專利名稱：一種檢測肝炎病毒核心抗原的方法
技術領域：
本發明屬于一種檢測肝炎病毒的方法，尤其是用酶聯免疫微孔板法檢測血清中乙型肝炎病毒核心抗原。
乙型肝炎病毒的顆粒在血液中可分為三種形態，小球形、管形及乙型肝炎病毒氏顆粒，其中乙型肝炎病毒氏顆粒是具有感染性的完整乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒氏顆粒分為核心和外殼兩個部分，其中核心部分具有乙型肝炎病毒核心抗原的抗原性，眾所周知，乙型肝炎病毒核心抗原是在肝細胞核中合成，到胞漿后再裝配上表面抗原而成為完整的乙型肝炎病毒顆粒，再排到血液中，乙型肝炎病毒E抗原，是乙型肝炎病毒核心抗原P19多肽從肝細胞入血后羥基端34個氨基酸解離后，剩下的P15.5即乙型肝炎病毒E抗原，幫在血液中很難檢測到游離的乙型肝炎病毒核心抗原，1976年用免疫粘附血球凝聚法檢測血清中乙型肝炎病毒核心抗原，采用特異的家兔乙型肝炎病毒表面抗體吸附所有的乙型肝炎表面抗原，再以蛋白酶E，α-二巰基乙醇以及中性去污劑來解離蛋白外殼，使乙型肝炎病毒核心抗原釋放出來，由于加入的試劑較多，且血球凝集法的敏感度要比酶聯免疫測定法低很多，現使用受局限，北京醫學院附屬人民醫院，采用抗原抗體復合物的原理，在待檢標本內加入過量的乙型肝炎病毒表面抗體，形成抗原抗體免疫復合物，離心沉淀免疫復合物，再用適量的中性去污劑脫乙型肝炎病毒外殼，用固相放射免疫法檢測血清中乙型肝炎病毒核心抗原，此方法雖然解決了蛋白酶E及α-二巰基乙醇的干擾因素，但此法操作步驟多，時間長，再有放射性同位素在操作上放射防護及放射性廢物處理要比酶聯免疫檢測法麻煩很多。
本發明的目有在于提供一種用酶聯免疫微孔板法簡便、快速、準確地檢測血清中乙型肝炎病毒核心抗原。
本發明的技術方案是將乙型肝炎病毒表面抗體和乙型肝炎病毒核心抗體同時包被聚氯乙烯微孔板，乙型肝炎病毒表面抗體與乙型肝炎病毒氏顆粒表面抗原結合，使得乙型肝炎病毒氏顆粒被吸附在聚氯乙烯微孔板上，然后在微孔中加入中性去污劑，去污劑作用于乙型肝炎病毒殼蛋白，殼蛋白變性，乙型肝炎病毒氏顆粒殼裂解，暴露出乙型肝炎病毒核心抗原，游離的乙型肝炎病毒核心抗原被聚氯乙烯微孔板上的乙型肝炎病毒核心抗體所吸附，再在微孔中加入過氧化物酶標記的乙型肝炎病毒核心抗體過氧化物酶與加入的底物反應，最終達到檢測乙型肝炎病毒核心抗原的目的。用PH9·60·05mol/l硫酸鹽緩沖液配制的乙型肝炎病毒表面抗體，乙型肝炎病毒核心抗體雙抗體包被液，用PH7·4mol/l磷酸鹽緩沖液配制的乙型肝炎病毒核心抗體辣根過氧化物酶結合物，用PH7·40·01mol/l磷酸鹽緩沖液配制的2％-10％的中性去污劑，采用吐溫20的洗滌液，顯色液A為過氧化氫，顯色液B為四甲基聯苯胺，終止液采用2mol/l硫酸。
本以明的特點簡便、快速、準確，為臨床上直接快速地診斷，觀察及篩選乙型肝炎患者提供了更準確的檢測指標。
下面詳述本發明的操作步驟1、取100ul乙型肝炎病毒表面抗體和乙型肝炎病毒核心抗體混合液包被聚氯乙烯微孔板，放置37℃水浴箱水浴兩小時，再放置4℃冰箱二十四小時，從冰箱取出，用洗滌液沖洗五次，洗凈游離的表面抗體、核心抗體，拍干。
2、取100ul陰陽性對照液及待檢血清標本，分別加入聚氯乙烯微孔板中，放置37℃水浴箱中水浴三十分鐘，取出后用洗滌液沖洗五次以洗去血清中的核心抗體，拍干。陰陽性對照為觀察和計算標本結果所用，血清標本中如存在乙型肝炎病毒氏顆粒，小球形和管形乙型肝炎表面抗原顆粒，則與聚氯乙烯微孔板上乙型肝炎病毒表面抗體結合，被吸附在固相的聚氯乙烯微孔板上。
3、取100ul5％中性去污劑和100ul乙型肝炎病毒核心抗體辣根過氧化物酶結合物同時加入微孔板中，放置37℃水浴箱中水浴三十分鐘，取出后用洗滌液沖洗五次以除掉游離的乙型肝炎病毒核心抗體辣根過氧化物酶結合物，拍干。中性去污劑使得乙型肝炎病毒氏顆粒開殼，乙型肝炎病毒核心抗原暴露出來，游離的乙型肝炎表面抗原與聚氯乙烯微孔板上的乙型肝炎病毒核心抗體結合物結合，再與加入的乙型肝炎病毒核心抗體辣根過氧化物酶結合，在微孔板上形成乙型肝炎病毒核心抗體-乙型肝炎病毒核心抗原-乙型肝炎病毒核心抗體辣根過氧化物酶結合物雙抗夾心狀態，在微孔板中進行此反應，避免了操作步驟多而使乙型肝炎病毒核心抗原丟失影響其準確性。
4、加50ul顯色液A，再加50ul顯色液B，放置37℃水浴箱避免水浴十五分鐘，過氧化物在有顯色液A的條件下，使TMB呈藍色反應。
5、加50ul2mol/l硫酸終止反應，H2SO4使過氧化物酶失去活性達到終止反應的目的，最后在450nm波長處比色，記錄每孔中的吸光度值。
結果判定當標本的吸光度值與陰性對照吸光度值之比大于2·1，判斷乙型肝炎病毒核心抗原為陽性，反之，為陰性。
權利要求
1.一種檢測肝炎病毒核心抗原的方法，其特征在于將乙型肝炎病毒表面抗體和乙型肝炎病毒核心抗體同時包被聚氯乙烯微孔板，乙型肝炎病毒表面抗體與乙型肝炎病毒氏顆粒表面抗原結合，使得乙型肝炎病毒氏顆粒被吸附在聚氯乙烯微孔板上，然后在微孔中加入中性去污劑，去污劑作用于乙型肝炎病毒殼蛋白，殼蛋白變性，乙型肝炎病毒氏顆粒殼裂解，暴露出乙型肝炎病毒核心抗原，游離的乙型肝炎病毒核心抗原被聚氯乙烯微孔板上的乙型肝炎病毒核心抗體所吸附，再在微孔中加入過氧化物酶標記的乙型肝炎病毒核心抗體，過氧化物酶與加入的底物反應，最終達到檢測乙型肝炎病毒核心抗原的目的。
全文摘要
本發明屬于一種檢測肝炎病毒的方法，尤其是用酶聯免疫微孔板法檢測血清中乙型肝炎病毒核心抗原，本發明是將乙型肝炎病毒表面抗體和乙型肝炎病毒核心抗體同時包被聚氯乙烯微孔板，乙型肝炎病毒氏顆粒被吸附在微孔板，加入去污劑，乙型肝炎病毒殼蛋白變性，乙型肝炎病毒氏顆粒殼裂解，暴露出乙型肝炎病毒核心抗原，以達到檢測乙型肝炎病毒核心抗原的目的，此法簡便、快速、準確。
文檔編號G01N33/576GK1132857SQ9511791
公開日1996年10月9日 申請日期1995年10月31日 優先權日1995年10月31日
發明者劉毅維 申請人:劉毅維