可以將檢測固相11向上沿著蓋54的開孔58的邊緣而頂起。在蓋54上含有沿開孔58的液體小井。將檢測試劑加到該液體小井中，就可以迅速地流過檢測固相11并被彈性吸收部件50所吸收。此后，檢測表面10就可以產生可見的對陽性或陰性反應或錯誤結果的指示，如圖3a～c所示。整個檢測操作過程歷時不到1分鐘，一般約為30秒。
如果突出52將基座46內的空腔48完全蓋住，則就要在空腔內形成一個小孔以使得被吸收部件50所吸收的液體而排出的空氣可以被釋放出來。如果突出52并不完全覆蓋空腔48，則就不需要小孔，因為空氣就可以沿著突出52釋放出來。
如同以上所述，彈性吸收部件50造成檢測固相和傳遞膜的稍微向上的突起。應該理解，這種安排是與本發明的檢測試劑盒的各成分相適應的，其中傳遞部分特別是預過濾器28的傳遞表面24以及檢測表面10是處于基本相互平行的位置。此外，以上所述的由擴散表面26而造成的檢測液的放射擴散是以與傳遞表面24基本相平行的方式進行的，而且還應該理解的是這種擴散也包括在如圖5所示的傳遞部分20上的稍微向上突起的那一部分的擴散。
以下的各實施例都是用來說明本發明的，并不對本發明的范圍進行限制。例如，雖然在各實施例中都以染料或色素作為標記物，但很多種其它的標記物也都可被采用。同樣，雖然在各實施例中都以硝化纖維素作為傳遞部分和檢測表面的材料，但其它的各種多孔材料也可以用來制造這些部分。雖然在實施例中給出的檢測表面基本上都為圓形，但也可以采用其它的各種不同形狀及其尺寸。在各實施例中，雖然都是用固定化的抗原去檢測血清樣品中的對該固定化抗原為特異性的抗體，并且用固定化的蛋白質去捕獲IgG來作為對照，但是，還可以采用任何其它的檢測方式。以上所述的以及其各種修飾和等同物都是屬于本發明的范圍之內。
實施例1HIV1冷凍物的生產程序在本實施例及以后的實施例中，除了另有說明外，所有使用的化學品都是從Sigma Chemical Corporation(St.Louis，MO)獲得的。制備所需溶液制備LB溶液是將5克酵母提取物(DIFCO/VWR)，10克胰蛋白胨(DIFCO/VWR)以及10克氯化鈉溶于1升MilliQ水，將pH值調節至7.2，然后高壓消毒。MilliQ水是將水通過MilliQ水系統(Millipore Corp.，Bedford，MA)過濾而制備。該溶液被冷卻并加入氨芐青霉素使其最終溶液為0.1mg/ml。
SOB液體培養基的制備是將5克酵母提取物和20克胰蛋白胨溶于1升含10毫升1M氯化鈉的MilliQ水中，調節pH值至7.5，將該溶液高壓消毒并冷卻。加入10毫升1M氯化鎂和10毫升1M硫酸鎂使最終溶液被調節至20mM氯化鎂/硫酸鎂。
FSB溶液是依據Maniatis(Molecular Cloning)，§1.78所述制備。在MilliQ水中加入以下各成分10毫升1M乙酸鉀(pH7.5)，8.91克MnCl24H2O，1.47克CaCl22H2O，7.46克氯化鉀，0.80克氯化六氨合高鈷，100毫升甘油(Amresco)。用MilliQ水將該溶液調至1升，并且用0.1N鹽酸(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)調節pH值至6.4。制備E.ColiHIV1原料LB液體培養基(10ml)用0.2ml甘油(Amresco)接種，然后在搖動培養器上以28℃、300RPM過夜培養。將該過夜培養物加入到1升PyrexFembach燒杯中含有的20mM氯化鎂/硫酸鎂的200mlSOB中，繼續使該培養物生長直至光密度為0.6～0.7。然后將細胞轉移到無菌、可廢棄的、冰冷的50ml聚丙乙烯試管(Falcon)中，然后將該試管放在冰上10分鐘，使其冷卻至0℃。隨后的步驟都是在無菌條件下進行的。
用TZ-28轉子(Sorvall)的RC-5B離心機(Sorvall)以4000RPM在4℃離心10分鐘回收細胞。在把上清液完全去除以后，將片狀沉淀物以輕微的渦旋重懸浮于大約80ml(每個50ml的試管內加入20ml)的冰冷FSB。將該細胞放置在冰上10分鐘，再以4000RPM在4℃離心10分鐘回收細胞。在把上清液完全去除以后，將片狀沉淀物以輕微的渦旋重懸浮于大約20ml(每個50ml的試管內加入5ml)的冰冷FSB。0.7ml(每50ml的試管加入175微升)的DMSO被輕緩攪動加入到該溶液中，然后將該懸浮液放置在冰浴上。然后再加入175微升(每50ml試管)的DMSO，輕微攪動該懸浮液并將其放回至冰浴上。將該懸浮液等分(0.2ml)到冷卻的、無菌的微離心管(microfuge tube)中，然后將其蓋緊并插入到甲醇干冰浴中冷凍。將這些微離心管保存在-80℃直至取用時為止。從冰凍的DMSO原液制備HIV1在冰凍了這些細胞至少兩天以后，可以從開始培養物，即從冰凍的DMSO原液中生長出來的培養物中確定高產誘導的HIV1。為了進行本分析，將該原液從-80℃冷凍柜中取出并放置在冰上解凍。將0.2ml細胞加到1mlSOB培養基中，然后在28℃培養1小時。將1.2ml這種培養物加入到200mlLB培養基中(0.1mg/ml氨芐青霉素(Amresco))，并在28℃過夜培養而制備起始培養物。然后按實施例2所述的方法提純HIV1。
實施例2HIV1的提純和生產制備所需溶液制備LB溶液是將17克酵母提取物(DIFCO/VWR)，34克胰蛋白胨(DIFCO/VWR)以及34克氯化鈉溶于3.4升MilliQ水(Millipore Corp.)，調節pH值至7.2，然后高壓消毒。該溶液被冷卻并加入氨芐青霉素(Amresco)并使其最終溶液為0.1mg/ml。
1升50mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH8.0的制備如下在MilliQ水中溶解6克氨基丁三醇堿(TRIZMA BASE)和744毫克EDTA，用鹽酸(J.T.Baker)調節該溶液的pH值至8.0，用MilliQ水將該溶液的最終體積調至1升。
在含有1毫升TWEEN20(0.1％，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯，Calbiochem，La Jolla，CA)的MilliQ水中溶解480.5克UREA(8M)(Amresco)，4.08克BICINE(25mM)，1.54克DTT(10mM)和1.86克EDTA(5mM)來制備1升的提取物緩沖液(Extract Buffer)。將該溶液的pH值調節至8.5并用MilliQ水將其體積調節至1升。
在1升的MilliQ水中溶解250克硫酸銨來制備1升的25％硫酸銨溶液。培養和誘導3升的含HIV1的E.Coli實施例1的培養物接種到含200毫升LB液體培養基的Pyrex Fembach燒瓶中，在搖動培養床上以300RPM、25℃過夜培養。保留10毫升該培養物并在4℃保藏以用作試驗的對照(非誘導的對照)。第二天，對三個含1升LB液體培養液的2.8升Pyrex Fembach燒瓶各接種50毫升該培養物。在搖動培養床上以300RPM、30℃培養該培養物直至其光密度在600nm處為0.6-1.0時為止(2～3小時)。
將該培養物從30℃的搖動培養床上取出并以160～170毫升的等分轉移到無菌的0.5升Pyrex Fernbach燒瓶中。將該燒瓶放入60～70℃的水浴中使等分培養物的溫度被迅速提高。在水浴中時搖動該燒瓶并對其內部溫度進行監測。當培養物一達到42℃(2～3分鐘后)，就將燒瓶中的內容轉移到被預熱的2.8升Pyrex Fembach燒瓶中(6個空的并消毒過的2.8升的Pyrex Fembach燒瓶被放在200RPM的搖動床上以42℃預熱)。重復該過程直至6個燒瓶中的每一個都含有0.5升被誘導的培養物為止。將該燒瓶蓋住并使其搖動速率升高至400RPM。從6個燒瓶中各取1毫升并保存起來作為誘導實驗的對照(誘導的對照)。將培養物以400RPM、42℃培養過夜。第二天用Sorvall RC-5B離心機以8000RPM離心20分鐘收取細胞。如果這些細胞不需要立即進行提純的話，就將其儲存在-80℃。內含體的提取和純化將細胞的片狀沉淀物解凍并重懸浮于總量為300毫升的50mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA(100ml/1L培養物比率)。為了有效地進行重懸浮對該溶液進行聲處理(Branson sonifier Model450)，并加入溶菌酶使其最終濃度為100mg/ml(使用了3毫升10mg/ml的原液，該原液是從50mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA新制備的)。向該溶液中加入1/100體積的10％Triton X-100(3ml)，并在30℃培養15分鐘，然后將該溶液放在GS-3轉子的Sorvall RC-5B離心機上以8000RPM離心1小時。如果上清液不是清澈的，那么就將其再離心1小時或將該溶液放在TZ-28轉子以15000RPM進行離心。收集上清液并放在4℃保存直至等分(100微升)試樣被用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(LYSOZYME SUP)分析為止。將片狀沉淀物以聲處理重新懸浮于總量為300毫升的50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA(100ml/1L培養物比率)中并取出100微升(LYSOZYME PREC)進行PAGE分析。按以上所述進行離心(在GS-3轉子(Sorvall)的RC-5B離心機以8000RPM離心1小時)并移出100微升上清液以進行PAGE分析(WASH SUP)。將片狀頭沉淀物以聲處理重懸浮于總量為60毫升的提取物緩沖液(20ml/1L培養物比率)中取出20微升的等分并保存，用作實驗對照(提取物1)。該細胞懸浮液放在RC-5B離心機的TZ-28轉子以15000RPM進行離心30分鐘。該上清液被轉移至新的試管以作進一步的提純(溶液1)。片狀沉淀物被重懸浮于30毫升的提取物緩沖液中，并按前述步驟進行離心(在TZ-28轉子以15000RPM的速率離心30分鐘)。在進行此次離心之前，移出20毫升的等分試樣以用作試驗對照(提取物2)。該上清液被轉移到新的試管中進行進一步的提純(溶液2)。從溶液1和溶液2中各取20毫升等分試樣用作試驗對照。
合并溶液1和溶液2，加入5體積的25％硫酸銨(450ml)對內含體進行沉淀。該溶液放在RC-5B離心機的GS-3轉子以8000RPM進行離心1小時。如果上清液不是清澈的，那么就將其再離心1小時或將該溶液放在TZ-28轉子以15000RPM進行離心。移出20微升的上清液等分試樣以用作試驗對照(溶液3)。再加入60毫升提取物緩沖液并以聲處理使片狀沉淀物再次溶解。移出20微升重懸浮的片狀沉淀物用作實驗對照(提取物3)。用300毫升(5體積)25％硫酸銨對該溶液進行沉淀，并按以上所述進行離心(GS-3轉子以8000RPM進行離心1小時)。移出20微升上清液的的等分試樣用作實驗對照(溶液4)。將片狀沉淀物以聲處理再次懸浮于100毫升(原始培養物體積的1/30)的提取物緩沖液中(內含體)。用電洗脫提純(Electroelution)HIV113毫升甘油(Amresco)和13毫升的10％SDS(GIBCO BRL，Helgerman，CT)被加入到按前述步驟所獲得的內含體的懸浮液中(100ml)，移出16～17毫升的等分試樣用于電泳，剩余的樣品被儲存在4℃(或在-80℃進行長期保存)。
制備性SDS聚丙烯酰胺凝膠(37mm ID)是按照BIO-RAD Model 491準備細胞的說明書(13～15頁)來制備。在澆入凝膠時使用了80毫升(10cm)的12％凝膠分離液和28毫升(3.5cm)的凝膠堆積液。該Model 491細胞制備儀(BIO-RAD)是按照其說明書(第15～20頁)而組裝的。在加樣以前，向每一個16～17毫升等分樣品加入含有溴酚藍和160微升β-巰基乙醇的50微升樣品緩沖液。將該樣品加熱至90℃10分鐘(即通過將等分小樣轉移到eppendorf試管中并將其放在加熱區而實現的)。在每一個制備性凝膠中都加入總量為16～17毫升的樣品。加樣以后，該Model 491儀器的工作條件是恒電流40mA、22小時，洗脫緩沖液的速率是30毫升/小時(0.5ml/分)，收集各組分20分鐘。
當對溴酚藍進行洗脫以后，收集10微升的等分樣品。將這些等分試樣走12％SDS(GIBCO/BRL)聚丙烯酰胺凝膠以確定其中每一個含有27.3kd的HIV1蛋白質。隨后合并含有HIV1的各組分并按以下所述的沉淀和重懸浮方法進行純化。
對每一份對照都按照所述的方法進行處理，并將各樣品的10微升等分試樣在還原條件下走12％SDS(GIBCO/BRL)聚丙烯酰胺凝膠。
誘導的和未被誘導的對照將每一份樣品都轉移到eppendorf試管并旋轉以分離出不溶物質，將上清液棄去，并將片狀沉淀物重懸浮于0.1毫升的MilliQ水中。
溶菌酶懸浮液，溶菌酶沉淀，溶液1、2、3和4以及提取物1、2和3將這些對照都以80微升稀釋，并用10微升等分試樣在PAGE凝膠上走電泳。檢測表面漬點的HIV1沉淀和重懸浮從電洗脫中收集到的各HIV1組分被加到新的離心管(50ml，Sarstedt，Newton，NC；250ml，Corning，Corning，NY，或等同物)，該離心管可以容納3倍的初始體積。將二體積的100％乙醇加到其中并與其內的成分相混合。在室溫下至少培養30分鐘后將該懸浮液放在SS34轉子(Sorvall)SorvallRC-5離心機上以4000RPM連續離心30分鐘。將上清液移出并保存，將該試管倒置以取出所有流體，則沉淀物是白色的蠟狀并有光澤的非常細致的物質(即沒有顆粒)。將該沉淀物用最少量的0.1N氫氧化鈉重懸浮。在進行這一步驟時，氫氧化鈉必須以200微升的量分次加入直至沒有殘存的可見固體時為止。然后將該溶液用離心機離心5分鐘以去除剩余的固體，對該溶液的蛋白質濃度進行確定，然后以每道5μg樣品的量在走還原的和未還原的條件走15％SDS-PAGE。最后按照實施例4所述的方法將含有2μg HIV1的0.5微升液體漬點化。
實施例3制備直鏈淀粉柱和洗脫緩沖液以及對HIV2的生產和純化程序制備所需的溶液在900毫升MilliQ水中溶解1.2克氨基丁三醇堿、11.7克氯化鈉和372毫克EDTA來制備直鏈淀粉柱緩沖液。當這些化學物質徹底溶解后，加入700微升β-巰基乙醇并用10N鹽酸將pH值調至7.4(偏差不超過0.1)。將該溶液通過0.45mm過濾器(Costar，Cambridge，MA)過濾以達到對溶液的消毒。消毒過的溶液被儲存在4℃。如果該溶液的儲存期超過30天，就不要再使用了。
直鏈淀粉洗脫緩沖液的制備是將1.2克氨基丁三醇堿、11.7克氯化鈉、372毫克EDTA和3.42克麥芽糖加入到900毫升MilliQ水中。當這些化學物質徹底溶解后，加入700微升β-巰基乙醇并用10N鹽酸(J.T.Baker)將pH值調至7.4(偏差不超過0.1)。將該溶液通過0.45mm過濾器過濾以達到對溶液的消毒。消毒過的溶液被儲存在4℃。如果該溶液的儲存期超過30天，就不要再使用了。
制備LB液體培養基是將5克酵母提取物(DIFCO/VWR)，10克胰蛋白胨(DIFCO/VWR)以及10克氯化鈉溶于1升MilliQ水，調節pH值至7.2，然后高壓消毒。該溶液被冷卻并加入氨芐青霉素(Amresco)并使其最終溶液為0.1mg/ml。將該LB液體培養基以1升的等分加到6個2.8升的每個Pyrex Fembach燒瓶中，并將400毫升的該LB液體培養基的等分試樣加到1升Pyrex Fembach燒瓶中。
100ml的100mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)500ml的20％乙醇(V/V)8升由1X磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)pH7.26升E.coli/MBP結構的生長含在1升Pyrex Fembach燒瓶中的400毫升LB液體培養基(100mg/ml氨芐青霉素，Amresco)用被轉染的培養物進行接種，然后放在搖動培養床上以250RPM、37℃過夜培養。將10毫升的該培養物保存在4℃用作試驗對照(未誘導的)。6個2.8升的含有1升LB液體培養基的PyrexFernbach燒瓶用50毫升在前一步驟中生長的培養液進行接種。將其放置在搖動培養床上以250RPM、37℃使培養物生長直至光密度在600nm處為0.6～1.0時為止(2～2.5小時)。將3毫升的該培養物移出用SDS-PAGE分析其誘導(未誘導2)。
對每個燒瓶中加入10毫升100mM IPTG對培養物進行誘導。蓋住燒瓶并放在37℃以250RPM培養3小時。測定其最后光密度并取出3毫升該培養物的等分試樣，用SDS-PAGE分析其誘導(誘導)。用SorvallRC-5B以8000RPM離心20分鐘收取細胞。如果對細胞不需要進行立即純化，則將其儲存在-80℃。
通過對以上分離出的對照樣品進行電泳來分析其誘導。未誘導、未誘導2和誘導樣品各1毫升用微離心機離心，將沉淀物重懸浮于100微升的MilliQ水中。10微升的該細胞懸浮液的等分試樣在還原條件下走15％SDS-PAGE凝膠。內含體的提取將細胞沉淀物解凍并重懸浮于直鏈淀粉柱緩沖液中，其比率為每克沉淀物對10毫升緩沖液。對該樣品進行聲處理直至獲得完全懸浮。在聲處理過程中將該懸浮液放置在冰浴下冷卻。當達到完全懸浮后，將該樣品于室溫下在搖動平臺或滾筒中培養4小時(或過夜培養)。但是，要收取1毫升的該懸浮液以進行SDS-PAGE的對提以物的分析(溶液1)。
將樣品轉移到高速離心試管中并在SorvallRC-5B(TZ-28轉子)離心機上以18000RPM離心20分鐘。將上清液移入到250毫升的錐形試管中并用相同體積的直鏈淀粉柱緩沖液稀釋。再用500毫升0.45mm過濾器對該混合物進行無菌過濾，過濾后的溶液含有不含細胞的提取物(CFE)。
將溶液1和CFE的等分試樣走凝膠以確定上述過程的有效性。將0.5毫升的溶液1的等分試樣裝入到新的eppendorf試管中并用微離心機離心得到沉淀物。棄去上清液，將沉淀物重懸浮于0.5毫升MilliQ水中。將溶液1的沉淀物懸浮液的5微升等分試樣以及5微升的CFE在還原條件下走15％SDS-PAGE凝膠。用直鏈淀粉柱時MBP結構進行提純給2.5cm×30cm HPLC柱(Amicon，Beverly，MA)配置蠕動泵(Pharmacia LKB Pump P-l，Piscataway，NJ)，UV檢測器(Pharmacia LKBUvicord SII)，和圖譜記錄儀(Pharmacia LKB Recl)。當該設備被預熱后(使用前30-60分鐘)，向該柱內加入60-80毫升的直鏈淀粉樹脂，并用4-5柱體積的MilliQ水過柱。該樹脂用兩柱體積的直鏈淀粉柱緩沖液平衡。
開動圖譜啟示儀并在其開始記錄到穩定的底線時，用4號泵(×10)將CFE加入到其中。在250毫升錐形試管(Corning/VWR，Corning，NY)中收集100毫升的流過(FT)的液體的等份試樣(在該柱達到飽和以后所收集到的各組份被放在另一個柱上走柱)。一旦全部的CFE都通過樹脂后，就用直鏈淀粉柱緩沖液洗柱直至達到底線時為止。
一旦達到底線后，就用直鏈淀粉洗脫緩沖液對該柱走柱。在最初的3～5組份中有所述的結構被洗脫下來，在色譜上造成非常突起的峰。收集各組份直至再次達到底線時為止。
在還原條件下的15％SDS-PAGE凝膠上根據峰的大小不同而選取2-5微升各組份的等份試樣(非常弱的峰需要更多的樣品)走膠。同時還對每一個峰的兩個組份以及FT組份進行走膠。對FT組份走膠為的是確定是否樹脂已達到飽和。如果達到了飽和，就將其整體或一部份通過另外的第二個柱。如果用SDS-PAGE確定的蛋白質的純度大于90％，則就將峰的各組份收集在一起并用MWCO25,000透析膜(Spectrum，Los Angeles，CA)在4℃對4升體積的1×PBS PH7.2進行透析。每一循環至少為4小時。如果有顯著的雜質存在的話，就對透析過的蛋白質進行SDS-PAGE和Western Blot分析。
直鏈淀粉樹脂在喪失其結合能力之前可以被反復使用五次。在保存柱的時候，是要將20％乙醇(Aaper Alcohol，Shelbyville，KY)對該柱走過2-3體積，然后保存在室溫之下。
實施例4固定在檢測表面上的HIV1和HIV2的制備將HIV1和HIV2抗原要連接在其上的多孔硝化纖維膜(Millipore704，10-20μm，SA3M214H2，nitrocellulose)切割成20mm的方塊，并放置在試驗臺上的蘭色隔離層上面。在每一方塊前沿的底中部都作好標記以保證帶有漬點的一面向上并且保證方向是準確的。用0.1N氫氧化鈉將HIV1抗原稀釋至8mg/ml，并且用0.2μm過濾的蒸餾水(FDW)將HIV2抗原稀釋至4mg/ml。將等體積的HIV2溶液加到等體積的HIV1的溶液中并充分混合且不產生泡沫(HIV1/2 combo-antigen)。將蛋白質A(Repligen，RPA-100)以1mg/ml溶解于過濾的蒸餾水中作為對照。這些溶液要在使用的當天進行配置。
用0.5微升的HIV1/2蛋白質溶液在檢測表面的底中部接點(靠近標記號)，并且將0.5微升的蛋白質A在頂中部接點。各接點在檢測表面的中央部分被分開，沒有互相重疊，并且在室溫下干燥至少30分鐘。將接點過的膜放在齒合封口塑料袋中保藏在4℃。
實施例5預過濾的封閉程序將多孔的硝化纖維預過濾膜(Millipore，HATF 08250，0.45μm，nitrocellulose)切成20mm方塊，并浸泡在含有5％小牛血清(FBS，JRH#12-10378P)的PBS中20分鐘。然后將所得到的每一個過濾膜都從封閉緩沖液中取出，浸泡在PBS中以清洗掉多余的FBS，隨后轉移到PBS-2％聚乙二醇(PEG；3000-3700MW)中。一旦把過濾膜從PBS-PEG中取出以后，就將它們放在濾紙上，在室溫下干燥至少30分鐘。將這些膜放到齒合封口塑料袋中于4℃保存。
實施例6傳遞部分的組裝方法用切割成20mm見方的多孔擴散材料膜(Millipore704，10-20μm，SA3M214H2，nitrocellulose)來制備傳遞部分。將每一方塊的膜放在由兩層粘性材料組成的標簽的向上的粘性層上，以完全覆蓋住在標簽上的1.5厘米的孔。在標簽上部作出記號以區別于標簽的下部。將實施例5的被封閉的檢測表面的膜從塑料袋中取出(Millipore，HATF 08250，0.45μm，nitrocellulose；有時使用的是Millipore HAHY0000)。然后將每一塊膜粘附到標簽的沒有進行標記的粘性底面的1.5厘米孔上。所述的膜都是被小心地粘附到標簽的粘性表面以保證均勻地接觸。仔細地將所有的標簽都疊加起來(粘性面相對)以保證標簽上的孔都對齊，然后將多余的標簽部分去除。這樣標簽就起到了連接的作用，將擴散膜和預過濾膜放置成面對面的狀態。將該組裝好的傳遞部分儲存在齒合封口塑料袋中于4℃保存。
實施例7檢測試劑藥盒的組裝方法從Porex Technologies獲取到具有長3.5厘米，寬2.1厘米，深0.7厘米腔體的塑料容器。在該腔體的底部有一個直徑約為1.5厘米，高度約為0.3厘米的向上的圓形突起。一種吸收材料特別是棉花球，被壓放在該腔體的底部并使該棉花球放到該底部表面的1/2英寸的地方，在該棉花球的上部放置實施例4的點涂過的膜，并在其上再放置一個預過濾膜(預過濾膜選自實施例6)。從Porex Technologies公司還獲取到塑料蓋，該塑料蓋上有一個直徑約為1.0厘米的開孔，并且緊挨該開孔形成小井，將該塑料蓋放置在膜的上面以使該膜對該開孔居中，將該塑料蓋下壓并鎖緊。這樣膜就顯現出稍微的向上突起，并在向下壓時表現為很堅實的，這就證明組裝已經正確地完成。也就是說檢測固相的檢測表面(實施例4的點涂過的膜)是與傳遞部分的傳遞表面均勻相接觸。同樣地，傳遞部分的擴散膜和預過濾膜都與實施例6的標簽連接部分處于面對面的狀態，并且是處于均勻地接觸形式。
實施例8用靛藍標記的蛋白質A的制備方法將靛藍(Aldrich，22，929-6)放入到研缽中并用研杵研碎直至粉末很細很均勻為止(約15分鐘)。將1.5克研磨過的靛藍懸浮到500ml的Erlenmeyer燒瓶內的300毫升MilliQ水中，并將該溶液在65℃加熱10分鐘。將該溶液用聲處理90分鐘(Branson450，duty cycle70，output4)然后使其冷卻至室溫(約90分鐘)。用0.1N鹽酸將該溶液的pH值調至5.5。1mg/ml蛋白質A溶液(Repligen，RPA-100)在氘水中制備，將1.75毫升該溶液加到處于50毫升試管(Nalgene polypropylene-capped，需要8個試管)的35毫升靛藍懸浮液中。所得溶液為50μg/ml。在室溫下培育10分鐘以后將該溶液放到SS34轉子(Sorvall，RC-5)上以18000RPM離心50分鐘。移去上清液，將沉淀物重懸浮于30ml的10mM Na2HPO4的含有0.5M氯化鈉和1％BSA(PBSBSA)并且pH值為7.4的溶液中。將該溶液放在SS34轉子(Sorvall，RC-5)以18000RPM離心25分鐘，并將沉淀物重懸浮于含有10％甘油(PBSBSAG)的30毫升PBSBSA溶液中。將該溶液放在SS34轉子(Sorvall，RC-5)以18000RPM再次離心25分鐘，并將沉淀物重懸于30毫升PBSBSAG溶液中。用8μm過濾器(Whatman)過濾該溶液，歷時約20分鐘并且損失很小。然后用2μm過濾器(Whatman)過濾該溶液，歷時約1小時并且損失約30％。將4微升PAI加入到750微升的氘水中，并用PBSBSAG將其光密度OD610調至0.0075。將1.5毫升的稀釋的PAI等分裝入小瓶(Sarstedt，72730-005)并保存在4℃。
實施例9靛藍標記的抗-IgM-IgG和抗-IgA-IgG的制備方法將2克靛藍(Aldrich，22，929-6)放入到研缽中并用研杵研碎直至粉末很細很均勻為止(約15分鐘)。將1.5克研磨過的靛藍懸浮到500ml的Erlenmeyer燒瓶的300毫升MilliQ水中，用錫紙蓋住，并將該溶液在65℃加熱10分鐘，然后冷卻至室溫(約90分鐘)。用0.1N鹽酸將該溶液的pH值調至1.5。450μg/ml的抗體溶液的制備如下將3.4mg/ml的12mlBethyl山羊抗-人IgA#A920-6(親和純化的)加入到2mg/ml的16ml Bethyl山羊抗-人IgM#M21-6(親和純化的)中，總體積為28ml，并且總量為78毫克。將18毫升該靛藍懸浮液加入到8個40毫升的試管中(Sorvall，03530)，再將3.5ml的Ab combo加入到每一試管中得到500μg/ml的溶液。室溫下培養該溶液30分鐘，將該溶液以18000RPM離心(SS34轉子Sorvall，RC-5)50分鐘。棄去上清液，將沉淀物重懸浮于含0.5M氯化鈉(Sigma)和1％BSA(Miles，Pentax，Fract V，81003-40[PBSBSA])的pH7.4的18ml的10mM Na2HPO4(Sigma)中。將該溶液以18000RPM離心(SS34轉子Sorvall，RC-5)25分鐘，并且關閉制動。沉淀物重懸浮于含10％甘油(Amresco，0845)(PBSBSAG)的18毫升PBSBSA中。將該溶液以18000RPM再次離心(SS34轉子Sorvall，RC-5)25分鐘且關閉制動，并將沉淀物再次懸浮于18ml的PBSBSAG中。對該溶液進行過濾，依次使用8μm過濾器(S&S固定化膜，#AE99)、5μm過濾器(MSI，magna尼龍轉移膜)，和2μm過濾器(Millipore，Immobilion AV-2，SA3J898E8)。在610nm檢測該溶液的光密度值，將8微升Ab-I加入到1.5毫升PBSBSAG中，并用PBSBSAG將其光密度值調至0.03。例如，如果8微升的光密度值是0.12，則用PBSBSAG將PAI按1∶4稀釋。在最終濃度的溶液中加入NaN3并將該溶液保存在4℃。
實施例10檢測試劑的制備將15.6毫升的IMA(實施例9所制備的溶液)與109.4毫升的IPA(實施例8的溶液)相混合。向該溶液內加入含有40μg/ml NaN3的375毫升PBSBSAG。溶液的總體積為500毫升，并且其光密度OD610＝0.015。向該溶液內加入含有40μg/ml NaN3的500毫升PBSBSAG，其最終溶液的光密度值OD610＝0.0075。
實施例11蛋白質A、抗-IgA、抗-IgM-色素檢測劑的制備方法將100mg色素，即17份紅#235-7515，23份紫#246-1670或7份綠#264-3120(Sun Chemical，4526 Chickering Avenue，Cincinnati，OH45232)加入到50毫升的錐形試管(Sarstedt)中。向含有色素的試管加入下述成分中的一種1)1mg/ml蛋白質A(RAP-100，Repligen)的蒸餾水溶液20毫升；2)6毫升山羊抗-人IgA(A80-102A，Lot A92G，3.4mg/ml，Bethyl Labs，Montgomery，TX)；或3)8毫升山羊抗-人IgM(A80-100A，Lot M121G，2.0mg/ml Bethyl Labs)。每一個試管中的物質都是通過來回顛倒而使之懸浮(約30分鐘)，但要小心的是不要產生很多的泡沫。含有凝塊的懸浮液是沒有被充分懸浮的，而清澈的液體是沒有吸收色素的。向每一個試管中加入PBSBSAG(10mM Na2HPO4，0.5M氯化鈉，1％BSA#81003-40，Miles，Pentax，10％Glycerol#0854-1，Amresco)使其最終體積達到45毫升，將每一試管中的物質都反復顛倒而使其懸浮，并用不銹鋼攪棒將成塊的物質打碎，但要小心不可產生過多的泡沫(約15分鐘)。將已經開始吸收色素但仍有凝塊并且沒有被充分懸浮的懸浮液在室溫下培養45分鐘，再以18000RPM離心25分鐘，離心時關閉制動(Sorvall，RC-5離心機，SS34轉子，使用50毫升離心管，Sorvall，#03530)。棄去上清液，沉淀物重懸浮于100毫升PBSBSAG。先用8μm過濾器(S&S，AE99)，再用2μm的過濾器(Millipore，Immobilion AV-2，SA31898E8)對該懸浮液進行過濾，再向該溶液加入NaN3并使最終濃度為20μg/ml。
實施例12檢測將120微升血清樣品直接加到本發明的檢測試劑盒的傳遞部分的中心，經過了10～15秒后將傳遞部分移出并棄去。將實施例10所得的檢測試劑1.5ml(0.015 OD單位)加入到小井中并允許其流通過膜(約10秒鐘)。記錄其結果。
實施例13使用檢測試劑盒的陽性、陰性和錯誤結果的比較陽性和陰性HIV血清樣品各120微升被分別加到本發明的檢測試劑藥盒的傳遞部分的中心。經過大約10～15秒后將各自的預過濾膜移去。將1.5ml本發明實施例10的檢測制劑加到免疫藥盒的小井中并以約10秒的時間使其通過該檢測膜。圖2c顯示的是加入了檢測試劑之后陽性血清樣品對檢測表面所造成的結果。圖2b表示的是加入了檢測試劑之后陰性血清樣品對檢測表面所造成的結果。作為對照實例(錯誤)，即將按照本發明實施例10所制備的檢測試劑盒的預過濾部分移去之后，用陰性血清樣品均勻地濕潤其檢測表面的結果。也就是說，檢測表面與血清的接觸程度超過其它部分。隨后，將本發明實施例10所制備的檢測制劑1.5ml加入到該檢測膜上并使其通過該膜。這一結果見于圖2a。用肉眼可以觀察到在該檢測表面上的標記物的不均勻分布。這就表明血清加在該檢測膜的表面上是不均勻的。
在此以前所給出的各實施例，都是用來說明本發明的，并不對本發明的范圍給予任何限制。本技術領域的普通技術人員可以在不脫離本發明的實質和精神及范圍之內尋找到其它的實施例和變型。
權利要求
1. 一種將樣品傳遞到檢測表面的傳遞部件，包括預過濾器，該預過濾器具有接收樣品的表面和將樣品傳遞到檢測表面的表面；和在預過濾器的樣品接收表面上有擴散材料。
2. 根據權利要求1所述的傳遞部件，其中所述的擴散材料包括表面活性劑。
3. 根據權利要求1所述的傳遞部件，其中所述的擴散材料包括多孔隋性、疏水性基質。
4. 根據權利要求3所述的傳遞部件，其中所述的擴散材料是以化學方式連接到預過濾器上的。
5. 根據權利要求3所述的傳遞部件，其中所述的擴散材料是以物理方式連接到預過濾器上的。
6. 根據權利要求3所述的傳遞部件，其中所述的擴散材料包括擴散膜，該擴散膜的孔徑和厚度選擇為能夠使流體樣品迅速平面擴散到預過濾器的接收表面，并且所述的預過濾器包括基本為平面的膜，該膜的多孔性和厚度選擇為在對以預定尺寸大的樣品中的顆粒物質進行過濾的同時能夠迅速地將樣品從接收表面轉移到傳遞表面。
7. 根據權利要求3所述的傳遞部件，其中所述的擴散材料包括擴散膜，該擴散膜具有邊緣，并且所述的傳遞部件進一步包括連接到預過濾器邊緣和擴散膜邊緣上，并能夠將擴散膜與預過濾器的樣品接收表面面對面相置的連接器。
8. 根據權利要求7所述的傳遞部件，其中所述的擴散膜的孔徑比預過濾器的孔徑大。
9. 根據權利要求3所述的傳遞部件，其中所述的預過濾器包括孔徑為約0.1～約1.0微米的基本上為平面的膜。
10. 根據權利要求3所述的傳遞部件，其中所述的預過濾器的厚度為約50～約300微米。
11. 根據權利要求1所述的傳遞部件，其中所述的預過濾器包括基本上為平面的纖維素膜。
12. 根據權利要求1所述的傳遞部件，其中所述的樣品傳遞表面是與檢測表面相吻合的。
13. 一種用于確定被分析物的檢測藥盒，包括一種包裝，該包裝含有用于支持檢測反應的檢測表面；和孔徑為約0.1～約1.0微米，并且具有與檢測表面處于面對面位置的傳遞表面的多孔纖維素預過濾器。
14. 一種檢測固相，具有檢測表面，該檢測表面包括帶有能使樣品首先以第一程度加在該區域上，從而發生第一程度的標記試劑的非特異性結合的化學功能團的區域，并能在將樣品以不同于第一程度的第二程度加到該區域時，能夠產生與第一程度相區別的第二程度的標記檢測試劑的非特異性結合。
15. 根據權利要求14所述的檢測固相，其中所述的檢測表面包括載有固定化的被檢測物的結合配體的第二區域。
16. 一種用于確定被分析物的檢測方法，包括在具有能夠發生非特異性結合的區域的檢測表面上加入含有僅能部分封閉該區域的數量的封閉劑的樣品；用包括載有標記物的物質的檢測試劑與該區域相接觸；和通過確定標記物在該區域上的均勻或非均勻的分布來確定樣品加到檢測表面時的均勻性。
17. 根據權利要求16所述的檢測方法，其中所述的能夠發生非特異性結合的區域上不結合有任何被固定化的生物制劑。
18. 一種將流體樣品傳遞到檢測表面的傳遞方法，包括將預過濾器的傳遞表面與檢測表面吻合接觸；在預過濾器的接收表面上形成樣品液體膜；和使所述的樣品液體膜滲透過預過濾器并將檢測表面均勻地潤濕。
19. 一種將樣品傳遞表檢測表面的傳遞部件，包括具有樣品接收表面和將樣品傳遞到檢測表面的傳遞表面的預過濾器，所述的預過濾器的構造和安排是能夠將流體樣品迅速平面擴散到接收表面，并且能夠使樣品滲透過預過濾器從而將樣品由傳遞表面傳遞到檢測表面。
20. 一種采用了傳遞樣品的預過濾器的檢測試劑藥盒，其該進之處包括孔徑為約0.1～約1.0微米的預過濾器。
21. 根據權利要求20所述的檢測試劑藥盒，其中所述的改進之處包括孔徑為約0.2～約0.7微米的預過濾器。
22. 根據權利要求21所述的檢測試劑藥盒，其中所述的改進之處包括孔徑為約0.33～約0.53微米的預過濾器。
23. 根據權利要求22所述的檢測試劑藥盒，其中所述的改進之處包括孔徑為約0.45微米的預過濾器。
24. 一種采用了傳遞樣品的預過濾器的檢測試劑藥盒，其該進之處包括包括一對面對面相置的膜的預過濾器。
25. 一種采用了傳遞樣品的預過濾器的檢測試劑藥盒，其該進之處包括具有樣品接收表面的預過濾器，且其構造和安排是能夠使流體樣品被迅速平面擴散到接收表面上從而使樣品滲透過預過濾器而被傳遞到檢測表面。
全文摘要
一種將樣品過渡并傳遞到檢測表面的傳遞部件，包括具有樣品接收表面和將樣品傳遞到檢測表面的傳遞表面的預過濾器。預過濾器的接收表面上的擴散材料用于將樣品迅速均勻地擴散于預過濾器的接收表面。這樣，樣品就可被迅速均勻地傳遞到檢測表面。一種檢測固相，具有包括載著固定化物和不載固定化物的區域的表面。加入樣品和標記物后，標記物的均勻分布性就指示樣品的均勻分布性。一種包括傳遞部件和檢測表面的藥盒。
文檔編號G01N33/543GK1139982SQ95191473
公開日1997年1月8日 申請日期1995年1月4日 優先權日1994年1月4日
發明者布倫特·L·多維爾, 利力伯斯·K·登漢姆, 亞力山大·M·卡利伯諾夫 申請人:英徹塞爾公司